第5章 发酵过程及控制课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、种子制备工艺及质量控制,二、常用代谢参数,三、基质浓度变化及控制,四、温度对发酵的影响及控制,五、溶解氧对发酵的影响及控制,六、,pH,对发酵的影响及控制,七、,CO,2,对发酵的影响,八、泡沫的形成及控制,九、染菌分析及控制,第五节 发酵过程及控制,一、种子制备工艺及质量控制第五节 发酵过程及控制,1,发酵是一个复杂的生物化学过程影响因素很多：菌种、培养基、温度、,pH,、溶氧、污染等。,发酵是一个复杂的生物化学过程影响因素很多：菌种、培养,2,一、种子制备工艺及质量控制,一、种子制备工艺及质量控制,3,菌种是发酵的关键，从一个保存的菌种，到生产上使用的种子，如果按几十几百吨的发酵规模，,10,的种子量(接种量)计，需要几吨几十吨的种子。,菌种是发酵的关键，从一个保存的菌种，到生产上使用的种,4,(一)、作为种子的要求：,1、细胞的生活力强，移种至发酵罐后能迅速生长,2、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求,3、无杂菌污染,4、生理形状稳定、保持稳定的生产能力,(一)、作为种子的要求：,5,(二)、种子制备的工艺流程及对发酵的影响,1、工艺流程,(二)、种子制备的工艺流程及对发酵的影响,6,2、接种时间(种龄)和接种量,接种时间：对数生长期，菌体量还未达最高峰,2、接种时间(种龄)和接种量,7,接种量：决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度,谷氨酸棒状杆菌：,1,大多数抗生素发酵：,510%,个别的发酵：,2025,接种量过小，除延长发酵周期外，往往还引起其它不正常情况,接种量过高，会使菌体生长过快，培养液粘度过高，造成供氧不足,接种量：决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度,8,第5章 发酵过程及控制课件,9,3、种子质量检查与判断,检查,pH,检查培养基灭菌后糖、氮、磷等的含量,检查菌丝的形态、浓度、种子液外观等,无菌检查,稳定性检查,其它参数检查：某种酶的活性、产物量等,3、种子质量检查与判断,10,(三)、影响种子质量的因素：,1、原材料质量,2、培养温度、湿度、时间等,3、种子罐通气量,4、冷藏时间,5、传代次数,(三)、影响种子质量的因素：,11,二、常用代谢参数,二、常用代谢参数,12,1、物理参数,、温度,、罐压,、搅拌速度,、空气流量,、表观粘度,、发酵液重量,1、物理参数,13,2、化学参数,、基质浓度,、pH,、产物浓度,、DNA量,、关键酶,、溶解氧,、排气中的氧含量,、排气中的CO,2,含量,2、化学参数,14,3、生物参数,、菌丝形态,、菌丝干重或湿重,、菌体比生长速率,、氧的比消耗速率,、糖的比消耗速率,、氮的比消耗速率,、产物的比生产速率,3、生物参数,15,第5章 发酵过程及控制课件,16,三、基质浓度变化及控制,三、基质浓度变化及控制,17,1、碳源浓度变化及控制,碳源物质是发酵过程中菌体生长和产物合成的能量和碳素的来源。,在发酵的前期，碳源物质主要用于生长，消耗较快，在发酵后期，碳源物质主要用于产物合成，消耗速度放缓。,快速利用的碳源物质：对生长有利，对次级代谢产物的形成有抑制作用。,缓慢利用的碳源物质：对延长产物的合成是有利的，尤其是次级代谢产物。,1、碳源浓度变化及控制,18,第5章 发酵过程及控制课件,19,到发酵的中后期，发酵液中的残糖基本耗尽，影响产物的合成,如果采用丰富碳源的培养基，又会产生其它的问题，如培养基浓度过高，影响通气搅拌，过高的碳源浓度也抑制菌体的生长。,解决的方法是采取“中间补料”,补糖的方法：连续滴加补糖、小量多次间歇补糖,大量少次补糖,到发酵的中后期，发酵液中的残糖基本耗尽，影响产物的合成,20,“中间补料”可以延长产物的产生时间，推迟菌体的自溶时间，增加了发酵液的体积，而使发酵单位大幅度上升。,“中间补料”可以延长产物的产生时间，推迟菌体的,21,2、氮源浓度变化及控制,氮源物质主要用于菌体中蛋白质、核酸等含氮物质的合成，有些发酵产物中含有氮。,发酵前期，氮源物质随菌体浓度的急剧增加而迅速减少，发酵中期，氮源(氨基氮)的下降速度比较缓慢，发酵后期，由于菌体自溶，氨基氮会回升。,氮源物质往往抑制次级产物的合成。,2、氮源浓度变化及控制,22,快速利用的氮源物质：如氨水、铵盐促进菌体生长。,缓慢利用的氮源物质：有利于延长产物的合成期。,一般情况下，发酵培养基中同时含快速利用的氮源和缓慢利用的氮源物质。,如果氮源物质投料多，会造成菌体生长快，但菌体衰老也快。,解决方法：“中间补料”。,快速利用的氮源物质：如氨水、铵盐促进菌体生长。,23,四、温度对发酵的影响及控制,四、温度对发酵的影响及控制,24,(一)、温度对微生物和发酵的影响,1、不同的菌、不同的发酵对温度的要求不一样。,2、菌体生长的最适温度与产物形成的最适温度往往不一致。,3、菌种在不同的生长期对温度的敏感性不同。,温度对发酵的影响归根结底是影响酶的活力。,(一)、温度对微生物和发酵的影响,25,菌种,温度（）,1299,617,1542,T-613,最适生长温度,最适产物形成温度,30-32,34,32-34,34-36,30-34,34-36,32-36,36-38,谷氨酸菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度,菌种 12996171542T-613最,26,（二）、温度在发酵中的变化规律,生物热的变化规律,Q,生物热,(4.19KJ/m,3,h),时间(,h,),（二）、温度在发酵中的变化规律生物热的变化规律Q生物热(4.,27,（三）、温度的控制,依靠夹层或蛇管,目前许多发酵罐都采用自动化控制,（三）、温度的控制,28,五、溶解氧对发酵的影响及控制,五、溶解氧对发酵的影响及控制,29,溶解氧：溶解于液体(发酵液)中的氧,氧难溶于水，在25，1atm下，氧在水中的溶解度为0.26m mol/升,临界溶解氧浓度：满足微生物呼吸的最低限度的溶解氧浓度。,一般好气性微生物约为0.0030.05m mol/升之间。,溶解氧：溶解于液体(发酵液)中的氧,30,微生物名称,温度(),C,临界,(,m mol,/升),固氮菌,30,0.018-0.049,大肠杆菌,15,0.0031,大肠杆菌,37.8,0.0082,酵母菌,20,0.0037,酵母菌,34.8,0.0046,橄榄型青霉菌,24,0.0022,橄榄型青霉菌,30,0.009,橄榄型青霉菌,32,0.02,微生物名称温度()C临界(m mol/升)固氮菌300.0,31,第5章 发酵过程及控制课件,32,影响微生物需氧量的因素,1、菌种,2、菌体浓度,3、菌龄,4、培养基,(一)影响需氧和供氧的因素,影响微生物需氧量的因素(一)影响需氧和供氧的因素,33,影响供氧量的因素,1、搅拌,2、通气量,3、空气分布管的结构,4、发酵罐的液柱高度/直径比,5、培养液的物理性质,6、泡沫,影响供氧量的因素,34,溶解氧的控制：,应满足需氧供氧,（二）溶解氧的控制,溶解氧的控制：（二）溶解氧的控制,35,需氧方面,控制最适的菌体浓度,供氧方面：,1、改变气体成份,2、提高搅拌速度,3、增加挡板,4、增加通气量,5、提高罐压,需氧方面,36,几个概念：,呼吸强度：指一克干菌体，在一小时内所需氧的毫摩尔数,摄氧量：指一升发酵液，在一小时内所需氧的毫摩尔数,通气量：指一分钟内，发酵液的体积比通过发酵液的空气体积,几个概念：,37,六、,pH,对发酵的影响及控制,六、pH对发酵的影响及控制,38,(一)、,pH,值对发酵的影响：,1、,pH,影响酶的活性,2、,pH,影响微生物细胞膜的带电状况，从而影响微生物对养料的吸收和对代谢产物的分泌,3、,pH,影响培养基中某些营养物质的可给性,4、,pH,可能改变培养基的氧化还原电位,5、,pH,会影响某些微生物的形态,(一)、pH值对发酵的影响：,39,（二）、影响,pH,变化的因素：,1、菌种特性,2、培养基组成,3、发酵条件,（二）、影响pH变化的因素：,40,(三)、,pH,在发酵过程中的变化规律,在发酵前期，菌体生长缓慢，糖分解的少，铵离子利用的也少，所以,pH,变化缓慢。,随菌的生长，菌分解了含氮有机物，释放出铵，培养基的,pH,会缓慢上升。,当菌转入对数生长期，由于菌体大量繁殖，大量利用糖和铵离子，培养基的pH逐渐下降。,在生长后期，由于菌体自溶，释放出铵，pH又回升。,(三)、pH在发酵过程中的变化规律 在发酵前期，菌体生,41,1、调节培养基的配方,2、补料控制, 加酸、加碱, 流加无机氮源, 加碳源物质,3、调节通气量,（四）、发酵过程中,pH,的调节,1、调节培养基的配方（四）、发酵过程中pH的调节,42,七、,CO,2,对发酵的影响,七、CO2对发酵的影响,43,CO,2,是微生物的代谢产物，同时它往往也是合成所需的一种基质,排气中,CO,2,的浓度与细胞量有一定的联系，通过测定,CO,2,的生成，可用来估算菌的生长速率和细胞量,溶解在发酵液中的,CO,2,对氨基酸、抗生素等发酵具有抑制或刺激作用。,CO2是微生物的代谢产物，同时它往往也是合成所需的一种基质,44,(一)、,CO,2,对菌体生长及,产物形成的影响,当排气中的,CO,2,浓度高于,4,时，菌体碳水化合物的合成及呼吸速率下降,发酵液中的,CO,2,浓度为,1.610,2,mol,时，会严重抑制酵母菌的生长,CO,2,影响产黄青霉的形态,(一)、CO2 对菌体生长及,45,CO,2,对氨基酸合成的影响,CO2 对氨基酸合成的影响,46,进气中,CO,2,含量(),紫苏霉素相对产量,0,1,2,3,4,100,66,15,0,0,CO,2,对紫苏霉素生物合成的影响,进气中CO2含量()紫苏霉素相对产量0100CO2 对紫苏,47,(二)、排气中,CO,2,与菌体生长的关系,(二)、排气中CO2 与菌体生长的关系,48,(三)、排气中,CO,2,与,pH,的关系,(三)、排气中CO2 与pH的关系,49,RQ,(呼吸商)=,CEO,OUT,CEO,：,CO,2,释放率(,molCO,2,/L,h,),OUT：,菌耗氧率(,molO,2,/L,h,),(四)、排气中,CO,2,与,排气中,O,2,之间的关系,RQ(呼吸商)=CEOOUTCEO：CO2释放率(molC,50,酵母菌：,RQ=0.93,生成柠檬酸,RQ=1.0,生成菌体,RQ1.1,生成乙醇,青霉素发酵,RQ=0.909,菌体生长,RQ=1,菌体维持,RQ=4,青霉素生产,酵母菌：,51,八、泡沫的形成及控制,八、泡沫的形成及控制,52,1、气泡中的空气有隔热作用，影响灭菌,2、泡沫多会从轴封溢出，容易造成染菌,3、降低了发酵罐的装料系数,4、严重时停搅拌，影响正常的发酵过程,泡沫的危害,1、气泡中的空气有隔热作用，影响灭菌泡沫的危害,53,1、通气搅拌的强烈程度,2、培养基的配比及原材料,3、灭菌,4、种子和接种量,5、培养液本身的性质变化,6、染菌,影响泡沫消长的因素,1、通气搅拌的强烈程度影响泡沫消长的因素,54,1、机械消泡,消沫桨,引出罐外消泡后再引回罐内,2、化学消沫,油脂,泡敌,泡沫的消除,1、机械消泡泡沫的消除,55,九、染菌分析及控制,九、染菌分析及控制,56,（一）染菌原因分析,（一）染菌原因分析,57,1、种子带菌或怀疑种子带菌 9.64,2、罐压跌零造成染菌 0.19,3、培养基未彻底灭菌 0.79,4、空气系统带菌 19.96,5、泡沫冒顶 0.48,6、夹层穿孔 12.36,7、其它管道穿孔 5.89,8、接种管穿孔 0.59,9、阀门泄漏 1.54,10、搅拌轴密封泄漏 2.09,11、罐基漏 1.54,12、其它设备漏 10.13,13、操作问题 10.15,14、原因不祥 20.91,某发酵厂染菌现象的统计分析,1、种子带菌或怀疑种子带菌 9.64某发酵厂,58,1、种子带菌或怀疑种子带菌 10,2、培养基未彻底灭菌 1,3、空气系统带菌 20,4、操作问题 10,5、设备问题 40,6、原因不祥 20,1、种子带菌或怀疑种子带菌 10,59,染菌规模：,大批发酵罐染菌、部分发酵罐染菌、个别发酵罐染菌,染菌时间：,早期、中后期,染菌种类：,芽孢杆菌、小球菌、霉菌、酵母菌、水生细菌,染菌规模：大批发酵罐染菌、部分发酵罐染菌、个别发酵罐染菌,60,（二）防止染菌的措施,（二）防止染菌的措施,61,主要是加强管理：,1、培养基的无菌试验,2、种子的无菌试验,3、设备的定期检查、维修,4、严格、规范的操作,主要是加强管理：,62,（三）染菌后的挽救措施,（三）染菌后的挽救措施,63,1、种子罐染菌：,倒罐，从其它未染菌的罐移种,2、发酵罐早期染菌：,调酸以抑制杂菌生长；加入药物抑制杂菌生长；培养基重新灭菌，转入发酵旺盛的发酵液,3、发酵罐后期染菌：,根据情况，提前放罐,1、种子罐染菌：倒罐，从其它未染菌的罐移种,64,（四）噬菌体污染与防治,（四）噬菌体污染与防治,65,噬菌体在自然界广泛存在，噬菌体污染轻则减产，重则倒罐，长时间停产。,噬菌体在自然界广泛存在，噬菌体污染轻则减产,66,1、发酵前期菌丝量不上升或回落,2、,pH,逐渐上升达,8.0,以上，不下降,3、糖耗缓慢或停止,4、产生大量泡沫，有时发酵液呈粘状可拔丝,5、谷氨酸产生量甚少，或增长极为缓慢，或停止,6、镜检菌体数少，菌体不规则,7、发酵液残糖高，颜色重(红色、灰色)，有刺激性气味,噬菌体污染的征兆,(以谷氨酸发酵为例),1、发酵前期菌丝量不上升或回落噬菌体污染的征兆,67,1、选育抗噬菌体菌系,2、保护环境,3、加噬菌体抑制剂,防止噬菌体污染的常用方法,1、选育抗噬菌体菌系防止噬菌体污染的常用方法,68,1、接入成年菌种,2、改变菌种,3、7080灭活噬菌体，加倍接种,污染噬菌体后的挽救措施,1、接入成年菌种污染噬菌体后的挽救措施,69,