蛋白质芯片技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,蛋白质芯片技术,1,蛋白质芯片技术1,目 录,一,蛋白质芯片技术产生的背景,二,蛋白质芯片的概念,三,蛋白质芯片的主要特点,四,蛋白质芯片的分类,五,蛋白质芯片技术的简要操作步骤,六,蛋白质芯片的应用,2,目 录一 蛋白质芯片技术产生的背景2,一 蛋白质芯片技术产生的背景,随着人类和其他生物的全基因组序列的完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗传信息的载体，而生命活动的执行者、表观性状的体现者则由基因编码的产物,蛋白质所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均发 生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质参与，所有的外在表现均由种类繁多的,蛋白质,所决定。,3,一 蛋白质芯片技术产生的背景 随着人类和其他生物的全基,随着分子生物学技术的发展，生物芯片技术研究工作不断深入，,DNA,芯片技术被逐渐用于对生物样品中核酸序列表达的检测和比较研究。,随着,DNA,芯片技术的不断成熟，以及基因研究所取得的令人瞩目的成果，进一步推动,蛋白质功能的研究及相关技术的发展,，,蛋白质芯片技术因此应运而生,。,4,随着分子生物学技术的发展，生物芯片技术研究工作不断深入，DN,二 蛋白质芯片的概念,蛋白质芯片,是将各种微量纯化的蛋白质阵列在一种高密度的固相载体上，并与待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法。,5,二 蛋白质芯片的概念蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白质阵列在,三 蛋白质芯片的主要特点,1.,高通量,2.,灵敏度较高,3.,重复性好,4.,操作自动化,6,三 蛋白质芯片的主要特点1.高通量6,四 蛋白质芯片的分类,按蛋白质性质分类,1.,无活性芯片：,将已经合成好的蛋白质以高密度阵列点样在芯片上，进行杂交反应。,2.,有活性芯片：,把生物体直接点在芯片上，并原位表达蛋白质。,按形式分类,1.,玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建）,2.3-D,胶芯片（在多孔凝胶垫上构建）,3.,微孔芯片（在微孔板上构建）,7,四 蛋白质芯片的分类按蛋白质性质分类7,不同种类的蛋白质芯片的特点,类别,特点,玻璃表面构建的蛋白质芯片,可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；,很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便宜；容量较小；容易发生交叉污染,多孔微胶垫上构建的蛋白质芯片,可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；不易蒸发；可以用于多步反应，,但是有其较固定的缓冲条件；造价昂贵；,容量较大；不易发生交叉污染,微孔板上构建的蛋白质芯片,可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容量较大；不易发生交叉污染,8,不同种类的蛋白质芯片的特点类别特点玻璃表面构建的蛋白质芯片,五 蛋白质芯片技术的简介,操作步骤,提出生物学问题,（实验目的）,样品预处理,（,重组蛋白，制备一、二级抗体，,荧光标记，配蛋白印记缓冲液）,生化反应,化学偶合，加底物，,反应温度和时间，,冲洗条件,检测,（荧光和比色扫描或拍照，,参数设置）,数据分析和建模,（,图象量化，标准化，,采集蛋白信息，建立模型）,3,蛋白质芯片制备,6,1,9,五 蛋白质芯片技术的简介操作步骤提出生物学问题样品预处理生化,（一）蛋白质芯片的制备,一 固相载体及其处理,载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）,二 蛋白质的预处理,选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解,三 点制微阵列,可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等,四 固定微阵列上的蛋白样点,膜为载体：芯片放入湿盒,37C 1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白,五 微阵列的封闭,主要封闭试剂：BSA,10,（一）蛋白质芯片的制备一 固相载体及其处理载体（滴定板、滤,（二）抗原抗体的固化,1,化学性固定,化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等,2,生物性固定,生物性配基包括受体、配体、酶、抗体-抗原等,11,（二）抗原抗体的固化1 化学性固定11,（三）捕获分子,1,抗体,由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰度及确定新的蛋白质。,2,寡聚核苷酸,适配体,即寡聚核苷酸 能够作为捕获分子用于连接蛋白质，并且有很高的特异性和亲和力。,3,肽样寡聚体,鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。,12,（三）捕获分子1 抗体12,4,小分子配体,制备捕获分子最为有效的方式,小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行,5,重组蛋白,纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质-小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。,13,4 小分子配体13,（四）微阵列设计与制备,1,人工制备芯片,主要有两种,即手工点样和免疫打点印迹装置。,存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片、样品和捕获分子消耗大和敏感性较低,2 微阵列制备仪,主要有,直接接触式和非接触式两种类型,也是目前市场上常用的两种方法,14,（四）微阵列设计与制备1 人工制备芯片14,（五）抗原或抗体的标记,1,酶标记,常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP) 、碱性磷酸酶(AP)等.,2,荧光物标记,荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、丹磺酰氯、罗丹明-异硫氰酯等。,15,（五）抗原或抗体的标记1 酶标记15,（六）蛋白质芯片检测方法,1,以质谱技术为基础的直接检测法,如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术 (SELDI-TOF-MS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化,在电场力的作用下飞行,通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比,用以分析蛋白质的分子量和相对含量。,2,蛋白质标记法,常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图像,即可以获得有关生物信息。,16,（六）蛋白质芯片检测方法1 以质谱技术为基础的直接检测法16,六 蛋白质芯片的应用,1,用于蛋白质,-,蛋白质、蛋白质,-,核酸、蛋白质,-,脂类等相互作用研究；特异性蛋白质的筛选；功能蛋白质组研究。,例如，应用酵母蛋白质芯片进行钙调蛋白的研究；应用磷脂酰肌醇来筛选磷脂酰肌醇的结合蛋白。,17,六 蛋白质芯片的应用1 用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、蛋,2,疾病诊断的研究。,目前，临床上应用的蛋白质芯片主要是用于检测肿瘤标志物的蛋白质芯片。它的应用范围主要在以下几个方面：,（,1,）,用于肿瘤患者的辅助诊断、疗效判断、病情监测、预后评估及判断肿瘤有无复发和转移等。,（,2,）,用于肿瘤高危人群的定期筛查。高危人群主要是指,45,岁以上的人群、患各种慢性炎症和各种慢性疾病的患者、有肿瘤家族史和肿瘤高发区居民等。,（,3,）,用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生物学研究,。,18,2 疾病诊断的研究。目前，临床上应用的蛋白质芯片主要是用于检,3,抗体筛查,。,例如，,对噬菌体抗体库一次可对,上万,个不同的抗体克隆进行检测。,4,药物筛选、药代动力学研究。,5,在毒理学中的应用。,6,环境监测,。,7,食品卫生安全的监测。,19,3 抗体筛查。例如，对噬菌体抗体库一次可对上万个不同的抗体克,谢谢观赏,20,谢谢观赏20,