代谢物识别与结构鉴定课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精制类,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,代谢物的识别与结构鉴定,组员：周霞 周雯迪 郑梦琳,1,精制类,代谢物的识别与结构鉴定组员：周霞 周雯迪 郑梦琳1精制类,代谢物的结构鉴定在新药开发过程的重要地位,预防潜在的毒性,测定是否和原药具有相同的治疗作用,测定对其他治疗有内在的活性,测定是否有代谢物和已知药物相关,2,精制类,代谢物的结构鉴定在新药开发过程的重要地位预防潜在的毒性测定是,药物代谢研究贯穿于创新药物研发产业链的始终，并在药物的发现及开发过程中起到越来越重要的作用。建立可靠的分析方法是研究药物体内代谢的前提。在药物发现和开发的许多阶段，,代谢物鉴定具有关键性作用。,极性代谢物的分离和保留,怎样在复杂的数据中准确快速地找到代谢物,怎样对代谢物的结构进行确认，怎样确定代谢位点,A,C,B,3,精制类,药物代谢研究贯穿于创新药物研发产业链的始终，并在药物的发现及,联用技术,放射性示踪,4,精制类,联用技术放射性示踪4精制类,一、.联用技术,5,精制类,一、.联用技术5精制类,联用技术,LC-MS,LC-MS/MS,GC-MS,GC-MS/MS,LC-NMR,6,精制类,联用技术LC-MSLC-MS/MSGC-MSGC-MS/MS,LC-MS,联用技术,体内代谢物研究过程中，因待测物浓度太低，提取其纯品进行结构鉴定是不太可能的。应用,LC-MS,联用技术,可获得,复杂混合体中单一成分的质谱,图，大大有利与药物代谢物的分离与鉴定。,7,精制类,LC-MS联用技术体内代谢物研究过程中，因待测物浓度太低，提,LC-MS,联用技术,随着现代色谱联用技术的发展，体内多种微量代谢产物的分离、鉴定已成为一个连续过程，尤其是,LC-MS,样品,前处理简单,，一般不,要求水解或衍生化处理,，可,直接,用于药物及其,I,，,相等,极性较大,代谢产物的,同时分离、鉴定,。运用,LC-MS,技术不仅可,避免复杂烦琐,的分离、纯化代谢产物的工作，而且可分离鉴定难以辨识的体内痕量代谢产物。,8,精制类,LC-MS联用技术随着现代色谱联用技术的发展，体内多种微量代,LC-MS,联用技术,四极质谱仪（,QMS,）,三重四极质谱仪（,TQMS,）,四极,-,线性离子阱质谱仪（,QTrap,）,四极,-,飞行时间质谱仪（,Q-TOFMS,）,离子阱,-,飞行时间质谱仪（,IT-TOFMS,）,代谢物鉴定中， 常用的与,LC,联用的质谱仪器,9,精制类,LC-MS联用技术 四极质谱仪（QMS） 三重四极质谱仪（T,LC-MS,特点,样品前处理简单，无需衍生化，适用范围广,将色谱的高分离能力与质谱的高检测灵敏度、定性专属性集于一身,随着接口装置和离子化技术的发展成熟，该技术在体内药物分析中逐渐发展成为一种常规的分离检测方法,10,精制类,LC-MS特点样品前处理简单，无需衍生化，适用范围广将色谱的,实例,大鼠尿中人参皂苷,Rd,及,其代谢物的,LC-MS,研究,11,精制类,实例大鼠尿中人参皂苷 Rd及11精制类,LC-MS,实例,目的：探讨人参皂苷,Rd,在大鼠体内的,代谢产物及转化途径,。,方法：选择,SD,大鼠,6,只,单剂量口服和静脉给予人参皂苷,Rd,分段收集给药前和给药后,0,24 h,尿样,将尿样分时段合并后采用旋转薄膜蒸发浓缩,以固相萃取小柱纯化处理,采用,高效液相色谱,-,串联飞行时间质谱,进行检测。,结果：通过比较给药前后的,TOF,总离子流图,对尿中推测的代谢物和标准物质的出峰时间及相关化合物选择离子扫描二级质谱图进行了比较分析,结果在尿中发现了,7,种代谢产物,系统分析了这些代谢产物的,代谢转化规律及可能结构,。,结论：大鼠尿中人参皂苷,Rd,的主要转化途径为,氧化、水解、结合及异构化代谢反应,。,12,精制类,LC-MS实例目的：探讨人参皂苷 Rd在大鼠体内的代谢产物及,离子源,(ESI),电压,: - 4 kV,去簇电势,(DP) :- 15 V,聚焦电势,( FP) : - 80 V,去簇电势,2 (DP2) :- 15 V,雾化气,(NEB ) : 0135 L min,- 1,帘气,(CUR) : 0120 Lmin,-1,负离子方式检测,采用,TOF,扫描一级质谱,扫描质量范围,: 400,1 200,选择离子扫描二级质谱进行测定,色谱柱,流动相,其他,质谱条件,色谱与质谱条件,为甲醇,(A) -10 molL,- 1,乙酸铵,(B),40 min,内由体积比,5050,线性梯度升至,90 10, 40,55 min,维持,AB = 9010,等度洗脱,15 min,流速,: 018 mLmin,-1,分流比为,1 60,柱温为,25 ,进样量为,20L,Agilent Zorbax SBC18,(150 mm 416 mm, 5 m),Agilent Zorbax SB C18,(1215 mm 211 mm),预柱,LC-MS,实例,13,精制类,离子源(ESI)电压: - 4 kV,色谱柱流动相其他质谱条,LC-MS,实例,Metabolization pathway of G-Rd,14,精制类,LC-MS实例Metabolization pathway,LC-MS,实例,Fragment pathway of G-Rd,15,精制类,LC-MS实例Fragment pathway of G-R,LC-MS/MS,联用技术,由于多数药物的代谢物保留了原药分子的骨架结构，或一些亚结构，因此，代谢物可能进行与原药相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，用,MS/MS,分别进行,中性丢失扫描、母离子扫描以及子离子扫描,，即可迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。,16,精制类,LC-MS/MS联用技术由于多数药物的代谢物保留了原药分子的,实例,LC-MS/MS,法快速高效检测尿液中尼古丁及其,9,种代谢物,17,精制类,实例LC-MS/MS 法快速高效检测尿液中尼古丁及其 9 种,LC-MS/MS,实例,以氘代尼古丁、氘代可的宁、,3-OH-,氘代可的宁、氘代尼古丁葡萄糖醛酸复合物、氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物、,3-OH-,氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物作内标,在,LC-MS/MS,的,大气压化学电离,(APCI),离子化模式,下,建立了快速检测吸烟者尿液中尼古丁及其,9,种代谢物的方法,并对,19,个实际样品进行了测试和判别分析,(DA).,实验前处理简单,色,谱,运行时间仅为,3.8 min.,结果表明,尼古丁及其代谢物的,精密度,在,0.5%,5.5%,之间,回收率,在,94%,109%,之间,线性相关系数,均大于,0.995. DA,分析充分区别开了不同量的吸烟者,进一步的相关性分析表明吸烟者,24 h,尿液中的尼古丁及其,9,种代谢物含量与卷烟抽吸量的分析因子之间均有较强正相关性,.,18,精制类,LC-MS/MS实例 以氘代尼古丁、氘代可的宁、3-OH-氘,质谱检测采用,APCI,源,正离子化模式,气帘气压力设置为,0.17 MPa,雾化气,0.55 MPa,碰撞气,0.04 MPa,离子源温度为,550 ,离子化电流设为,3 A,各代谢物的多反应监测,(MRM),参数见表,色谱柱,流动相,其他,质谱条件,色谱与质谱条件,流动相,A,为,10mmol/L,醋酸铵水溶液,(pH 6.8),流动相,B,为,10 mmol/L,醋酸铵的甲醇溶液,流速,0.5 mL/min,梯度洗脱条件,:,起始,A,为,85%,到,0.02 min,为,5%,保持至,0.3 min, 0.32 min,变为,85%,保持至,2 min,结束,柱温为3,5 ,为,Shisheido MG II,柱,(2.0 mm50 mm, 3m),LC-MS/MS,实例,19,精制类,质谱检测采用APCI 源色谱柱流动相其他质谱条件色谱与质谱条,LC-MS/MS,实例,20,精制类,LC-MS/MS实例20精制类,GC-MS,联用技术,气质联用技术是分析仪器中,较早实现,联用技术的仪器。气相色谱分,离效率高,、,定量准确,，然而不足的是定性较为困难，及时未知样品纯度较高，鉴定结构也不容易。质谱具有,灵敏度高、鉴别能力强、响应速度快,的优点，但欠缺的是对复杂得多组分样品的分离能力。,虽然商品化的,GC-MS,联用仪器出现较早，在药物代谢研究中的应用也较早，但,GC,法对样品的极性和热稳定性有一定要求。因此，在,GC-MS,联用技术分析前，,样品的预处理,极为重要。其代谢物的,热稳定性、挥发性、极性,可能,差异较大,，需要根据具体情况对样品,先进行水解处理,或,衍生化处理,。,21,精制类,GC-MS联用技术气质联用技术是分析仪器中较早实现联用技术的,实例,GC-MS/MS,法测定人头发中的大麻酚类及其代谢物,22,精制类,实例GC-MS/MS 法测定人头发中的大麻酚类及其代谢物22,GC-MS/MS,实例,目的：建立同时检测头发中,9-,四氢大麻酚（,THC,）、大麻酚（,CBN,）、大麻二酚（,CBD,）和,9-,四氢大麻酸（,THC-COOH,）的分析方法。,方法：头发样品加入氘代内标,9-,四氢大麻酸（,THC-COOH-d3,），经碱水解后，以混合溶剂,V,（正己烷）,V,（乙酸乙酯,91,进行提取，吹干，残留物经双（三甲基硅烷基）,三氟乙酰胺（,BSTFA,）衍生化,，用,GC-MS/MS,方法进行分析。,结果 ：头发中,THC-COOH,、,THC,、,CBN,和,CBD,的最低检出限分别为,4,、,4,、,10,和,20 pgmg-1,， 各化合物在,0.04,5ngmg-1,呈良好的线性关系（,r,0.999,），方法精密度、准确度均符合要求。,结论：本方法选择性强、灵敏度高，适用于头发中,CBD,、,CBN,、,THC,及其代谢物,THC-COOH,的分析，并成功应用于实际案例中。,23,精制类,GC-MS/MS实例目的：建立同时检测头发中 9-四氢大麻,质谱检测采用,MRM,模式，,以一级质谱分析结果为基础，,选择各目标物的分子离子，,优化碰撞能量,CE,），,得到各目标物和内标的二级质谱图。,CBD,、,CBN,、,THC,、,THC-COOH,和,THC-COOH-d3,的,MS/MS,见表,色谱柱,柱温,其他,质谱条件,色谱与质谱条件,程序升温：,100,保持,1.5min,，,以升温速率,25/min,升温,至,280,保持,5min,分流比21；,载气：氦气,进样口温度：250,检测器温度：250,进样量：1L。,HP-1MS,石英毛细管柱,（,30m0.25mm0.1m,）,G,C-MS,/MS实例,24,精制类,质谱检测采用MRM 模式，色谱柱柱温其他质谱条件色谱与质谱条,GC-MS/MS,实例,25,精制类,GC-MS/MS实例25精制类,LC-NMR,联用技术,近年来，,LC-MS,虽然得到普及推广，但,MS,本身不能提供,足够的,分子结构信息,，因此在实际使用,LC-MS,鉴定药物代谢物结构时，往往需要借助核磁共振（,NMR,）的数据，才能顺利完成工作。目前，在仪器分析领域中,NMR,能够,提供最大量的分子结构信息,，但该法,要求,样品为,纯品,，即在做,NMR,分析前必须做,大量的分离、纯化,工作，这不利于样品的快速分析。如果在核磁共振仪器前配置一套色谱分离设备，使样品被,LC,分离后，直接进入,NMR,中进行扫描测定，就可以大大简化分析程序，提高样品分析速度。因此，将,高分离能力的色谱,与,能提供最丰富结构信息的,NMR,在线联用是非常有意义的。,26,精制类,LC-NMR联用技术近年来，LC-MS虽然得到普及推广，但M,LC-NMR,联用技术,但,HPLC,和,NMR,的联用并不是两种技术的简单组合：,NMR,的,检测灵敏度,明显,低于,常规的,HPLC,的检测器，且作为,HPLC,流动相的,混合溶剂,往往产生,多重强溶剂峰,而影响溶质峰的正确而检测。,由于技术上的原因，如,NMR,灵敏度低,、,液相色谱使用的氘代溶剂十分昂贵,，,溶剂信号对样品的干扰,等等使该联用技术受到限制。,近年来,LC/ NMR,联用技术在研究药物代谢产物,特别是,相代谢产物方面表现出了非常诱人的前景,有关研究报告相继发表。,27,精制类,LC-NMR联用技术但HPLC和NMR的联用并不是两种技术的,LC-NMR,实例,布洛芬,在人体内代谢物的研究便是一个很好的例子,健康男性注射,400mg,布洛芬后,收集,0,4,小时的尿液,经,HPLC/ NMR,联用技术分析,图谱中,清晰地显示出,5,个代谢产物,:2-,羟基布洛芬葡萄糖醛酸、,2-,羧基布洛芬葡萄糖醛酸、,2-,羟基布洛芬、,2-,羧基布洛芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采用停止流动模式技术可以得到纯的,2-,羟基布洛芬的,1,H-NMR,图谱。,28,精制类,LC-NMR实例28精制类,二、放射性示踪,29,精制类,二、放射性示踪29精制类,放射性同位素示踪技术是利用放射性核素及其标记物作为示踪剂来研究生物体内各种物质吸收、分布、代谢、排泄,( ADME),规律的一门科学。,30,精制类,放射性同位素示踪技术是利用放射性核素及其标记物,放射性示踪原理,把用放射性核素标记的物质,A,引入动物体，经过一段时间，从排出物或组织中分离出另一化合物,B,，含有,相当数量,的上述标记核素，即可确定,A,在动物体内可以转变为,B.,31,精制类,放射性示踪原理把用放射性核素标记的物质A引入动物体，经过一段,与被示踪的物质有同一性，,即放射性核素与其同种元素的非放射性核素在化学和生物学行为上具有高度一致性，不致扰乱和破坏体内外生理过程的平衡状态,放射性示踪,一,与被示踪的物质有可区别性，,放射性核素的原子核不断衰减，发出能被放射性探测仪所探测的射线，从而实现对标记物的定量及定位。,二,放射性同位素得以广泛应用于活性物质示踪主要依赖于其最重要的两个特点,32,精制类,与被示踪的物质有同一性，放射性示踪一 与被示踪的物质有可区别,放射性示踪,灵敏度高,专属性强,适用性广,检测方法简便,在药物,ADME,研究中得到了广泛的应用。放射性同位素示踪技术在药物,ADME,研究中发挥着十分重要的作用，美国,FDA,已将放射性同位素标记药物给药后的药动学数据作为,新药安全性评价的重要依据,，并制定了相关指南,33,精制类,放射性示踪灵敏度高专属性强 适用性广检测方法简便在药物ADM,放射性同位素示踪剂的选择,在药物,ADME,的研究中，,常用的放射性同位素,包括,14,C,、,3,H,、,32,P,、,33,P,、,35,S,、,125,I,、,131,I,等。,如今随着小型正电子发射断层扫描,( positron emission tomography,，,PET),仪器的发展，利用,11,C,、,13,N,、,15,O,、,18,F,等放射性核素进行,ADME,研究的实例也日渐增多。,34,精制类,放射性同位素示踪剂的选择在药物ADME 的研究中，常用的放射,放射性同位素示踪剂的选择,放射性同位素,Your Text Here,实验目的,操作者安全,实验周期,有时可以采用双标记或多标记的放射性物质,单一放射性同位素标记的化合物,毒性,标记位置,射线类型,半衰期,放射化学纯度,比活度,35,精制类,放射性同位素示踪剂的选择放射性同位素Your Text He,放射性同位素示踪剂的选择,低能量,的,14,C,和,3,H,是药物,ADME,研究中,最常用,的,2,种放射性核素。这,2,种核素的半衰期分别为,5730,年和,12. 35,年，由于其半衰期长，在实验周期中测得的数据一般不需要作物理半衰期的矫正，便于测量及结果计算。再者，,14,C,和,3,H,两种元素发射的, 射线能量较低，,易于防护,，并可用,液闪技术,测得，,实验操作及结果检测十分方便,。此外，,14,C,和,3,H,还可通过,放射自显影技术,进行检测，,显影清晰,，这又进一步扩大了这两种核素的标记物在,ADME,研究中的应用。,36,精制类,放射性同位素示踪剂的选择低能量的14C 和3H 是药物ADM,示踪原子及其标记位置的选择,避免,标记原子中途,脱落,而失去示踪作用。因此，在选择标记位置时应该首先考虑分子结构中的,稳定部位。,实验目的,分析检测方法,示踪原子在标记化合物中的稳定性,37,精制类,示踪原子及其标记位置的选择避免标记原子中途脱落而失去示踪作用,放射性示踪实例,将,14,C,标记的糖喂给大鼠，发现从其脂肪中分离出来的脂肪酸有很强的放射性，就证明了糖在动物体内可以变成脂肪这一很重要的代谢规律。,也可以用放射性标记某种物质，追踪这种物质在动物体内转移和移动的速度，研究其吸收、摄取、浓集、分布、分泌、排泄以及药物作用原理等问题。,38,精制类,放射性示踪实例将14C标记的糖喂给大鼠，发现从其脂肪中分离出,Thank You!,39,精制类,Thank You!39精制类,