灭活剂保护剂和免疫佐剂ppt课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,甲醛溶液：,规程,（,2000,）中的,26,种灭活疫苗,灭活机理：,灭活浓度：多数为,0.1,0.3,灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的；,必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。,氨基 甲基胺,羧基 亚甲基二醇单酯,巯基 亚甲基二醇,甲醛,醛基,羟基 羟基甲酚,甲醛溶液： 氨基 甲基胺 羧基,1,烷化剂（,alkylating agent,）,乙酰基乙烯亚胺（,AEI),、二乙烯亚胺,(BEI),、缩水甘油醛,灭活机制：,1.,烷化,DNA,分子中的,鸟嘌呤或腺嘌呤,等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变,DNA,的结构而破坏其功能，,妨碍,RNA,的合成，,从而抑制细胞的有丝分裂。,2.,与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。,优点：,能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而,不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。,烷化剂（alkylating agent）,2,1,、乙酰基乙烯亚胺（,N-acetyl ethylenimine,，,AEI,）,淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。,0,4,可保存,1,年，在,-20,可保存,2,年,AEI,功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。,口蹄疫病毒液,:,终浓度,0.05,，,30,8h,加,2,硫代硫酸钠阻断,2,、二乙烯亚胺（,binary ethylenimine,，,BEI,）,市购商品为,0.2,的,BEI,溶液，在,0,4,可保存,1,个月,;,终浓度,0.02%,加入,2,硫代硫酸钠中断灭活。,1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimin,3,3,、缩水甘油醛（,glycidaldchyde,，,GDA,）,大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。,本品易挥发，水溶液含量为,15,31mg/ml,。,0,4,3,个月含量渐下降，约半年失效；,20,只能保存,10d,。,4,、,-,丙酰内酯（,propiolactone,）又名羟基丙酸,-,-,内酯,无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中,5,保存,水中溶解度,37,，能与丙酮、醚和氯仿任意混合,对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。,病毒灭活后，能保持良好的免疫原性,主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。,3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）,4,三、影响灭活作用的因素,1,、灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛最常用。,2,、微生物种类和特性,3,、灭活剂浓度（一定要适合）,4,、灭活温度（具体不同病原体或毒素，其灭活时间和温度不一致）,5,、灭活时间,6,、灭活,PH,值,7,、有机物存在,三、影响灭活作用的因素,5,第二节 保护剂（稳定剂）,保护剂：,又称稳定剂,（,stabilizer,）,，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。（指对疫苗生产、血清制备等）,保护剂用途,（,不同用途加不同保护剂,主要针对活的微生物或细胞,）, 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂, 细胞株保存：常用,二甲基亚砜,(,DMSO),DMSO:,二甲基亚砜，一种细胞的保护剂, 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳（或二甲基亚,砜）和蔗糖等（不同国家有不同配方）, 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖,第二节 保护剂（稳,6,保护剂,（,protector,）的分类,分类：,（,根据其作用机理）,渗透剂：如二甲基亚砜（,DMSO,）、甘油和蔗糖等,非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮,(PVP),和蛋白质等,（根据其分子量大小）,高分子物质、低分子物质。,（按其化学性质）,复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物,保护剂（protector）的分类分类：,7,复合物 脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白胨、糊精、血清、甲基纤维素等,糖类 蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖等,盐类 乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、醋酸铵、硫代硫酸钠等,醇类 山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等,酸类 柠檬酸、酒石酸、氨基酸等,聚合物 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮,(PVP),等,一些常用的冷冻干燥保护剂,分 类 保 护 剂,一些常用的冷冻干燥保护剂 分 类,8,疫苗冻干保护剂组成,1.,营养液：,可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；,可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，,增加溶解度,2.,赋形剂：,防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响,使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度,3.,抗氧化剂：,抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存,期间的稳定性，如维生素,C,、维生素,E,和硫代硫酸钠等。,疫苗冻干保,9,防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生,物活性物质的损伤；, 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保,持细胞的活力；, 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复,苏和迅速修复自身。,冻干保护剂作用机制, 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 冻,10,二、影响保护剂效能的因素,1,、保护剂种类,:,根据微生物种类或者用途来添加不同种 类保护剂。,、保护剂浓度：严格按照配方执行。,、保护剂配制方法：糖类不能用,121,高压灭菌处理。,、保护剂酸碱度（,PH,值）：主要对,M,的影响。,二、影响保护剂效能的因素,11,佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。,3核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG,可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。,5mgm1死结核杆菌即为FCA。,是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。,苗组成 的油包水乳化佐剂（三种成分俱全成为弗,油水乳剂佐剂,IL-12诱导产生的Th1应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗佐剂。,2.,对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。,蜂胶（4以下贮存） 粉碎过筛 按1：4（W/V）加95乙醇 室温浸泡2448h 冷却 过滤或离心取上清 透明栗色纯净蜂胶浸液 4以下保存备用 除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。,保护剂：又称稳定剂（stabilizer） ，是指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。,（二）大肠杆菌不耐热毒素（LT）,1、细胞因子类佐剂（相当于胸腺肽、干扰素等因子作用）,烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。,用前加水稀释至100万毫升，温度约为80，盛装在一个缸内,2的BEI溶液，在04可保存1个月;,5脂质体佐剂（liposomes）。,1.,三、常用的冻干保护剂（稳定剂）,明确不同种类微生物需要添加不同保护剂,（一）细菌的保护剂, 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、,1.5,明胶；, 厌氧性细菌：含,1.5,谷氨酸钠的乳糖或,10,脱,脂乳或,7.5,葡糖血清。,注：脱脂乳：,20,脱脂奶粉溶于水配制而成。,（二）病毒的保护剂,5%,蔗糖 脱脂乳；, 马立克,814,活细胞疫苗,:,保存液氮,.,稳定剂为,10%,二,甲基亚砜和,50%,犊牛血清的,199,液。,注意,:,微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有,不同的配方。,佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分,12,1,5%,蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂,蔗糖（或乳糖）,5g,，加脱脂乳至,100ml,，充分溶解后，,110116,高压灭菌,3040 min,。,2,明胶蔗糖保护剂,明胶,2%3%,（,g/m1,）、蔗糖,5%,（,g/m1,）、硫脲,1%2%,（,g/m1,）。先将,12%18%,明胶液、,30%,蔗糖液和,6%12%,硫脲液加热溶解，,116,高压灭菌,3040min,；,3,SPGA,保护剂,兽医生物制品常用的保护剂,蔗糖,76.62g,、磷酸二氢钾,0.52g,、磷酸氢二钾,1.64g,、谷氨酸钠,0.83g,、牛血清白蛋白,10g,、加去离子水至,1000ml,，混合溶解，过滤除菌。,15%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂 兽医生物制品常用的保护剂,13,第三节 免疫佐剂,一、佐剂概念与作用机理,1.,佐剂（新概念）,：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。,佐剂（旧概念）,：,当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，,能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答,发挥其辅佐作用的物质,.,以前作为佐剂使用时没有免疫原性，但现在有所改变，如,IL-2,是佐剂和,IL-8,一类细胞因子佐剂却不一样,具有免疫调节和免疫增强作用,单独使用时却具有免疫原性。,注意,:,佐剂和免疫增强剂的关系,?,有时佐剂也是免疫增强剂,.,第三节 免疫佐剂一、佐剂概念与作用机理,14,作用特点：,明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生,特异性免疫应答。, 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足,够的免疫应答。,作用特点：,15,免疫佐剂作用机理,改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原；, 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性；, 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，,并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与,T,细胞，,T,细胞与,B,细胞）。,作用方式,免疫佐剂作用机理 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞,16,抗原递呈（,antigen presentation,）, 抗原寻的（,antigen targeting,）, 免疫调节（,immune modulation,）,作用机理, 抗原递呈（antigen presentation）,17,抗原递呈：,指抗原分子递呈给,T,细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被,MHC,分子特异性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。,抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使,18,抗原寻的（,antigen targeting,）,指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞受体的结合等有重要作用。,抗原寻的（antigen targeting）,19,免疫调节（,immune modulation,）,是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。通过这种机制，可以改变特异性免疫应答的本质或强度。,T,细胞有,Th1,和,Th2,两个亚类。同一抗原和不同佐剂一起使用能够引起不同的免疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂，可以达到诱导正确的免疫应答的目的。,免疫调节（immune modulation） 是指任何,20,1.,按佐剂物理性质,颗粒型佐剂,非颗粒型佐剂,2.,按佐剂的生物学性质（即,Ballanti,分类法）,微生物及其组分,非微生物物质,3.,按佐剂在体内存留的时间,贮存型佐剂（,depot type adjuvant,）,非贮存型（,non-depot type adjuvant,）,佐剂的分类,1. 按佐剂物理性质佐剂的分类,21,（一）颗粒性佐剂,1,盐类佐剂,氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。,2,油水乳剂佐剂,弗氏完全佐剂（,Freunds complete adjuvant, FCA,）、弗,氏不完全佐剂（,FIA,）和矿物油白油佐剂。,3,免疫刺激复合物佐剂（,ISCOM,）,4,蜂胶佐剂（,propolis,）,5,脂质体佐剂（,liposomes,）。,6,其他：,MF59,佐剂、微囊化佐剂（,micro-encapsulation),、,硬脂酰酪氨酸佐剂和,菊粉,等。,（一）颗粒性佐剂,22,0ml白油，观察60d，,使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度,B区具有主要免疫学作用，内含5种独立的非共价连接的B亚单,该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（cytokine network）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。,可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，,羟基 羟基甲酚,糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。,2、CpG DNA:是含有非甲基化CpG基序的脱氧核糖核酸DNA，能诱生强烈的免疫应答反应。,复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物,规程（2000）中的26种灭活疫苗,国内外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4,5脂质体佐剂（liposomes）。,水相：抗原液加24%吐温-80,1，继续熟化3min，稳定pH 6.,可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。,1、保护剂种类: 根据微生物种类或者用途来添加不同种 类保护剂。,与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。,可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。,是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF）和天然杀伤细胞刺激因子（NKSF）。,（1）CpG ODN对蛋白质抗原的作用,（二）非颗粒性佐剂,1,肽类佐剂（,peptides,）：胞壁酰二肽（,MDP,）及其衍生物、,去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。,2,表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（,TDM,）,3,核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、,CpG,4,含硫复合物类佐剂：左旋咪唑,5,碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、,DEAE-,葡聚糖,6,细胞因子类佐剂（,cytokine,）：,IL-2,、,IL-4,和,-IFN,等。,7,脂质分子类佐剂：脂多糖、,Vit A,和,Vit E,等脂溶性维生素,8,其他：霍乱毒素（,CT,）、百日咳毒素（,PT,）和破伤风类,毒素（,TT,）等；脂磷壁酸（,LTA,）；维生素,B,12,等。,0ml白油，观察60d，（二）非颗粒性佐剂,23,合成方法,:,（,1,）用铝粉加烧碱合成法,2Al(OH),3,+12H,2,O+3H,2,SO,4,Al,2,(SO,4,),3,18H,2,O,A1,2,(SO,4,),3,18H,2,O+6NaOH2Al(OH),3,+2Na,2,SO,4,+18H,2,O,（,2,）用明矾加碳酸钠合成法,2 KAl(SO,4,),2,+3 Na,2,CO,3,+3H,2,O,2Al(OH),3,+3Na,2,SO,4,+3CO,2,（,3,）用三氯化铝与氢氧化钠合成,A1C1,3,+3NaOH,Al(OH),3,+3NaCl,氢氧化铝胶,(,铝胶）,合成方法: 氢氧化铝胶 (铝胶）,24,用铝粉加烧碱合成法：,2Al(OH),3,+12H,2,O+3H,2,SO,4,Al,2,(SO,4,),3,18H,2,O,A1,2,(SO,4,),3,18H,2,O+6NaOH2Al(OH),3,+2Na,2,SO,4,+18H,2,O,用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收存于容器内，可约得,600kg,铝胶。,取氢氧化铝干粉,50,55kg,，加入,6,万毫升沸水中，搅拌均匀,;,倒入硫酸,100kg,，爆沸至棕褐色，经,30,60min,后，加温水，边加边搅拌约至总量为,35,万毫升；用前加水稀释至,100,万毫升,，温度约为,80,，盛装在一个缸内,另一缸盛,80kg,烧碱，加水至,100,万毫升，,加温至,75,两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化,10min,，调节,pH 6.9,土,0.1,，继续熟化,3min,，稳定,pH 6.9,土,0.1,静置沉淀，弃上清后加入约,5,倍量软化水，搅拌洗涤、弃上清，如此,3,5,次，检查至硫酸盐合格为止。,用铝粉加烧碱合成法：用铜纱筛滤过，用布袋脱水过夜，收,25,氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。, 氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要,掌握好化合时的,pH,值。, 贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，严密封盖，贮放期,不超过,3,个月。, 铝胶室温保存，以免破坏胶态。,注意事项, 氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。注意事,26,是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。,该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。,油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。,一种好的乳剂疫苗应是油包水（,W/O,）或水包油（,O/W,）型，粘度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。,“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为,分散相（内相）,，承受分散相的液体称,连续相（外相）,，两相间的界面活性物质称为乳化剂。,油乳佐剂,是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。 油乳,27,乳化剂,天然乳化剂：阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳,人工合成乳化剂,离子型,阴离子类乳化剂：十二烷基磺酸钠和,硬脂酸铝,阳离子类乳化剂：氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基,非离子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂、,司本,-80,、吐温,-80,乳化剂,28,白油佐剂,国内外常用白油,：,Drakocel-6VR,、,Marcol-52,和,Lipolul-4,7,号或,10,号白油,质量标准,:,无色无味,50,运动粘度,7m,2,s,左右,紫外吸收,A250-350,0.1,，紫外消光系数,1210,8,；,单环芳烃与双环芳烃含量低于,0.5,，无多环芳烃；,小鼠腹腔注射,0.5ml,或家免皮下注射,2.0ml,白油，观察,60d,，,表现正常。,白油佐剂,29,乳剂配方与乳化方法,（,1,）剂在水中法：,将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成,O/W,乳剂。若欲得,W/O,型，可继续加入油，直到发生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。,（,2,）剂在油中法：,将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得,O/W,，如水相直接加入油相，得到,W/O,型，如欲得,O/W,，继续加入至变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在,0.5m,左右，比较稳定。,乳剂配方与乳化方法,30,免疫实验动物用的佐剂配制,:,(1),弗氏佐剂：矿物油,75%85,，乳化剂,15,25%,，混合后经除菌过滤而成为,FIA,；如向其中加入,0.5mg,m1,死结核杆菌即为,FCA,。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。,(2),白油佐剂：,9,份油和,1,份司本,-80,混合后加,2,吐温,-80,和,1,2%,硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与抗原水相,1,：,1,混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。,免疫实验动物用的佐剂配制:,31,大量生产乳剂疫苗,:,油相,:,94,白油、,6,司本,-80,、,1%2,硬脂酸铝，灭菌即可；,水相：抗原液加,2,4%,吐温,-80,乳化：将油相与水相,按,3,：,12,：,1,比例配,制，先缓速混合，再,通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。,或者将粘稠的,W/O,乳剂疫苗，再加,2,吐温,-80,生理盐,水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。,大量生产乳剂疫苗:,32,油乳剂检验,（,1,）粘度测定：流出法、,Saybolt,粘度计法。,吸管内口直径为,1.2mm,，室温下吸满,lml,乳剂，垂直放出,0.4ml,所需时间作为粘度单位。,以,2-6 S,为合格，不得多于,10-15 S,。,（,2,）乳剂稳定性测定：, 加速老化法：疫苗于,37,贮存,10-30d,不破乳。, 离心加速分层法：,3000rpm,离心,15min,不分层，相当于保存,1,年以上不破乳。,油乳剂检验,33,蜂胶佐剂（,Propolis,）,是一种优良的天然药物,供免疫佐剂用的蜂胶外观应具备其固有的特征,具有广泛的生物活性和药理作用（,抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎）,具有免疫增强作用：,能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的,产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。,蜂胶佐剂（ Propolis） 是一种优良的天然药物,34,（,1,）蜂胶的处理：,蜂胶（,4,以下贮存） 粉碎过筛 按,1,：,4,（,W/V,）加,95,乙醇 室温浸泡,24,48h,冷却 过滤或离心取上清 透明栗色纯净蜂胶浸液,4,以下保存备用 除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。,（,2,）蜂胶佐剂疫苗的制备：,灭活菌液或病毒液，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶,10mg,，边加边摇荡，成为乳浊状，即可。,蜂胶佐剂疫苗制备方法：,（1）蜂胶的处理：蜂胶佐剂疫苗制备方法：,35,细胞因子类免疫佐剂,（,cytokine,）,细胞因子的概念,是机体的各种细胞在其生命周期中所释放的具有不同生物学效应的物质，是免疫细胞间相互作用的调节信号。该类物质相互诱生，相互影响，构成一个巨大的细胞因子网络（,cytokine network,）系统，各种细胞借助自己所释放的细胞因子完成各自的功能，在免疫应答中发挥作用。,细胞因子类免疫佐剂 （cytokine） 细胞因子的,36,主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。,破伤风类毒素（TT）,该制品系用鸡新城疫病毒诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装等工艺制成。,CTB流感病毒HA；,1.,国内外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4,5mgm1死结核杆菌即为FCA。,ISCOM能有效地通过粘膜给药，从而可以用于抗呼吸道感染。,单环芳烃与双环芳烃含量低于0.,7脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素,目前IFN-与抗原杂合的融合分子的研究是个热点，期待其成为一个有效的佐剂。,7号或10号白油,1、细胞因子类佐剂（相当于胸腺肽、干扰素等因子作用）,3通过基因重组，构建新型基因工程疫苗,苗组成 的油包水乳化佐剂（三种成分俱全成为弗,、保护剂浓度：严格按照配方执行。,乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水甘油醛,佐剂 微生物及代谢产物佐剂,一、佐剂概念与作用机理,细胞因子类免疫佐剂,（,cytokine,）,细胞因子的分类（,根据生物活性）,1.,经典的细胞因子：淋巴毒素（,LT,）、肿瘤坏死因子（,TNF,）,干扰素（,INF,）,2.,对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子：,白细胞介素（,IL,）和集落刺激因子（,CSF,）,主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。细胞因子类免疫佐剂 （cyto,37,灭活剂保护剂和免疫佐剂ppt课件,38,灭活剂保护剂和免疫佐剂ppt课件,39,1,多效性：,免疫调节作用的多样性,作用方式的非特异性：不表现抗原特异性,2,靶细胞的多样性：构成机体细胞,细胞调节网络,3,多源性：,4,高效性：有免疫激素（,immune hormone,）之称,5,快速反应性：即对激发因素的迅速反应,细胞因子的作用特点,1多效性：细胞因子的作用特点,40,多样性,Pleiotropism,交叉性,Redundancy,协同性,Synergy,对抗性,Antagonism,多样性,41,1,作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果,2,作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染,3,通过基因重组，构建新型基因工程疫苗,IL-2-AIV-HA,重组痘病毒,细胞因子的应用,1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果细胞因子的应用,42,几种重要的细胞因子,白细胞介素,-2,（,IL-2,）,白细胞介素,-4,（,IL-4,）,白细胞介素,-12,（,IL-12,）, -,干扰素（,IFN-,）,几种重要的细胞因子 白细胞介素-2（IL-2）,43,刺激物为抗原或促有丝分裂原,（,ConA,）；,T,细胞分泌； 无抗原特异性,糖蛋白，含,133aa,，,分子量,15-35kDa,；,70,30min,及,pH,值,2-9,范围内稳定,IL-2,刺激物为抗原或促有丝分裂原（ConA）； T细胞分泌； 无,44,刺激物：抗原或丝裂原；由,Th,细胞产生,分子量,15,20kDa,，有,2,3,个糖基化部位，,140,个氨基酸,一种强有力的佐剂候选因子,IL-4,刺激物：抗原或丝裂原；由Th细胞产生IL-4,45,是目前发现的唯一主要由,B,细胞产生的细胞因子，与,IL-2,有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（,CLMF,）和天然杀伤细胞刺激因子（,NKSF,）。,糖蛋白，分子量,75kDa,，由,40kDa,（,P40,）和,35kDa,（,P35,）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。,IL-12,活性高于,IL-2,和,IFN,，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。,IL-12,诱导产生的,Th1,应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗佐剂。,IL-12,是目前发现的唯一主要由B细胞产生的细胞因子，与IL-2有协,46,2.,1.,7号或10号白油,1，继续熟化3min，稳定pH 6.,明确不同种类微生物需要添加不同保护剂,主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。,蜂胶佐剂疫苗制备方法：,新型免疫佐剂 脂质体佐剂（Liposomes）,直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，分泌IL-12、INF-r等Thl样为主的细胞因子，并刺激MHCII、B7-1、B7-2的表达。,佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质称为佐剂。,使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度,并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，,由A和B两个区构成的蛋白,难，但在实验中应用广。,CpG DNA，CpG OND, 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖,能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的,是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。,病毒灭活后，能保持良好的免疫原性,2CpG OND免疫刺激作用具有物种和细胞特异性,高分子物质、低分子物质。,两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH 6.,由致敏,T,细胞在活的或灭活的病毒等干扰素诱生剂和某些细胞因子作用下所产生；,糖蛋白，分子量,20,25kDa,，由,144,个氨基酸组成。,有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和免疫佐剂等免疫生物学活性。,目前,IFN-,与抗原杂合的融合分子的研究是个热点，期待其成为一个有效的佐剂,。,IFN-,2. 由致敏T细胞在活的或灭活的病毒等干扰素诱生剂和某些细胞,47,目前，我国已开发研制成功猪白细胞干扰素（,swine interferon,）。该制品系用鸡新城疫病毒诱导健康猪白细胞，经培养、灭活病毒、除菌、分装等工艺制成。用于防治猪流行性腹泻。,目前，我国已开发研制成功猪白细胞干扰素（swine inte,48,CpG DNA,，,CpG OND,CpG DNA,：,指含有非甲基化,CpG,（胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸）基序的脱氧核糖核酸,DNA,。,CpG,基序（,motif,）,：指以非甲基化的,CpG,为基元构成的回文序列，其碱基排列大多为,5,-Pur Pur- CG- Pyr Pyr-3,，具有较强免疫活性，称为免疫刺激序列（,ISS,，,immunostimulatory DNA sequences,）。,CpG OND,：,含有非甲基化,CpG,基序的寡聚脱氧核苷酸 。,CpG DNA，CpG OND CpG DNA：指含有非,49,细胞因子的分泌和细胞的分化,CpGDNA,的免疫刺激效应（作用机制）,温度,能量,酸化内体小泡,DNA-PK,TLR-9,胞质内受体蛋白,有丝分裂原蛋白激酶和,转录因子等信号通路,细胞因子的分泌和细胞的分化CpGDNA的免疫刺激效应（作用机,50,引起,B,细胞,分化，分泌,IL-6,、,IL-10,等细胞因子和表达,MHCII,、,B7-1,、,B7-2,等表面分子，并阻止,B,细胞的凋亡。,直接激活,单核细胞、巨噬细胞和树突细胞,，分泌,IL-12,、,INF-r,等,Thl,样为主的细胞因子，并刺激,MHCII,、,B7-1,、,B7-2,的表达。,在,IL-12,协同下激活,NK,细胞,，杀伤活性增强，并分泌,IFN-r,，,IFN-r,反过来进一步促进单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的激活。,协同刺激抗原特异性,B,细胞和,T,细胞,分化，在,Thl,细胞因子的作用下，显著增强获得性细胞免疫,-,优良的,T,细胞免疫佐剂。,1,CpGDNA,对多种免疫细胞有激活作用,引起B细胞分化，分泌IL-6、IL-10等细胞因子和表达M,51,含有,GACGTT-,基序的,CpG OND,小鼠淋巴细胞,含有,AGCGTG,基序的,CpG OND,小鼠的,NK,细胞,含有,GTCGTT,基序的,CpG OND,人淋巴细胞,含有,ATCGAT,基序的,CpG OND,鸡外周血单核细胞,含有,GTCGTT,基序的,CpG OND,牛,B,细胞的增殖和分泌,IL-6,PBMC,分泌,IL-6,、,IL-l2,和,IFN-r,；,含有,ATCGAT,基序的,CpG OND,猪,(Kamstrup,，,2001),2,CpG OND,免疫刺激作用具有物种和细胞特异性,含有GACGTT-基序的CpG OND小鼠淋巴细胞2C,52,CpGODN,的体内效应与应用,1,对天然免疫系统的刺激活性,（,1,）抗感染,：,单核李斯特杆菌、利什曼原虫,、,疟原虫、单纯疱疹病毒,（,2,）抗肿瘤活性,：,黑色素瘤,2.,对特异性免疫反应的调节作用,疫苗佐剂,（,1,）,CpG ODN,对蛋白质抗原的作用,能够增强许多抗原诱导的,Thl,型反应,HbsAg,、牛疱疹病毒,I,型糖蛋白,D,、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、疟疾的多肽、麻疹病毒、放线杆菌,胸膜肺炎、流感病毒疫苗、猫疱疹病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒,（,2,）,CpG ONG,对,DNA,疫苗的作用,3,过敏性疾病治疗,CpGODN的体内效应与应用,53,霍乱毒素（,CT,）,大肠杆菌不耐热毒素（,LT,）,破伤风类毒素（,TT,）,基因工程减毒素,霍乱毒素（CT） 基因工程减毒素,54,（一）霍乱毒素（,CT,）,良好的粘膜免疫佐剂,由,A,和,B,两个区构成的蛋白,B,区具有主要免疫学作用，内含,5,种独立的非共价连接的,B,亚单,位（,CTB,），无毒性，可与细胞结合。,A,区是,CT,的生物学活性部分，具有酶活性。,仙台病毒,CT,；,CTB,流感病毒,HA,；链球菌表面蛋白,CTB,；,CT,毒素,A,和,B,两个亚单位的表达质粒,DNA,作为佐剂与,DNA,疫苗联和应用，还可诱导机体产生很强的,Th1,细胞因子反应（如,IFN-,）和,Th2,细胞因子反应（如,IL-4,），具有很强的佐剂作用。,（一）霍乱毒素（CT）,55,（二）大肠杆菌不耐热毒素（,LT,）,大肠杆菌,LT,毒素有,A,和,B,两个亚单位，有一定抗原性,A,亚单位基因工程点突变体,LT(R192G),无毒性作用，但仍保留了其佐剂效应,可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。,利用基因突变技术，构建的,A,和,B,两个亚单位的表达质粒,DNA,联合应用，也可诱导机体产生很强的,Th1,细胞因子反应（,IFN-,）和,Th2,细胞因子反应（,IL-4,）。而且，,LT,毒素表达质粒作为佐剂，可协助,DNA,疫苗诱导机体产生更强的细胞免疫反应，有望成为一种新型免疫增强剂。,（二）大肠杆菌不耐热毒素（LT）,56,7脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维生素,对特异性免疫反应的调节作用疫苗佐剂,能够增强许多抗原诱导的Thl型反应HbsAg、牛疱疹病毒I型糖蛋白,可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。,1.,一种强有力的佐剂候选因子,对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子：,A12(SO4)318H2O+6NaOH2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O,疫苗冻干保护剂组成,按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）,一些常用的冷冻干燥保护剂,5快速反应性：即对激发因素的迅速反应,位（CTB），无毒性，可与细胞结合。,DMSO:二甲基亚砜，一种细胞的保护剂,2CpG OND免疫刺激作用具有物种和细胞特异性,苏和迅速修复自身。,明确不同种类微生物需要添加不同保护剂,3免疫刺激复合物佐剂（ISCOM）,并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，,含有GTCGTT基序的CpG OND人淋巴细胞,使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度,形成肉芽肿，促进炎症反应，增强吞噬细胞吞噬作用；,免疫刺激复合物（,immunostimulating complex,，,ISCOM,）,ISCOM,由,抗原,物质与由皂树皮提取的一种,糖苷,Quil A,和,胆固醇,按,1:1:1,混合后自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡。,ISCOM,直径,40nm,，每个,ISCOM,约含,10,12,分子的蛋白质。,ISCOM,应用于多种细菌、病毒和寄生虫病的疫苗，具有产生,“,全面,”,免疫应答的效力，可长期增强特异性抗体应答。,ISCOM,能有效地通过粘膜给药，从而可以用于抗呼吸道感染。,目前，兽用,ISCOM,疫苗已在国外投放市场。,7脂质分子类佐剂：脂多糖、Vit A和Vit E等脂溶性维,57,2,、佐剂作用机理：,机理非常复杂，但可概括三个方面。（不同书有不同写法）,抗原储存库延长抗原储存时间，延长抗原释放，加强抗原降解等；,形成肉芽肿，促进炎症反应，增强吞噬细胞吞噬作用；,刺激淋巴细胞增殖和转化。,二、佐剂分类,不溶性铝盐类佐剂,油水乳剂佐剂,常用,佐剂,免疫,蜂胶佐剂,细胞因子佐剂,佐剂 微生物及代谢产物佐剂,免疫刺激复合物（,Iscom,）,新型免疫佐剂,脂质体佐剂（,Liposomes,）,MF59,佐剂,2、佐剂作用机理：,58,一）常用免疫佐剂,1,、铝盐类佐剂,氢氧化铝胶：主要用于兽用细菌灭活苗（,20%,乳胶液）,2,、油水乳剂佐剂,油乳佐剂是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。,弗氏佐剂：矿物质（液体石蜡）、乳化剂（羊毛脂）、卡介,苗组成 的油包水乳化佐剂（三种成分俱全成为,弗,氏完全佐剂,，不含卡介苗或死结核杆菌的为,弗氏,不完全佐剂,）很少用于疫苗，因为太稠，注射困,难，但在实验中应用广。,矿物油：白油,白油佐剂,乳化剂：司苯,-80,、硬脂酸铝、吐温,-80,。,一）常用免疫佐剂,59,油乳剂疫苗生产方法见书上,55,页。即油乳佐剂和病毒液或菌液按一定比例混合，经搅拌（高油）或胶体磨乳化而成,油乳剂疫苗：,4,以上保存，不能冻结，否则易分层即破乳（常温下保存,1,年以上，都不分层）。,3,、蜂胶佐剂（见书）,二,),新型免疫佐剂,1,、细胞因子类佐剂（相当于胸腺肽、干扰素等因子作用）,干扰素（,、,（抗病毒）,（免疫调节，抗肿瘤）,细胞因子 白细胞介素（,IL-1,、,IL-2,、,IL-6,、,IL-12,、,IL-,18IL-21,）,肿瘤坏死因子（,TFN-, TFN-,集落刺激因子,油乳剂疫苗生产方法见书上55页。即油乳佐剂和病毒液或菌液按一,60,2,、,CpG DNA:,是含有非甲基化,CpG,基序的脱氧核糖核酸,DNA,，能诱生强烈的免疫应答反应。,3,、基因工程减毒素：蛋白质毒素具有良好的抗原性，所以具有免疫佐剂作用，但不能直接作佐剂需要减毒。,4,、免疫刺激复合物（,immunostimulating complexes,Iscom,）：是由抗原物质（,20,多种病毒的亲水蛋白或细菌膜蛋白等）和,Quil A,（皂树皮提取的一种糖苷,),与胆固醇按,1:1:1,混合后具有较高免疫活性脂质小泡，可长期增强特异性抗体应答。,5,、脂质体佐剂：是人工合成的具有单层或多层单位膜结构的脂质小囊，具有佐剂兼载体效应。,目前,Iscom,和脂质体（,Liposomes,）被认为是制备亚单位疫苗的理想载体和免疫佐剂。,2、CpG DNA:是含有非甲基化CpG基序的脱氧核糖核酸D,61,甲醛溶液：,规程,（,2000,）中的,26,种灭活疫苗,灭活机理：,灭活浓度：多数为,0.1,0.3,灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底灭活目的；,必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。,氨基 甲基胺,羧基 亚甲基二醇单酯,巯基 亚甲基二醇,甲醛,醛基,羟基 羟基甲酚,甲醛溶液： 氨基 甲基胺 羧基,62,烷化剂（,alkylating agent,）,乙酰基乙烯亚胺（,AEI),、二乙烯亚胺,(BEI),、缩水甘油醛,灭活机制：,1.,烷化,DNA,分子中的,鸟嘌呤或腺嘌呤,等，引起单链断裂或双螺旋链交联，因改变,DNA,的结构而破坏其功能，,妨碍,RNA,的合成，,从而抑制细胞的有丝分裂。,2.,与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。,优点：,能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而,不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。,烷化剂（alkylating agent）,63,疫苗冻干保护剂组成,1.,营养液：,可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；,可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，,增加溶解度,2.,赋形剂：,防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响,使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度,3.,抗氧化剂：,抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存,期间的稳定性，如维生素,C,、维生素,E,和硫代硫酸钠等。,疫苗冻干保,64,抗原递呈（,antigen presentation,）, 抗原寻的（,antigen targeting,）, 免疫调节（,immune modulation,）,作用机理, 抗原递呈（antigen presentation）,65,（,1,）蜂胶的处理：,蜂胶（,4,以下贮存） 粉碎过筛 按,1,：,4,（,W/V,）加,95,乙醇 室温浸泡,24,48h,冷却 过滤或离心取上清 透明栗色纯净蜂胶浸液,4,以下保存备用 除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。,（,2,）蜂胶佐剂疫苗的制备：,灭活菌液或病毒液，加入蜂胶乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂胶,10mg,，边加边摇荡，成为乳浊状，即可。,蜂胶佐剂疫苗制备方法：,（1）蜂胶的处理：蜂胶佐剂疫苗制备方法：,66,1,多效性：,免疫调节作用的多样性,作用方式的非特异性：不表现抗原特异性,2,靶细胞的多样性：构成机体细胞,细胞调节网络,3,多源性：,4,高效性：有免疫激素（,immune hormone,）之称,5,快速反应性：即对激发因素的迅速反应,细胞因子的作用特点,1多效性：细胞因子的作用特点,67,1,作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果,2,作为免疫治疗剂，预防和治疗某些病原感染,3,通过基因重组，构建新型基因工程疫苗,IL-2-AIV-HA,重组痘病毒,细胞因子的应用,1作为免疫佐剂，提高疫苗的免疫效果细胞因子的应用,68,1对天然免疫系统的刺激活性,抗原储存库延长抗原储存时间，延长抗原释放，加强抗原降解等；,2、二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI）,经典的细胞因子：淋巴毒素（LT）、肿瘤坏死因子（TNF）,大肠杆菌LT毒素有A和B两个亚单位，有一定抗原性,毒素（TT）等；,IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。,防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响,蜂胶佐剂疫苗制备方法：,5脂质体佐剂（liposomes）。,两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH 6.,IL-12活性高于IL-2和IFN，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。, 氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。,5mgm1死结核杆菌即为FCA。,15%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂,指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。,并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，,油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂成分的质量等有关。,D、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、疟疾的多肽、麻疹病毒、放线杆菌, 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂,可诱导机体产生局部粘膜免疫反应。,（指对疫苗生产、血清制备等）,优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而,难，但在实验中应用广。,18IL-21）,氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。,、保护剂浓度：严格按照配方执行。,单环芳烃与双环芳烃含量低于0., 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释，,2靶细胞的多样性：构成机体细胞细胞调节网络,两液等量逐渐流入另一耐酸搪瓷缸内，蒸汽吹沸熟化10min，调节pH 6.,乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水甘油醛, 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、,蜂胶（4以下贮存） 粉碎过筛 按1：4（W/V）加95乙醇 室温浸泡2448h 冷却 过滤或离心取上清 透明栗色纯净蜂胶浸液 4以下保存备用 除去干渣计算出浸液中含蜂胶量。,使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合，用力振摇即可成为均匀的乳剂。,脂乳或7.,肿瘤坏死因子（TFN-, TFN-,7号或10号白油,免疫调节（immune modulation） 是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制。,是目前发现的唯一主要由,B,细胞产生的细胞因子，与,IL-2,有协同作用，所以曾被称为细胞毒淋巴细胞成熟因子（,CLMF,）和天然杀伤细胞刺激因子（,NKSF,）。,糖蛋白，分子量,75kDa,，由,40kDa,（,P40,）和,35kDa,（,P35,）两个亚单位构成，两个亚单位完全由不同的基因所编码，只有结合为一个完整的分子时才能发挥生物学活性。,IL-12,活性高于,IL-2,和,IFN,，在极低浓度时就有显著活性，对灭活疫苗、肿瘤和寄生虫抗原具有有效的佐剂活性。,IL-12,诱导产生的,Th1,应答反应尤为引人注目，可望用于主要诱导细胞免疫应答的疫苗佐剂。,IL-12,1对天然免疫系统的刺激活性 菌种或毒种保存：常用甘油作保,69,