酶联免疫吸附试验 ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,免疫标记技术,定义：,将抗原,-,抗体反应与标记技术相结合，用,放射性同位素、酶或荧光素,标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。,分类：,放射免疫测定法：,131,I,，,32,P,免疫荧光技术：,FITC,，,PE,免疫酶测定法：,HRP,，,AP,免疫标记技术定义：,1,免疫酶测定法,(,E,nzyme,I,mmuno,A,ssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。,辣根过氧化物酶,(HRP),，碱性磷酸酶,(AP),特点：,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，,pg,水平微量检测,定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,分类：,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA,2,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.,定义,2.,分类,间接法（,Indirect ELISA,）：,将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗,检测液相中未知抗体,双抗体夹心法（,Sandwich ELISA),：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,检测液相中的可溶性抗原,竞争法（,Competitive ELISA),：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,检测液相中的可溶性抗原或抗体,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immuno,3,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),3.,原理,（以间接性,ELISA,为例）,：,显色,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immuno,4,实验内容：,间接法测定溶血素,定性检测,实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测,5,实验材料,脱纤维绵羊红细胞,抗原,兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）,待测兔血清,HRP,标记羊抗兔,IgG,二抗,包被缓冲液：,0.05M pH9.6,碳酸盐缓冲液,洗涤液：含,0.05% Tween 20,的,0.01M pH7.4 PBS,底物缓冲液：,pH5.0,磷酸盐柠檬酸缓冲液,底物溶液：,OPD 10mg,，底物缓冲液,25ml,，,30% H,2,O,2,40L,酶标板，酶标仪,实验材料脱纤维绵羊红细胞 抗原,6,实验方法,1.,抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加,3mL N.S,，混匀,2000rpm,，,5min,加,3mL N.S,，混匀,2000rpm,，,5min,取,2mL,压积红细胞,加入,2mL,蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成,1,：,400,备用,2.,包被抗原：,取酶标板，加入,100L/,孔的抗原稀释液,4,，湿盒内，,18h,实验方法1.抗原的处理：脱纤维绵羊血加3mL N.S，混匀2,7,取出包被好抗原的酶标板（,4,孔,/,组），甩干孔内液体,以洗涤液（,200L/,孔）洗涤,3,次，,3min/,次,3.,加待测血清,标记各孔，加入相应液体,100L/,孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.,加二抗：,37,，湿盒内，,30min,甩干孔内液体,以洗涤液（,200L/,孔）洗涤,3,次，,3min/,次,各孔加入酶标二抗,100L/,孔,37,，湿盒内，,30min,5.,显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（,200L/,孔）洗涤,3,次，,3min/,次,加入底物溶液,100L/,孔,避光显色，,10min,6.,观察结果,实验方法,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（2,8,预期结果,阳性：显色为黄色,阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,预期结果阳性：显色为黄色1 2 3 4,9,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。,按顺序加样，孔底无气泡。,包被和温育在湿盒内进行。,注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。,10,2.,补体结合反应,（,Complement fixation Test, CFT,）,2.补体结合反应（Complement fixation,11,免疫荧光技术：FITC，PE,05% Tween 20的0.,SRBC+抗SRBC抗体,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L,实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清,37，湿盒内，30min,按顺序加样，孔底无气泡。,底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L,包被和温育在湿盒内进行。,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),脱纤维绵羊红细胞 抗原,实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测,底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L,指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,概念：,补体结合反应：,是指在,补体,的参与下，以绵羊红细胞（,SRBC,）和溶血素（抗,SRBC,的抗体）作为,指示系统,的,抗原抗体反应,。,免疫荧光技术：FITC，PE概念： 补体结合反应：,12,补反中包括,两个系统,五种成分：,待检系统：已知,Ag,或,Ab,、待检,Ab,或,Ag,及仅供一组,Ag-Ab,系统反应的定量补体。,指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,补反中包括两个系统五种成分：原理：,13,待测系统,抗原,+,未知血清,1,2,补体,1,2,Step 1,抗原抗体复合物的形成,Step 2,补体的结合和耗竭,指示系统,SRBC+,抗,SRBC,抗体,Step 3,SRBC,的裂解,1,2,1,：,No Ab,；,2,：,Ab,待测系统1 2补体12Step 1 Step 2指示系统S,14,Ag,Y,待测血清,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Ab,阳性,No Ab,阴性,Ag,Ag,Ag,AgY待测血清 YYYYYYYYAbNo AbAgAgAg,15,抗原：伤寒菌裂解产物,待测血清：,56,，,30min,补体：豚鼠血清,2%,绵羊红细胞,溶血素,材料：,抗原：伤寒菌裂解产物材料：,16,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清,对照管,抗原,对照管,补体,对照管,SRBC,对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，,37,，水浴,15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀，,37,，水浴,15min,（,1,份,/2,人）,方法：12345试验管血清抗原补体SRBC待测血清0.2mL,17,预期结果：,1,管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC,对照管,？,溶血,溶血,溶血,不溶血,预期结果：1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红,18,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。注意事项：,19,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),3.,原理,（以间接性,ELISA,为例）,：,显色,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immuno,20,补反中包括,两个系统,五种成分：,待检系统：已知,Ag,或,Ab,、待检,Ab,或,Ag,及仅供一组,Ag-Ab,系统反应的定量补体。,指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,补反中包括两个系统五种成分：原理：,21,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,2000rpm，5min,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,底物缓冲液： pH5.,各孔加入酶标二抗100L/孔,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,脱纤维绵羊红细胞 抗原,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,用包被缓冲液稀释成1：400备用,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,包被和温育在湿盒内进行。,脱纤维绵羊红细胞 抗原,双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,竞争法（Competitive ELISA) ：,底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,按顺序加样，孔底无气泡。,按顺序加样，孔底无气泡。,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,标记各孔，加入相应液体100L/孔,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),05% Tween 20的0.,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,用包被缓冲液稀释成1：400备用,酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L,按顺序加样，孔底无气泡。,脱纤维绵羊红细胞 抗原,双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清,包被和温育在湿盒内进行。,免疫荧光技术：FITC，PE,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,05% Tween 20的0.,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,间接法（Indirect ELISA）：,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,免疫荧光技术：FITC，PE,05% Tween 20的0.,检测液相中的可溶性抗原,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,免疫酶测定法：HRP，AP,SRBC+抗SRBC抗体,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,05% Tween 20的0.,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：,包被和温育在湿盒内进行。,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,检测液相中的可溶性抗原,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。,05% Tween 20的0.,实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测,酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,检测液相中的可溶性抗原,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,间接法（Indirect ELISA）：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。,是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清,底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L,05% Tween 20的0.,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,05% Tween 20的0.,双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),原理（以间接性ELISA为例）：,SRBC+抗SRBC抗体,标记各孔，加入相应液体100L/孔,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。,洗涤彻底，避免交叉污染。,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,待测系统,抗原,+,未知血清,1,2,补体,1,2,Step 1,抗原抗体复合物的形成,Step 2,补体的结合和耗竭,指示系统,SRBC+,抗,SRBC,抗体,Step 3,SRBC,的裂解,1,2,1,：,No Ab,；,2,：,Ab,待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab,22,