结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展讲课ppt课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,1,（优选）结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,（优选）结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究,4、Mtb8、Mtb16.,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究,各实验室所用的靶基因、引物、反应条件、报道的敏感度和特异度差异较大，因此，难以对TBM的诊断效率进行整体评估,通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR反应设计和全自动样品处理纯化核酸,不能区分Mtb和非Mtb,1 抗酸杆菌涂片、染色、镜检,发光二极管荧光显微镜（LEDFM）观察“0”罗丹明染色,操作复杂，费用昂贵，不易普及,（3）二维胶内差异凝胶电泳,分为直接病原学检查和间接病原学检查,对形态多变、细胞壁部分或完全缺失的L型Mtb无法着色,不但可用来诊断TBM，还可以区分潜伏感染、现症感染、感染Mtb的毒力,后期主要为阻塞性脑积水,结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,结核性脑膜炎（TBM）是由结核分枝杆菌（Mtb）感染引起的非化脓性细菌性脑膜炎,在肺外结核中诊断难度、病死率、致死率均最高,TBM早期临床表现、脑脊液变化、影像学均不典型，脑脊液收集有限，Mtb是细胞内寄生菌，故很多检测TBM的方法敏感度低、特异度不高、易误诊、漏诊。,目前，尚无一种方法可完全解决TBM诊断的问题,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究结核性,1,临床表现,头痛、易激惹、呕吐、发热、颈项强直、癫痫、局部神经损害表现、意识改变、昏睡,一、临床诊断,1 临床表现一、临床诊断,2 脑脊液 约1/3不典型,多数压力高，达200400mmH2O,无色透明，浑浊或出现薄膜已不常见；细胞数多在50500106/L,也可显著增高（1000106/L）的患者脑脊液中可检测到抗酸杆菌,分类早期中性粒细胞明显增高，恢复期以淋巴为主,蛋白含量多在13g/L,60%以上葡萄糖低于正常,2 脑脊液 约1/3不典型,3,影像学检查,无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚及脑结核瘤等多种形式,头,CT,早期主要为渗出性，可见脑膜强化。后期主要为阻塞性脑积水,头,MRI,，较,CT,敏感，尤其是波及脑膜或脑干时,3 影像学检查,分为直接病原学检查和间接病原学检查,最新国际TBM诊断标准脑脊液中镜检到抗酸杆菌、分离培养到Mtb或PCR法检测到Mtb，可确诊,TBM患者脑脊液Mtb载量较低、敏感度明显低于颅外结核，尤其是肺结核,二、病原学检查,分为直接病原学检查和间接病原学检查二、病原学检查,直接涂片法,离心浓缩法,漂浮集菌涂片法,1,抗酸杆菌涂片、染色、镜检,直接涂片法1 抗酸杆菌涂片、染色、镜检,萋尼染色法（ZiehlNeelsen stain),传统方法、应用最普遍、敏感度低,只有脑脊液Mtb数量超过1000106/L时才能检测到,萋尼染色法（ZiehlNeelsen stain)传统方法、,改良抗酸染色法通过玻片离心法保留细胞的完整性，在萋尼染色同时使用去垢剂Triton，提高细胞通透性，从而显著提高细胞内外Mtb检出率，敏感度更高,仅需0.5ml脑脊液，操作简便易行，,对形态多变、细胞壁部分或完全缺失的L型Mtb无法着色,不能区分Mtb和非Mtb,改良抗酸染色法通过玻片离心法保留细胞的完整性，在萋尼染色同时,发光二极管荧光显微镜（LEDFM）观察“0”罗丹明染色,较普通显微镜放大24倍,不需油镜,可显著提高检测涂片时间，敏感度更高,WHO建议取代传统的萋尼染色法，是抗酸杆菌研究的发展方向,费用昂贵，目前只在发达国家普遍使用,发光二极管荧光显微镜（LEDFM）观察“0”罗丹明染色较普通,诊断结核病的金标准,可鉴别,Mtb,和非,Mtb,、,Mtb,分型、药敏试验、药物研究,Mtb,培养,诊断结核病的金标准Mtb培养,1 罗氏（LownsteinJenson)培养法,应用最普遍，敏感度约20%，需时48周,2 MGIT（mycobateria growth indicator tube)液体960培养法,近年研究新方法，敏感度约50%，平均14.4天，最快10天。操作简单、灵敏，全封闭非侵袭性检测系统防止交叉污染，是目前结核培养的主要发展方向,通过连续检测接种标本培养基所显示的荧光强度变化来判断是否有分枝杆菌生长,1 罗氏（LownsteinJenson)培养法,检测,Mtb,特异核酸片段或抗原成分,有助于结核病诊断和对,Mtb,分型,快速、高效，可发展成为全自动化检测手段,目前诊断,TBM,领域发展最快的方向。,三、病原学间接检查,检测Mtb特异核酸片段或抗原成分三、病原学间接检查,目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋白衍生物、阿拉伯甘露聚糖（LAM）、早期分泌性抗原靶6（ESAT6）蛋白抗原b、分泌蛋白MPT64、Mtb8.,5ml脑脊液，操作简便易行，,分类早期中性粒细胞明显增高，恢复期以淋巴为主,对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门的浊度仪进行定时定量检测。,不能区分Mtb和非Mtb,目前诊断TBM领域发展最快的方向。,（3）二维胶内差异凝胶电泳,可显著提高检测涂片时间，敏感度更高,1聚合酶链反应（ PCR）,可鉴别出TBM脑脊液中表达的特异性蛋白,用于早期耐药结核病的诊断,1 罗氏（LownsteinJenson)培养法,后期主要为阻塞性脑积水,（3）环介导等温扩增法,通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR反应设计和全自动样品处理纯化核酸,1,聚合酶链反应（,PCR,）,多用于实验研究，非临床诊断,最新制定的,TBM,临床诊断标准将商业化的,PCR,检测试剂盒作为,TBM,诊断的金标准,成本高，敏感度低，尚未作为,TBM,的常规检查,（一）核酸检测,目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋白衍生物、阿拉伯甘露聚,（,1,）经典,PCR,检测,选择性的扩增脑脊液中Mtb的DNA片段,常用的靶基因有IS6100保守片段、MPB64抗原、相对分子质量65000蛋白等,所需脑脊液量少，敏感度48100%，特异度8498%,各实验室所用的靶基因、引物、反应条件、报道的敏感度和特异度差异较大，因此，难以对TBM的诊断效率进行整体评估,（1）经典PCR检测选择性的扩增脑脊液中Mtb的DNA片段,多数压力高，达200400mmH2O,1聚合酶链反应（ PCR）,各实验室所用的靶基因、引物、反应条件、报道的敏感度和特异度差异较大，因此，难以对TBM的诊断效率进行整体评估,（3）二维胶内差异凝胶电泳,后期主要为阻塞性脑积水,1聚合酶链反应（ PCR）,1 罗氏（LownsteinJenson)培养法,截至目前，人们使用过的结核抗原有20余种,不但可用来诊断TBM，还可以区分潜伏感染、现症感染、感染Mtb的毒力,（3）二维胶内差异凝胶电泳,（优选）结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,分为直接病原学检查和间接病原学检查,（,2,）,GeneXpert:,通过对,Mtb,特有序列的,rpob,基因和利福平耐药相关,81bp,的核心区域进行检查，采用独特的定量,PCR,反应设计和全自动样品处理纯化核酸,敏感度,92%,，特异度,99.6%,，,2,小时可检测,8,个样本,操作安全，方法简便，样品使用量小,可用于脑脊液、胸腔积液、腹水、脓、粪便标本中的,MTB,检测,欧美国家已普遍受到认可,多数压力高，达200400mmH2O（2）GeneXpert,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究,操作复杂，费用昂贵，不易普及,多数压力高，达200400mmH2O,60%以上葡萄糖低于正常,结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,60%以上葡萄糖低于正常,通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR反应设计和全自动样品处理纯化核酸,最新制定的TBM临床诊断标准将商业化的PCR检测试剂盒作为TBM诊断的金标准,可用于结核菌种鉴定和Mtb耐药基因,1 抗酸杆菌涂片、染色、镜检,运用多重PCR扩增和和反向杂交技术，通过检测利福平和异烟肼耐药相关基因rpoB、katC、inhA的突变,敏感度92%，特异度99.,（,3,）环介导等温扩增法,对靶基因的,6,个特异部位设定,4,种引物，利用一种链置换,DNA,聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门的浊度仪进行定时定量检测。,准确、简便、需时短、耗材少,敏感度,88.23%,，特异度,80%,由于敏感度高，极易污染，会产生假阳性,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究（3）,（,4,）线性探针技术,运用多重,PCR,扩增和和反向杂交技术，通过检测利福平和异烟肼耐药相关基因,rpoB,、,katC,、,inhA,的突变,敏感度,94.3%,，特异度,96.0%,用于早期耐药结核病的诊断,操作复杂，费用昂贵，不易普及,（4）线性探针技术运用多重PCR扩增和和反向杂交技术，通过检,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究,可显著提高检测涂片时间，敏感度更高,多用于实验研究，非临床诊断,在肺外结核中诊断难度、病死率、致死率均最高,不能区分Mtb和非Mtb,（3）二维胶内差异凝胶电泳,在肺外结核中诊断难度、病死率、致死率均最高,操作简便，20分钟可出结果,4、Mtb8、Mtb16.,截至目前，人们使用过的结核抗原有20余种,对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门的浊度仪进行定时定量检测。,费用昂贵，目前只在发达国家普遍使用,（,5,）基因芯片技术,将多种探针固定在玻璃等基片上，与待测样本的,DNA,或,RNA,进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而进行大规模遗传差异分析,可用于结核菌种鉴定和,Mtb,耐药基因,诊断快速,标本中细菌数超过,10000,个才能呈现杂交阳性反应,敏感度低，特异度高,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究（5）,将特异度高的,DNA,探针与敏感度高的,PCR,技术结合，是结核病研究和临床应用的一种良好途径,将特异度高的DNA探针与敏感度高的PCR技,操作简便，20分钟可出结果,通过连续检测接种标本培养基所显示的荧光强度变化来判断是否有分枝杆菌生长,（3）二维胶内差异凝胶电泳,对阿拉伯甘露聚糖（LAM）的检测已经进入临床诊断，有特异的LAMIgG试剂盒，称作结明试验。,对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门的浊度仪进行定时定量检测。,通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR反应设计和全自动样品处理纯化核酸,无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚及脑结核瘤等多种形式,目前，尚无一种方法可完全解决TBM诊断的问题,所需脑脊液量少，敏感度48100%，特异度8498%,多用于实验研究，非临床诊断,成本高，敏感度低，尚未作为TBM的常规检查,费用昂贵，目前只在发达国家普遍使用,（,1,）脑脊液结核抗原,不同种类的结核抗原纯度和活性差异很大，因此，检测效果差异较大,截至目前，人们使用过的结核抗原有,20,余种,卡介苗抗原和其他细菌有交叉反应，假阳性率较高,2,抗原检测,操作简便，20分钟可出结果（1）脑脊液结核抗原不同种类的结核,目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋白衍生物、阿拉伯甘露聚糖（LAM）、早期分泌性抗原靶6（ESAT6）蛋白抗原b、分泌蛋白MPT64、Mtb8.4、Mtb8、Mtb16.3、A60抗原、Ag85复合体、培养滤液蛋白10（CFP10等,检测方法凝聚试验、酶联免疫吸附试验、免疫斑点法和免疫金标技术,目前最常检测的结核抗原包括结核菌素纯蛋白衍生物、阿拉伯甘露聚,对阿拉伯甘露聚糖（LAM）的检测已经进入临床诊断，有特异的LAMIgG试剂盒，称作结明试验。操作简便，20分钟可出结果,不但可用来诊断TBM，还可以区分潜伏感染、现症感染、感染Mtb的毒力,对阿拉伯甘露聚糖（LAM）的检测已经进入临床诊断，有特异的L,（,2,）胞内结核抗原,Mtb是胞内寄生菌,（2）胞内结核抗原Mtb是胞内寄生菌,只有脑脊液Mtb数量超过1000106/L时才能检测到,结核性脑膜炎临床和实验室诊断现状和进展,对靶基因的6个特异部位设定4种引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使靶基因高效扩增，应用专门的浊度仪进行定时定量检测。,可用于结核菌种鉴定和Mtb耐药基因,成本高，敏感度低，尚未作为TBM的常规检查,（3）二维胶内差异凝胶电泳,无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚及脑结核瘤等多种形式,敏感度92%，特异度99.,成本高，敏感度低，尚未作为TBM的常规检查,较普通显微镜放大24倍,多数压力高，达200400mmH2O,最新国际TBM诊断标准脑脊液中镜检到抗酸杆菌、分离培养到Mtb或PCR法检测到Mtb，可确诊,（3）二维胶内差异凝胶电泳,无特征性，可为脑积水、脑梗死、脑膜增厚及脑结核瘤等多种形式,欧美国家已普遍受到认可,4、Mtb8、Mtb16.,截至目前，人们使用过的结核抗原有20余种,可显著提高检测涂片时间，敏感度更高,通过对Mtb特有序列的rpob基因和利福平耐药相关81bp的核心区域进行检查，采用独特的定量PCR反应设计和全自动样品处理纯化核酸,敏感度92%，特异度99.,多用于实验研究，非临床诊断,1聚合酶链反应（ PCR）,截至目前，人们使用过的结核抗原有20余种,可鉴别Mtb和非Mtb、Mtb分型、药敏试验、药物研究,（,3,）二维胶内差异凝胶电泳,已广泛应用于各种神经系统疾病,可鉴别出TBM脑脊液中表达的特异性蛋白,Mtb蛋白花生四烯酸5脂氧合酶（ALOX5）、胶质纤维酸性蛋白、抗凝血酶可特异性升高，载脂蛋白E以及AI、甲状腺素运载蛋白可特异性降低,ALOX5可作为诊断TBM的标志性蛋白，如与质谱分析联合使用，可提高检出率,只有脑脊液Mtb数量超过1000106/L时才能检测到（3,