基因组编辑技术课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因组编辑,应用基因编辑技术不长角的奶牛,基因编辑的定义：,通过精确识别靶细胞,DNA,片段中靶点的核苷酸序列，利用核酸内切酶对,DNA,靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞,DNA,目的基因片段的精确编辑。,基因编辑的优势,与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为根底的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保存了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，本钱更低。,基因编辑原理,现代基因组编辑技术的根本原理是相同的，即借助特异性 DNA 双链断裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组修复(HDR) 两条途径。,第一代,: ZFN(,锌指核酸酶,),第二代,: TALEN(,转录激活样效应因子核酸酶,),第三代,: CRISPR/Cas9(,成簇的规律性间隔的短回文重复序列,),第四代：,NgAgo - gDNA,韩春雨,基因编辑开展史,ZFN,基因组编辑技术,ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白开展起来的。,1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块。,1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。,2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。,ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的开展潜力。,缺点:,(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。,TALEN,基因组编辑技术,2021 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。,TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 Fok融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶标位点, 另一个那么靶向反义链上的靶标位点. 然后 Fok形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为1220 bp.,实验结果说明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。,通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。,目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。,CRISPR /Cas9,基因组编辑技,术,CRISPR/Cas9,系统的发现可以追溯到,1987,年，日本学者首次在大肠杆菌,(E. coli),基因组中发现一连串短的空间间隔重复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的序列。,2002,年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复序列,(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR),，现有测序结果显示,40%,的细菌基因组中含有,CRISPR,位点。,2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/ Cas,是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。,2021年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR转录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crRNA经过加工形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。,2021年，研究者报道了CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对局部基因实现了编辑。,CRISPR/Cas,系统概述,CRISPR/ Cas,系统广泛存在于细菌和古菌中，是它们的一种适应性免疫系统，能够识别自身和外源入侵,DNA,片段。,CRISPR/ Cas,系统有,3,种类型：,型、,型和,型。,型和,型,CRISPR/Cas,系统较为复杂，需要多个,Cas,蛋白形成复合体切割,DNA,双链，而,型,CRISPR/Cas,系统只需要一个,Cas9,蛋白核酸酶来切割,DNA,双链,即为现在广泛应用于遗传学基因编辑的,CRISPR/Cas9,系统。,Type系统中只有一种核酸酶Cas9核酸酶，在该系统中Cas9蛋白与crRNA参与对抗外源噬菌体和质粒的入侵。目前，Type系统在基因组编辑中应用的最为广泛,。,CRISPR-Cas主要由两局部组成：,CRISPR/Cas的结构,CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组成, 重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列space与靶基因进行识别。,识别,切割,CasCRISPR associated：,存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成，其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。,病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌胞浆之中，经过同源重组，CRISPR重复序列转录、翻译出的Cas复合物对外来DNA进行剪切，产生新的spacer序列。如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重复序列局部互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生特异性免疫记忆。,CRISPR/Cas,9,系统的工作原理和,机制,CRISPR/Cas,9,系统的工作原理和,机制,当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时,首先，,tracrRNA,与,pre-crRNA,的重复序列结合；,第二，内源,RN,a,se ,切割,pre-crRNA/ tracrRNAs,复合体，切除,5,末端的间隔序列，形成成熟的,crRNA,，并与,tracrRNA,形成被称为向导,RNA (Single guide RNA, sgRNA),的嵌合,RNA,分子；,第三，每一个成熟的,sgRNA,能够引导,Cas9,蛋白定位到双链,DNA,的靶位点上并在原型间隔毗邻序列,(Proto-spacer adjacent motif, PAM),的上游,38 bp,位置对结合的序列进行切割,(,图,2A),。,Cas9,的特异性靶点,依赖于原型间隔序列,3,端,PAM,序列，不同的,Cas9,突变体在基因组中拥有不同的,PAM,序列，来源于酿脓链球菌,(,Streptococcus pyogenes,),的,Cas9,识别一个,5- NGG-3,的,PAM,，而来源于嗜热链球菌,(,Streptococcus thermophilus,),和脑膜炎奈瑟氏菌,(,Neisseria meningi-tidis,),的,Cas9,分别识别,5-NNAGAAW-3,的,PAM,和,5-NNNNGATT-3,的,PAM,。,Cas9,拥有两个核酸酶结构域,分别是蛋白中间的,HNH,结构域和蛋白氨基酸末端附近的,RuvC-like,结构域，其中,HNH,切割与,crRNA,互补的链，切割位点位于,PAM,序列上游,3 bp,，,RuvC-like,切割非互补链，切割位点位于,PAM,序列上游,38 bp,，从而造成双链的断裂。,Cas9,的特异性靶点和两个核酸酶结构域,CRISPR/ Cas9,产生的,DSB,能够激活细胞和生物体自身修复机制，产生两种不同的修复途径,NHEJ,和,HDR,修复。,NHEJ,能够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读框编码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而,HDR,的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体,DNA,模板存在时对靶位点进行可预测的插入。,1. PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的根本条件。如果靶序列3端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点.,2. sgRNA,与目标基因组相结合的,20nt,序列区决定着,CRISPR/Cas,系统的靶向特异性。,CRISPR/Cas9,系统的关键点,3. sgRNA,的长度也与特异性密切相关。,sgRNA,的,5,端额外增加两个鸟嘌呤核苷酸后能够显著提高,CRISPR/Cas9,系统的特异性。,CRISPR/Cas9,基因编辑系统的特异性决定于,sgRNA,上的识别,(20nt),。然而，在复杂的生物基因组中，,sgRNA,的识别序列可能会与非靶点,DNA,发生局部匹配,(Partial match),。,这种局部匹配，目前可归结为两类：,sgRNA,与脱靶位点,DNA,序列长度相同，但存在碱基错配。,(2),脱靶位点,DNA,序列长度比,sgRNA,多或少几个碱基，通过形成,DNA,凸起,(DNA bulge),或,RNA,凸起,(RNA bulge),来完成其他碱基的正确配对。,CRISPR/Cas9,系统的脱靶效应,CRISPR/Cas9,系统在基因组,DNA,片段编辑中的应用,1. DNA,片段靶向删除,2. DNA,片段靶向反转,3. DNA,片段靶向重复,4. DNA,片段靶向插入,5.,染色体靶向易位,类别,ZFN,TALEN,CRISPR /Cas9,NgAgo-gDNA,构成,ZF ArrayFok1,TALEN ArrayFok1,Cas9,sgRNA,NgAgo-gDNA,靶向元件,ZF Array,蛋白,TALENArray,蛋白,sgRNA,核糖核苷酸,gDNA,脱氧核糖核苷酸,切割元件,Fok,蛋白,Fok,蛋白,Cas9,蛋白,Ago,蛋白,优势,单位点编辑,单位点编辑,多位点编辑,多位点编辑,靶向序列, 18bp,30bp,23bp,20bp,切割类型,双链断裂，单列缺刻,双链断裂，单列缺刻,双链断裂，单列缺刻,双链断裂，单列缺刻,技术难度,困难,较容易,非常容易,非常容易,商业价格,60000,每位点,10000,每位点,1000,每位点,？,脱靶效应,较轻,较轻,较严重,较轻？,编辑技术比照,NgAgo-gDNA编辑,NgAgo-gDNA是格式嗜盐杆菌Natronobactricum grogoryi) ACO蛋白Argonauto的简称，其本质是一种核酸内切酶，NgAgo根据指导DNA的定位，可以有效地对基因组目标区域进行编辑。,NgAgo-gDNA 概述,NgAgo,是格氏嗜盐碱,杆,菌,Natronobacterium,gregoryi,AGO,蛋,白,Argonaute,的,简,称,，,其,本,质,是,一,种,核,酸,内,切,酶,。,NgAgo,酶根据指导,DNA,的定位,，,可以有效地对基因,组目标区域进行编辑,。,NgAgo-gDNA 与 Crispr-Cas9 特点比较,NgAgo-gDNA,Crispr-CAS9,5-P-ssDNA,介导,sgRNA,介导,ssDNA,无特殊二级结构要求，除靶序列一致的碱基无需其它碱基参与,sgRNA,由,tracrRNA,和,crRNA,组成，需求固定的二级结构,结合靶序列,23-25bp,结合靶序列,19-21bp,无需,PAM,区,需要,PAM,区,NgAgo,蛋白 由,887,个氨基酸组成,CAS9,蛋白 由,1368,个氨基酸组成,可在哺乳动物细胞水平进行基因组编辑,可在哺乳动物细胞水平进行基因组编辑,NgAgo-gDNA 的优势,1,.,设计更加灵活,由于NgAgo-gDNA系统无PAM要求，5p ssDNA设计相较sgRNA更加灵活,2,.,理论上精确性会比Crispr-CAS9 高,NgAgo-gDNA识别靶序列的长度会比Crispr-C,as9,长约4个碱基，另外DNA-DNA duplex的特异性比RNA-DNA duplex高,所以理论上精确性会更加高。,3.,对向导序列-靶序列错配容忍度低,脱靶率低,5,.,针对富含GC的靶序列，NgAgo系统比Cas9系统切割效率更高,基因功能研究,基因治疗,构建模式动物,改造和培育新品种,基因编辑新技术的用途,1.,基因功能研究,基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节， 但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、,ES,细胞筛选、 嵌合体动物模型选育等一系列步骤， 成功率受到多方面因素的限制。,基因编辑新技术那么不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具,ZFN,技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草 等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞,(induced pluripotent stem cells,，,iPSC),在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、 斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。,2.,基因治疗,传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因， 但这种方法难以精准控制， 可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位， 在靶位点进行修正或进行基因切除， 到达基因治疗的目的。,Bacman 等人利用 TALEN 技术去除了来自于病人线粒体内的有病 DNA。这是 TALEN 首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。,Li 等人利用 ZFN 技术能在染色体上精确定位的优势， 通过 “剪切 和 “粘贴 基因， 在实验小鼠体内实现了血友病治疗， 防止了传统基因疗法带来的插入诱变风险， 首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。,3.,构建模式动物,基因编辑新技术不受,ES,细胞的限制，效率高，速度快，且定点编辑更加精确，可在多种细胞及生物体的特定位点进行切割和修饰。构建转基因小鼠第一人,Jaenisch,与其同事最近利用,CRISPR- Cas,系统又构建了携带特异性突变的小鼠模型。,4.,改造和培育新品种,传统的改造动植物品种的转基因技术是将外源 DNA 片段插入受体的基因组中，改造基因功能，使其表达优良的性状，获得人类需要的品种。基因编辑技术那么可以进行定点修饰， 到达高效定向。,Shukla,等对玉米进行肌醇磷酸激酶,1(inositol phosphate kinase 1,，,IPK1),基因的修饰，使其对除草剂的耐性增强，在发育的种子中肌醇磷酸盐表达谱也发生了与预期一样的改变。,ownsend,等以烟草中的丙酮醇合酶,(acetolactate synthase),基因,SuR,(SuRA,和,SuRB),位点为靶标，育成了对咪唑啉酮,(imidazolinone),除草剂和对磺脲,(sulphonylurea),除草剂都有抵抗力的新品种。,基因编辑技术的展望,随着越来越多物种基因组测序的完成，基因功能的研究成为后基因时代的重点。基因编辑技术既可以用正常基因替代突变基因进行性状改进和基因治疗，也可以用突变基因代替正常基因进行基因功能的研究。,基因组编辑技术对应的友好位点的选择，多基因连接策略，表达调控策略等配套的技术体系正在形成，为今后大规模，多基因的动物改进奠定了根底。更多基因组编辑畜禽的出现会给畜牧业经济，人类营养水平和生活质量带来革命性地影响。可以预见，以基因组编辑技术为核心的现代生物技术产业将进入黄金时期。,谢谢,