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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学Immunohistochemistry,参考教材 ?免疫组织化学实验技术及应用?主编:倪灿荣等,第一章 绪 论,目 录,一、定义和意义,二、开展简史,三、免疫学概念,四、根本类型与原理,五、种类,六、根本过程,一、免疫组织化学的定义及意义,1、定义,免疫组织化学(Immunohistochemistry),又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)。,的标记抗体或抗原原位显示细胞或组织内的相应抗原或抗体的方法,进行定性、定量、定位检测。原理:抗原、抗体特异性结合,标记化学反响 酶或其他物质标记抗体,抗原-抗体反响 抗原-抗体复合物,呈色化学反响 底物在酶作用下产生有色物质,2、根本理论,组织化学呈色反应,颜色(原位),3,、优点,高特异性,高敏感性,方法步骤统一,形态、机能与代谢相结合,可定性、定位与定量,4,、免疫组织化学的意义,1肿瘤诊疗,肿瘤组织起源诊断,肿瘤分型诊断,确定肿瘤的良恶性,确定转移性恶性肿瘤的原发部位,指导肿瘤的治疗、判断预后,2病原微生物肿瘤病因的检查,3免疫性疾病的诊断,4科学研究,3、抗原决定族抗原表位:,特殊的化学活性基团区域,二抗体:,1、定义 :机体受抗原刺激后,浆细胞产生的,,与相应抗原特异性反响的球蛋白免疫球蛋白:Ig。,2、根本结构:,一“Y字型的四肽链,重链(heavy chain, H):两条、完全相同,轻链(light chain, L):两条、完全相同,二硫键:连接四肽链。,二端:氨基端可变区,V区,羧基端恒定区,C区,1可变区 variable region, V :,Ig分子氨基端,Aa的组成和排列顺序有变异,决定了抗体结合的特异性。,2恒定区constant region, C :,Ig分子的羧基端,Aa组成和排列在同一动物种属中同类抗体比较恒定。具有免疫原性,同一种属动物对不同抗原产生的同类抗体,:,V,区,:,不同,,C,区,:,相同,免疫原性,:,相同。,抗体 抗抗体(二抗:种属特异性抗体),免疫,四、根本类型与原理,一直接法一步法,原理:,二间接法,原理:,三非标记抗体酶法,1,、酶桥法 :以第二抗体作桥,任何抗体都未标记,原理:,一抗和三抗来源于同一种属动物的同类抗体,2、PAP法peroxidase Antiperoxidase,过氧化物酶抗过氧化物酶法,原理:预先制备,PAP,复合物,一抗和,PAP,复合物中的抗体来源于同一种属动物的同类抗体,四亲和素-生物素法,亲和素-生物素过氧化物酶法Avidin Biotin Complex: ABC法,原理:预先制备ABC复合物,五、分类,:,按标记物的不同,免疫荧光组织化学,免疫酶,组织,化学,亲和免疫,组织,化学,免疫金,-,银,标记技术,免疫双重和多重,组织,化学,杂交免疫,组织,化学,六.根本过程,(1) 抗原的提取和纯化,(2)免疫动物或细胞融合,(3)抗体提取与效价检测,(4)标记抗体,(5)细胞与组织切片标本的制备,(6)免疫细胞化学反响和细胞化学显色,(7)观察和记录结果,第二章 组织学制片技术,一、定义和意义,二、方法,三、根本程序,四、免疫组织化学石蜡切片制作,一、定义和意义,一概念,将机体的组织、器官做成能在显微镜下观察的标本的技术,二意义,1,、是组织学、胚胎学、病理学等生命科学研究组织细胞的正常与病理,形态,结构的主要方法。,2,、是显示组织、细胞中某些,化学成分、基因,的,定位,分布和含量变化的不可缺少的手段。,二、制片方法,一非切片法:,1、定义:不经切片机切片手续制成标本的方法。,2、类型:,整装片胚胎:鸡胚,铺片柔软组织,涂片液体,磨片骨、牙,印片淋巴结,类型:非切片法、切片,2、类型:根据所用支持剂包埋剂的不同,分为:,石蜡切片,冰冻切片,火棉胶切片法,二切片法:,1、定义:用切片机(microtome) 切成微米厚的薄片,,制出标本切片的方法,三、根本程序,切片法,2,、冰冻切片,取材,冷冻,切片 染色 封片,1,、石蜡切片,取材 固定,脱水 透明 浸蜡 包埋,切片 染色 封片,一取材:从人或动物体内取下所需组织材料的过程,1,、材料来源,1人体材料:手术、活检、尸检,2动物材料,来源广泛,大多数动物组织结构与人体相似,有的结构比人类更典型,四、免疫组织化学石蜡切片制作,1麻醉:,吸入麻醉:将浸有乙醚或氯仿的棉球连同动物一起放入密闭容器内麻醉。,适用对象:小动物,缺点:乙醚麻醉:肺部充血、呼吸道分泌物增多,注射麻醉:静脉、肌肉或腹腔内注射,麻醉剂:3%戊巴比妥等,适用对象:较大动物,缺点:内脏淤血,2,、动物的致死方法,2空气栓塞:向动物静脉内注入一定的空气,适用对象:较大动物,如兔、犬,缺点:血管、内脏淤血,3断头:用剪刀剪去动物头部,适用对象:小动物,如青蛙、小鼠,4其他方法:击头法、断髓法、股动脉放血法等,3、致死原那么:,1选择适宜的致死方法:利于取材和观察,2快速致死,防止挣扎,4、取材本卷须知,1根据实验目的选择动物的种类:,肝脏猪肝、胃狗、卵巢猫2组织材料要新鲜:在心跳未停时即取材固定。 神经系统:10秒钟变性,消化系统上皮:15分钟自溶,亚细胞:变性更快。,5组织块大小适宜:结构完整,组织块:小、薄:,1cm 1cm 0.2cm,最厚不能超过0.5厘米,6修剪附带的其他组织,3选好部位和切面:,胃:胃底;胰腺:胰尾部; 肺:肺门,管性器官:横切,小肠环行皱襞:纵切,头皮:顺毛根纵切,肾脏:纵切包括皮质和髓质,4防止损伤组织:,防止手拽、有齿镊子夹、刀剪不锋利,8保持清洁:尤其是消化管,用生理盐水洗去血液、污物、粘液及食物残渣,7防止收缩变形,骨骼肌、神经在离体后:用木刺扎于木板上或将其两端用线捆于小棒上,二固定,1、概念:用化学试剂使蛋白质凝固或沉淀,保持其生活状态时的形态结构的过程。,固定剂液:用来固定的化学试剂。,2、目的,1防止自溶与腐败,2维持形态:使细胞内物质凝固或沉淀下来,保存各种抗原成份原有的结构,3利于切片:增加硬度,4利于鉴别和观察:使细胞内成分产生不同 的折光率,5利于染色:媒介作用,使细胞各部易于受色,3,、固定剂,1固定剂的必备特性,渗透力强,迅速使组织及细胞成分凝固或沉淀,不致使组织过度收缩与膨胀,能使组织获得较佳的折光率,2固定剂的种类,按作用原理分:,凝固性:甲醛,重铬酸钾,沉淀性:酒精、升汞等,按化学性质分,复原剂:醛类、醇类,氧化剂:锇酸、重铬酸钾,酸类:苦味酸、醋酸,单一固定剂:一种试剂组成,只对细胞的某种成分固定得较好,不能将所有的成分都保存下来,混合固定剂:两种以上的,试,剂组成,按组成成分,3常用单一固定剂的性质及用法,名称,福尔马林,甲醛,性质概要,1、无色、刺激味的液体。复原剂,凝固蛋白质。,2、保存脂类、糖,线粒体及高尔基体的固定剂。,3、硬化剂,冰冻切片的优良固定剂。,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,常用的单纯固定剂,对细胞的保存好。甲醛,能与任何比例的水、醇及乙醚混合。,渗透速度及小块组织2mm3固定时间,较快,412,小时,适度,可入,70%,酒精或水冲洗,对苏木素着色好,对伊红着色困难。,收缩与膨胀情况,收缩较小,脱水会使收缩变大,。,名称,性质概要,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,渗透速度及小块组织2mm3固定时间,重铬酸钾,1,、橙红色结晶体,有毒、氧化力极强,能溶于水,不溶于醇,凝固蛋白质,2,、保存类脂体,线粒体的固定剂,溶解染色质。,较快,,24,小时,在切片技术中是良好的药品,收缩与膨胀情况,起初收缩不显著,组织经酒精脱水会继续收缩,中等,用水冲洗,对酸性染料着色很好,4混合固定剂的优点及配制原那么,优点:取长补短,原那么:相互弥补 快+ 慢 胀+ 缩,(5)常用混合固定剂,A、F液酒精+ 甲醛,组成:无水酒精90毫升,40%甲醛10毫升,特点:简单、皮下组织铺片、肥大细胞固定好、对弹性纤维、胶原纤维染色好,Carnoy,液,组成:冰醋酸,1,份,氯仿,3,份,无水酒精,6,份,特点:快、用于糖原、神经细胞尼氏体、细胞内,DNA,、,RNA,固定。,Bouin,液,组成:饱和苦味酸水溶液,40%甲醛,冰醋酸。15:5:1,特点:常用,固定时间,1224,小时,适用于大多数组织,以细胞核、细胞分裂为好,对肾脏固定不好。现配现用,Zenker S,液,组成:重铬酸钾,2.5,克,升汞,5,克,蒸馏水,100,毫升,贮备液:棕色瓶保存,临用前加冰醋酸,5,毫升。,特点:常用,固定时间,1224,小时,水冲洗,加碘去汞,细胞核、细胞质染色好。,5固定的方法,灌注法:经血管途径将固定液灌注到所需要固定的器官超微结构,类型:心插管固定;股动脉插管灌注,浸泡法:组织直接浸泡在固定液中。,固定液的量:足够、组织块大小的1530倍,瓶底垫纱布,微波固定:固定的组织收缩小,蒸汽固定:防止可溶性成分在固定液中丧失,对人危害大,6组织固定后的变化,体积改变:胀或缩,酒精、升汞、苦味酸,缩小,重铬酸钾、醋酸,膨胀,硬度增加:,酒精、甲醛,增加多,锇酸、苦味酸,增加较少,抗张力增加,折光率增加,着色性增加,7固定本卷须知,标本大小适宜:组织块体积:,1cm 1cm 0.2cm,标本固定要及时,最好在低温下固定,固定液的选择要合理,固定液配制要新鲜(除贮存液外,要现配现用,固定液的量要足够:组织块大小的1530倍,瓶底垫纱布。,固定时间适当:防止太长、太短。,固定后要彻底冲洗,三洗涤和脱水,1,、洗涤,1目的,去除固定液,终止固定作用,,去除固定剂的重金属离子或颗粒,2原那么,什么配的固定剂就用什么洗苦味酸固定的,用低浓度乙醇洗,固定剂为酒精或酒精混合液可不洗,洗涤时固定时,特殊成分加特殊洗涤剂:脱黄70%乙醇,,碘酊脱贡固定液含升汞的,硫代硫酸钠脱碘,2,、脱水,1概念:用化学试剂将标本中的水置换出来的过程,2目的:,利于浸蜡水不能与石蜡等包埋剂混合,利于组织的永久保存水使组织分解,3脱水剂,脱水剂的特性,与,水,任意混合,也能与,透明剂,混合的液体,脱水剂的类型,单纯脱水剂,如:酒精、丙酮等,脱水兼透明的脱水剂,如:正丁醇等,最常用:酒精,缺点:组织硬化和变脆尤其是高浓度酒精。,4酒精脱水,原那么:,循序渐进,酒精浓度逐步增大,一般为,70% 80% 90% 95% 100%,柔软组织、胚胎组织,:30%,开始,暂不包埋的组织:70%80%的酒精保存,更换乙醇:吸水纸吸去组织块外表的水,脱水时间:组织种类、体积大小而定 (一般624小时,四 透明,2,、目的:便于浸蜡包埋,1,、定义:用一种既可与,脱水剂,相容又能和,石蜡,相容的物质置换脱水剂,组织块呈现透明状态。,3,、透明剂:透明所用的药剂,透明剂:,苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等,常用:二甲苯、香柏油,1二甲苯,优点:透明力强,作用快。,缺点:容易使组织收缩、变硬、变脆。,注意:先经1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液过度,再进二甲苯,二甲苯 可通过肉眼观察来决定时间。,透明过度,组织变脆,切片时易破碎,2香柏油,优点:组织收缩及硬化小,缺点:慢,12小时以上;香柏油透明后需浸二甲苯因不易被石蜡取代,问题:如果组织块在透明时,呈白色浑浊不透明状态,是何原因?,答:脱水不彻底所致。,五浸蜡与包埋,浸蜡:支持剂石蜡透入组织内部,置换透明剂的过程。,1,、浸蜡目的,置换透明剂,将软组织变为蜡块,以便切片。,软蜡,软蜡,硬蜡,硬蜡,30,40,分钟,30,40,分钟,20,30,分钟,20,30,分钟,2,、浸蜡过程,软蜡,硬蜡,3,、浸蜡注意点,选用适当熔点的蜡:南方硬蜡,北方软蜡 冬软,夏硬,充分透入,要使石蜡完全渗入细胞的每个局部,浸蜡时间不能太长,烤箱温度不可太高,否那么组织收缩变脆。,4,、包埋:浸透石蜡的组织块入新的石蜡中冷却凝固。,包埋:硬蜡,1包埋剂,石蜡:最常用,类型熔点不同:软蜡和硬蜡。,软蜡:熔点50 ,硬蜡:熔点50 ,2材料:L形金属包埋框,玻璃底版、酒精灯、小镊子,3包埋中注意要点,小尖镊不时烤热,标本切面方向朝下,标本间要有一定的距离,动作快,快速冷却:石蜡外表凝固,立即放入冷水中,4包埋后可能出现的问题,组织内空泡:脱水或透明或浸蜡不够。,组织外空泡:包埋动作太慢。,有空泡,5标本分块,修切蜡块:,正面:正方形或长方形,两边两两平行。,标本四周:1-2mm宽的石蜡,侧面:梯形,1,、切片前玻片的处理,清洁液泡,12,24h,自来水冲洗,蒸馏水洗,95,酒精浸泡,2h,烤干,防脱片处理,(多聚赖氨酸,),六切片,2,、切片机,分类,轮转切片机本室常用,刀固定,材料前进,主要用于石蜡切片,主要构造,载物台,持刀架,切片厚度调整器,推拉式切片机,材料固定,刀移动,主要用于火棉胶切片,2切片本卷须知:,刀片:锋利,切片机的螺丝:旋紧。,组织块的切面和切片刀间的夹角:5。,切片速度:均匀,石蜡切片正面朝上放与刀片接触的面为反面,3石蜡切片中常遇的问题及解决方法,蜡带变弯,刀锋锐不一致,蜡块四方不对称,蜡块与刀口不平行。,移动刀口位置,修整蜡块,调整刀或蜡块 。,蜡带上卷,刀不利,斜度大,蜡片太厚,蜡边留太少,硬度过大,室温过低。,磨刀,调刀角度,调片厚度,重包,加温。,蜡片起皱,刀不利,斜度过小,刀口不洁,,,蜡太软,室温过高。,磨刀,调刀角度,二甲苯擦,冰冻,降温。,蜡片有裂痕或划破,刀有缺口,蜡中有气泡或沙粒。,移动刀口位置,包埋前去气,滤蜡,问 题,原 因,解 决,组织与蜡别离,脱水、透明、浸蜡不够。,退回,选择适当时间。,蜡片厚薄不一,推进装置失灵,夹具松动,蜡块过大。,修理切片机,上紧夹具,取材宜小。,问 题,原 因,解 决,切片脆烂,高浓度酒精,透明,浸蜡太久,蜡温过高。,无法弥补,控制蜡温和浸蜡时间,。,4石蜡切片的详细过程,详细过程,步骤 本室 参考 时间,取材,固定,24,小时左右,洗涤 等于固定时,脱水:,70%,酒精,612,小时,80%,酒精,48,小时,95%,酒精, 24,小时,95%,酒精, 24,小时,100%,酒精, 12,小时,100%,酒精, 12,小时,1/2,纯酒精,+1/2,二甲苯,2030,分钟,透明:,二甲苯, 1530,分钟,二甲苯, 1530,分钟,浸蜡:,软蜡,3045,分钟,硬蜡,3045,分钟,包埋,切片,贴片温水捞片,烤片370C过夜,七脱蜡和水合:,脱蜡:二甲苯脱去石蜡切片的蜡,两次,水合水化、下行入水:,酒精浓度:逐步降底,100%酒精95%酒精80%酒精蒸馏水,八抗原修复,1,、原因:甲醛使蛋白质发生凝固,分子间会发生交联,2,、目的:抗原再现,3,、方法:酶消化、热诱导的抗原修复,1热诱导的抗原修复: 定义:高温、高压对石蜡切片进行抗原修复或复原。,修复方式:,a,微波,b,煮沸,c,高压锅。,2酶消化:去除覆盖于抗原决定簇外表的杂蛋白 断交联,蛋白酶的种类,0.05%,0.1,胰蛋白酶:细胞内抗原,0.4%,胃蛋白酶:细胞外基质内抗原,九封闭,原因,:,蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上,解决方法:,滴加第二抗体来源动物之非免疫血清,抗体稀释液中参加牛血清白蛋白,1、滴加抗体:抗体浓度要适宜的,2,、温育时间,: 37,0,C, 3060,分钟,湿盒中 ;,4,0,C,过夜,,呈色,十免疫染色,十一复染1目的:将机体组织细胞染上颜色,衬托出组织形态结构。2部位:染细胞核3复染剂:苏木素、甲基绿、核固红,4染料复染剂的特性,有颜色,与被染组织有亲和力,发色团:产生颜色的原子团,助色团:使染料对组织有亲和力的原子团。,发色团:,硝基,、,亚硝基、偶氮基,、羰基、烯基、醌型苯环,发色团多的染料,颜色深,助色团:, OH,、,COOH,、,NH,2,、,N,CH,3,CH,3,有色物:只有颜色,无亲和力,染料的分类,根据来源分类,天然:苏木素植物,胭脂红动物胭脂虫,人工合成:苦味酸,偶氮染料,根据化学反响分,酸性染料,碱性染料,酸性染料:酸性助色团 COOH,SO3H等,带负电荷。伊红,碱性染料:碱性助色团NH2、 NCH3等,,带正电荷。美兰、苏木素,中性染料:酸性、碱性助色团。瑞氏粉、姬姆萨,根据染色对象分,胞核染料:苏木素,胭脂红,胞浆染料:伊红、苦味酸,脂肪染料:苏丹,、,,油红,O,5染色原理,物理和化学综合作用,物理作用:,渗透作用:不牢固,吸附作用:,分子引力作用,色素粒子被吸附,吸收作用:牢固,化学作用,细胞主要成分:蛋白质,含,NH2 与酸性染料带负电荷,COOH 与碱性染料带正电荷,碱性,酸性,细胞核酸性物质多:与碱性染料亲和力强,细胞质碱性物质多:与酸性染料亲和力强,十二分化与封藏,1、分化分色,概念:把过染的局部褪至适当的程度,去掉不应着色的颜色。,对苏木素染色的组织分色,:,用,0.51%,的盐酸酒精。,分化剂脱色剂: 脱去切片上过染的颜色的试剂,以酸褪碱性染料,以碱褪酸性染料含碱的自来水,2、封藏固,1目的,防止退色、受潮、干裂及磨损等,使切片永久保存,2常用封藏固剂,干性常用:保存时间长,封固前:须脱水、透明,中性树胶液态或固态 廉价,加拿大树胶固态 较贵,香柏油 凝固太慢,水性:,甘油:液态,图象清晰度不佳,甘油明胶:固态,凝固性,不需脱水、透明,保存时间短,3封固本卷须知:,树胶不能搅拌,树胶量要适宜,标本外表二甲苯不能挥发干,盖玻片大小适宜:标本周围留2mm空白,封片时都防止产生气泡,十三免疫组化结果的观察和记录,1,、结果判断,:,阳性细胞的染色特征,(1),阳性细胞染色部位,:,胞浆,;,胞核,;,胞膜。胞浆:多,(3),阳性细胞分布:局灶性和弥漫性,(2),不同阳性细胞染色强度:不一。非特异染色:所有的细胞染色强度相同,(4),阳性染色细胞与阴性细胞:相互夹杂分布,;,非特异染色:累及一片细胞,(5),切片边缘、刀痕或皱褶区域、挤压的细胞以及结缔组织:假阳性,2,、对照,(1)阳性对照: 用抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫染色,对照切片:阳性,(2)阴性对照:用抗原阴性的切片与待检标本同时染色,对照切片:阴性.,(3)空白对照(替代对照): 用抗体稀释液替代第一抗体,结果:阴性.,(4),自身对照:同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。,结果:阴性或着色较浅,目的:排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。,3,、染色失败的原因,1全部切片都为阴性:,漏加一种抗体或抗体失效;,底物中过氧化氢量少或失效;,缓冲液中加叠氮钠,抑制酶活性;,复染使用不当,2所有切片均为弱阳性,抗体过浓或枯燥;,抗体温育时间过长;,呈色底物液变色或反响时间过长;,过氧化氢浓度过高,成色速度过快;,洗涤不彻底;黏附剂太厚,(3),所有切片背景过深,切片或涂片过厚,蛋白质封闭不够或所用血清溶血,使用全血清抗体稀释不够,底物成色反响过久,漂洗不够,4阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性:固定处理不当,4,、结果分析:,表中,1,5,结果无效,,6,、,7,结果可靠,(),(),(),(),(),(),(),检测标本含抗体,结果可靠,(),(),(),7,检测标本不含抗体,结果可靠,(),(),(),6,非特异染色,(),(),(),5,阳性对照不含定位抗原,(),(),(),4,阴性对照内含定位抗原,(,)(,),(),(),3,非特异性染色,(),(),(),2,抗体失活,操作有误,(),(),(),1,结果判断,检测结果,替代对照,阴性对照,阳性对照,免疫组织化学石蜡切片制作程序小结,取材 固定 洗涤,脱水 透明,浸蜡,包埋 切片 贴片 脱蜡,下行入水,染色,复染,脱水 透明,封片 观察记录,免疫,解答问题:来自丁香园论坛中,1.,我研究的因子是核蛋白,但是免疫组织化学做出来却是在胞浆表达,这是什么原因啊。求高手指教!,3.,各位见帖好,:,兄弟在做大鼠脑缺血,5,天后,,bFGF,表达的免疫组化, 但,无奈,背景非常深,几乎看不出阳性细胞的颜色 请高手们指点,谢谢,2.大家好,我做了免疫组织化学的实验,但就是不显色,刚开始以为是一抗的原因,但是后来又换了一坑,但还是不显色,这最可能是什么原因呢?先谢谢啦,
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