免疫组织化学概述与制片课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫组织化学Immunohistochemistry,参考教材 ?免疫组织化学实验技术及应用?主编：倪灿荣等,第一章 绪 论,目 录,一、定义和意义,二、开展简史,三、免疫学概念,四、根本类型与原理,五、种类,六、根本过程,一、免疫组织化学的定义及意义,1、定义,免疫组织化学(Immunohistochemistry)，又称免疫细胞化学(Immunocytochemistry)。,的标记抗体或抗原原位显示细胞或组织内的相应抗原或抗体的方法,进行定性、定量、定位检测。原理：抗原、抗体特异性结合,标记化学反响 酶或其他物质标记抗体,抗原-抗体反响 抗原-抗体复合物,呈色化学反响 底物在酶作用下产生有色物质,2、根本理论,组织化学呈色反应,颜色（原位）,3,、优点,高特异性,高敏感性,方法步骤统一,形态、机能与代谢相结合,可定性、定位与定量,4,、免疫组织化学的意义,1肿瘤诊疗,肿瘤组织起源诊断,肿瘤分型诊断,确定肿瘤的良恶性,确定转移性恶性肿瘤的原发部位,指导肿瘤的治疗、判断预后,2病原微生物肿瘤病因的检查,3免疫性疾病的诊断,4科学研究,3、抗原决定族抗原表位：,特殊的化学活性基团区域,二抗体:,1、定义 :机体受抗原刺激后，浆细胞产生的，,与相应抗原特异性反响的球蛋白免疫球蛋白：Ig。,2、根本结构:,一“Y字型的四肽链,重链(heavy chain, H)：两条、完全相同,轻链(light chain, L)：两条、完全相同,二硫键：连接四肽链。,二端:氨基端可变区，V区,羧基端恒定区，C区,1可变区 variable region, V ：,Ig分子氨基端，Aa的组成和排列顺序有变异，决定了抗体结合的特异性。,2恒定区constant region, C ：,Ig分子的羧基端，Aa组成和排列在同一动物种属中同类抗体比较恒定。具有免疫原性,同一种属动物对不同抗原产生的同类抗体,:,V,区,:,不同，,C,区,:,相同，免疫原性,:,相同。,抗体 抗抗体（二抗：种属特异性抗体）,免疫,四、根本类型与原理,一直接法一步法,原理：,二间接法,原理：,三非标记抗体酶法,1,、酶桥法 ：以第二抗体作桥，任何抗体都未标记,原理：,一抗和三抗来源于同一种属动物的同类抗体,2、PAP法peroxidase Antiperoxidase,过氧化物酶抗过氧化物酶法,原理：预先制备,PAP,复合物,一抗和,PAP,复合物中的抗体来源于同一种属动物的同类抗体,四亲和素-生物素法,亲和素-生物素过氧化物酶法Avidin Biotin Complex： ABC法,原理：预先制备ABC复合物,五、分类,:,按标记物的不同,免疫荧光组织化学,免疫酶,组织,化学,亲和免疫,组织,化学,免疫金,-,银,标记技术,免疫双重和多重,组织,化学,杂交免疫,组织,化学,六.根本过程,(1) 抗原的提取和纯化,(2)免疫动物或细胞融合,(3)抗体提取与效价检测,(4)标记抗体,(5)细胞与组织切片标本的制备,(6)免疫细胞化学反响和细胞化学显色,(7)观察和记录结果,第二章 组织学制片技术,一、定义和意义,二、方法,三、根本程序,四、免疫组织化学石蜡切片制作,一、定义和意义,一概念,将机体的组织、器官做成能在显微镜下观察的标本的技术,二意义,1,、是组织学、胚胎学、病理学等生命科学研究组织细胞的正常与病理,形态,结构的主要方法。,2,、是显示组织、细胞中某些,化学成分、基因,的,定位,分布和含量变化的不可缺少的手段。,二、制片方法,一非切片法：,1、定义：不经切片机切片手续制成标本的方法。,2、类型：,整装片胚胎：鸡胚,铺片柔软组织,涂片液体,磨片骨、牙,印片淋巴结,类型：非切片法、切片,2、类型：根据所用支持剂包埋剂的不同，分为：,石蜡切片,冰冻切片,火棉胶切片法,二切片法:,1、定义：用切片机(microtome) 切成微米厚的薄片，,制出标本切片的方法,三、根本程序,切片法,2,、冰冻切片,取材,冷冻,切片 染色 封片,1,、石蜡切片,取材 固定,脱水 透明 浸蜡 包埋,切片 染色 封片,一取材：从人或动物体内取下所需组织材料的过程,1,、材料来源,1人体材料：手术、活检、尸检,2动物材料,来源广泛,大多数动物组织结构与人体相似,有的结构比人类更典型,四、免疫组织化学石蜡切片制作,1麻醉：,吸入麻醉：将浸有乙醚或氯仿的棉球连同动物一起放入密闭容器内麻醉。,适用对象：小动物,缺点：乙醚麻醉：肺部充血、呼吸道分泌物增多,注射麻醉：静脉、肌肉或腹腔内注射,麻醉剂：3%戊巴比妥等,适用对象：较大动物,缺点：内脏淤血,2,、动物的致死方法,2空气栓塞：向动物静脉内注入一定的空气,适用对象：较大动物，如兔、犬,缺点：血管、内脏淤血,3断头：用剪刀剪去动物头部,适用对象：小动物，如青蛙、小鼠,4其他方法：击头法、断髓法、股动脉放血法等,3、致死原那么：,1选择适宜的致死方法：利于取材和观察,2快速致死，防止挣扎,4、取材本卷须知,1根据实验目的选择动物的种类：,肝脏猪肝、胃狗、卵巢猫2组织材料要新鲜：在心跳未停时即取材固定。 神经系统：10秒钟变性,消化系统上皮：15分钟自溶,亚细胞：变性更快。,5组织块大小适宜：结构完整，组织块：小、薄：,1cm 1cm 0.2cm,最厚不能超过0.5厘米,6修剪附带的其他组织,3选好部位和切面：,胃：胃底；胰腺：胰尾部； 肺：肺门,管性器官:横切，小肠环行皱襞:纵切,头皮:顺毛根纵切，肾脏:纵切包括皮质和髓质,4防止损伤组织：,防止手拽、有齿镊子夹、刀剪不锋利,8保持清洁：尤其是消化管,用生理盐水洗去血液、污物、粘液及食物残渣,7防止收缩变形,骨骼肌、神经在离体后：用木刺扎于木板上或将其两端用线捆于小棒上,二固定,1、概念：用化学试剂使蛋白质凝固或沉淀，保持其生活状态时的形态结构的过程。,固定剂液：用来固定的化学试剂。,2、目的,1防止自溶与腐败,2维持形态：使细胞内物质凝固或沉淀下来，保存各种抗原成份原有的结构,3利于切片：增加硬度,4利于鉴别和观察：使细胞内成分产生不同 的折光率,5利于染色：媒介作用，使细胞各部易于受色,3,、固定剂,1固定剂的必备特性,渗透力强,迅速使组织及细胞成分凝固或沉淀,不致使组织过度收缩与膨胀,能使组织获得较佳的折光率,2固定剂的种类,按作用原理分：,凝固性：甲醛，重铬酸钾,沉淀性：酒精、升汞等,按化学性质分,复原剂：醛类、醇类,氧化剂：锇酸、重铬酸钾,酸类：苦味酸、醋酸,单一固定剂：一种试剂组成,只对细胞的某种成分固定得较好，不能将所有的成分都保存下来,混合固定剂：两种以上的,试,剂组成,按组成成分,3常用单一固定剂的性质及用法,名称,福尔马林,甲醛,性质概要,1、无色、刺激味的液体。复原剂，凝固蛋白质。,2、保存脂类、糖，线粒体及高尔基体的固定剂。,3、硬化剂，冰冻切片的优良固定剂。,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,常用的单纯固定剂，对细胞的保存好。甲醛,能与任何比例的水、醇及乙醚混合。,渗透速度及小块组织2mm3固定时间,较快,412,小时,适度,可入,70%,酒精或水冲洗,对苏木素着色好，对伊红着色困难。,收缩与膨胀情况,收缩较小，脱水会使收缩变大,。,名称,性质概要,对染色的影响,固定后的处理,硬化程度,其他,渗透速度及小块组织2mm3固定时间,重铬酸钾,1,、橙红色结晶体，有毒、氧化力极强，能溶于水，不溶于醇，凝固蛋白质,2,、保存类脂体，线粒体的固定剂，溶解染色质。,较快，,24,小时,在切片技术中是良好的药品,收缩与膨胀情况,起初收缩不显著，组织经酒精脱水会继续收缩,中等,用水冲洗,对酸性染料着色很好,4混合固定剂的优点及配制原那么,优点：取长补短,原那么：相互弥补 快+ 慢 胀+ 缩,(5)常用混合固定剂,A、F液酒精+ 甲醛,组成：无水酒精90毫升，40%甲醛10毫升,特点：简单、皮下组织铺片、肥大细胞固定好、对弹性纤维、胶原纤维染色好,Carnoy,液,组成：冰醋酸,1,份，氯仿,3,份，无水酒精,6,份,特点：快、用于糖原、神经细胞尼氏体、细胞内,DNA,、,RNA,固定。,Bouin,液,组成：饱和苦味酸水溶液，40%甲醛，冰醋酸。15：5：1,特点：常用，固定时间,1224,小时，适用于大多数组织，以细胞核、细胞分裂为好，对肾脏固定不好。现配现用,Zenker S,液,组成：重铬酸钾,2.5,克，升汞,5,克，蒸馏水,100,毫升,贮备液：棕色瓶保存，临用前加冰醋酸,5,毫升。,特点：常用，固定时间,1224,小时，水冲洗，加碘去汞，细胞核、细胞质染色好。,5固定的方法,灌注法：经血管途径将固定液灌注到所需要固定的器官超微结构,类型：心插管固定；股动脉插管灌注,浸泡法：组织直接浸泡在固定液中。,固定液的量：足够、组织块大小的1530倍，瓶底垫纱布,微波固定：固定的组织收缩小,蒸汽固定：防止可溶性成分在固定液中丧失，对人危害大,6组织固定后的变化,体积改变：胀或缩,酒精、升汞、苦味酸,缩小,重铬酸钾、醋酸,膨胀,硬度增加：,酒精、甲醛,增加多,锇酸、苦味酸,增加较少,抗张力增加,折光率增加,着色性增加,7固定本卷须知,标本大小适宜：组织块体积：,1cm 1cm 0.2cm,标本固定要及时,最好在低温下固定,固定液的选择要合理,固定液配制要新鲜(除贮存液外，要现配现用,固定液的量要足够：组织块大小的1530倍，瓶底垫纱布。,固定时间适当：防止太长、太短。,固定后要彻底冲洗,三洗涤和脱水,1,、洗涤,1目的,去除固定液，终止固定作用，,去除固定剂的重金属离子或颗粒,2原那么,什么配的固定剂就用什么洗苦味酸固定的，用低浓度乙醇洗，固定剂为酒精或酒精混合液可不洗,洗涤时固定时,特殊成分加特殊洗涤剂：脱黄70%乙醇，,碘酊脱贡固定液含升汞的，硫代硫酸钠脱碘,2,、脱水,1概念：用化学试剂将标本中的水置换出来的过程,2目的：,利于浸蜡水不能与石蜡等包埋剂混合,利于组织的永久保存水使组织分解,3脱水剂,脱水剂的特性,与,水,任意混合，也能与,透明剂,混合的液体,脱水剂的类型,单纯脱水剂,如：酒精、丙酮等,脱水兼透明的脱水剂,如：正丁醇等,最常用：酒精，缺点：组织硬化和变脆尤其是高浓度酒精。,4酒精脱水,原那么：,循序渐进，酒精浓度逐步增大,一般为,70% 80% 90% 95% 100%,柔软组织、胚胎组织,:30%,开始,暂不包埋的组织:70%80%的酒精保存,更换乙醇:吸水纸吸去组织块外表的水,脱水时间：组织种类、体积大小而定 (一般624小时,四 透明,2,、目的：便于浸蜡包埋,1,、定义：用一种既可与,脱水剂,相容又能和,石蜡,相容的物质置换脱水剂，组织块呈现透明状态。,3,、透明剂：透明所用的药剂,透明剂：,苯、甲苯、二甲苯、香柏油、丁香油等,常用：二甲苯、香柏油,1二甲苯,优点：透明力强，作用快。,缺点：容易使组织收缩、变硬、变脆。,注意：先经1/2纯酒精+1/2二甲苯混合液过度，再进二甲苯，二甲苯 可通过肉眼观察来决定时间。,透明过度,组织变脆,切片时易破碎,2香柏油,优点：组织收缩及硬化小,缺点：慢，12小时以上；香柏油透明后需浸二甲苯因不易被石蜡取代,问题：如果组织块在透明时，呈白色浑浊不透明状态，是何原因？,答：脱水不彻底所致。,五浸蜡与包埋,浸蜡：支持剂石蜡透入组织内部，置换透明剂的过程。,1,、浸蜡目的,置换透明剂，将软组织变为蜡块，以便切片。,软蜡,软蜡,硬蜡,硬蜡,30,40,分钟,30,40,分钟,20,30,分钟,20,30,分钟,2,、浸蜡过程,软蜡,硬蜡,3,、浸蜡注意点,选用适当熔点的蜡：南方硬蜡，北方软蜡 冬软，夏硬,充分透入,要使石蜡完全渗入细胞的每个局部,浸蜡时间不能太长，烤箱温度不可太高，否那么组织收缩变脆。,4,、包埋：浸透石蜡的组织块入新的石蜡中冷却凝固。,包埋：硬蜡,1包埋剂,石蜡：最常用，类型熔点不同：软蜡和硬蜡。,软蜡：熔点50 ，硬蜡：熔点50 ,2材料：L形金属包埋框，玻璃底版、酒精灯、小镊子,3包埋中注意要点,小尖镊不时烤热,标本切面方向朝下，标本间要有一定的距离,动作快,快速冷却：石蜡外表凝固，立即放入冷水中,4包埋后可能出现的问题,组织内空泡：脱水或透明或浸蜡不够。,组织外空泡：包埋动作太慢。,有空泡,5标本分块,修切蜡块：,正面：正方形或长方形，两边两两平行。,标本四周:1-2mm宽的石蜡,侧面：梯形,1,、切片前玻片的处理,清洁液泡,12,24h,自来水冲洗,蒸馏水洗,95,酒精浸泡,2h,烤干,防脱片处理,（多聚赖氨酸,),六切片,2,、切片机,分类,轮转切片机本室常用,刀固定，材料前进，主要用于石蜡切片,主要构造,载物台,持刀架,切片厚度调整器,推拉式切片机,材料固定，刀移动,主要用于火棉胶切片,2切片本卷须知：,刀片:锋利，切片机的螺丝:旋紧。,组织块的切面和切片刀间的夹角:5。,切片速度:均匀,石蜡切片正面朝上放与刀片接触的面为反面,3石蜡切片中常遇的问题及解决方法,蜡带变弯,刀锋锐不一致，蜡块四方不对称，蜡块与刀口不平行。,移动刀口位置，修整蜡块，调整刀或蜡块 。,蜡带上卷,刀不利，斜度大，蜡片太厚，蜡边留太少，硬度过大，室温过低。,磨刀，调刀角度，调片厚度，重包，加温。,蜡片起皱,刀不利，斜度过小，刀口不洁,，,蜡太软，室温过高。,磨刀，调刀角度，二甲苯擦，冰冻，降温。,蜡片有裂痕或划破,刀有缺口，蜡中有气泡或沙粒。,移动刀口位置，包埋前去气，滤蜡,问 题,原 因,解 决,组织与蜡别离,脱水、透明、浸蜡不够。,退回，选择适当时间。,蜡片厚薄不一,推进装置失灵，夹具松动，蜡块过大。,修理切片机，上紧夹具，取材宜小。,问 题,原 因,解 决,切片脆烂,高浓度酒精，透明,浸蜡太久，蜡温过高。,无法弥补，控制蜡温和浸蜡时间,。,4石蜡切片的详细过程,详细过程,步骤 本室 参考 时间,取材,固定,24,小时左右,洗涤 等于固定时,脱水：,70%,酒精,612,小时,80%,酒精,48,小时,95%,酒精, 24,小时,95%,酒精, 24,小时,100%,酒精, 12,小时,100%,酒精, 12,小时,1/2,纯酒精,+1/2,二甲苯,2030,分钟,透明：,二甲苯, 1530,分钟,二甲苯, 1530,分钟,浸蜡：,软蜡,3045,分钟,硬蜡,3045,分钟,包埋,切片,贴片温水捞片,烤片370C过夜,七脱蜡和水合:,脱蜡:二甲苯脱去石蜡切片的蜡，两次,水合水化、下行入水：,酒精浓度：逐步降底,100%酒精95%酒精80%酒精蒸馏水,八抗原修复,1,、原因：甲醛使蛋白质发生凝固，分子间会发生交联,2,、目的：抗原再现,3,、方法：酶消化、热诱导的抗原修复,1热诱导的抗原修复： 定义：高温、高压对石蜡切片进行抗原修复或复原。,修复方式：,a,微波,b,煮沸,c,高压锅。,2酶消化：去除覆盖于抗原决定簇外表的杂蛋白 断交联,蛋白酶的种类,0.05%,0.1,胰蛋白酶：细胞内抗原,0.4%,胃蛋白酶：细胞外基质内抗原,九封闭,原因,:,蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上,解决方法:,滴加第二抗体来源动物之非免疫血清,抗体稀释液中参加牛血清白蛋白,1、滴加抗体：抗体浓度要适宜的,2,、温育时间,: 37,0,C, 3060,分钟,湿盒中 ；,4,0,C,过夜,，呈色,十免疫染色,十一复染1目的：将机体组织细胞染上颜色，衬托出组织形态结构。2部位：染细胞核3复染剂：苏木素、甲基绿、核固红,4染料复染剂的特性,有颜色,与被染组织有亲和力,发色团：产生颜色的原子团,助色团：使染料对组织有亲和力的原子团。,发色团：,硝基,、,亚硝基、偶氮基,、羰基、烯基、醌型苯环,发色团多的染料，颜色深,助色团：, OH,、,COOH,、,NH,2,、,N,CH,3,CH,3,有色物：只有颜色，无亲和力,染料的分类,根据来源分类,天然：苏木素植物，胭脂红动物胭脂虫,人工合成：苦味酸，偶氮染料,根据化学反响分,酸性染料,碱性染料,酸性染料：酸性助色团 COOH，SO3H等，带负电荷。伊红,碱性染料：碱性助色团NH2、 NCH3等，,带正电荷。美兰、苏木素,中性染料：酸性、碱性助色团。瑞氏粉、姬姆萨,根据染色对象分,胞核染料：苏木素，胭脂红,胞浆染料：伊红、苦味酸,脂肪染料：苏丹,、,，油红,O,5染色原理,物理和化学综合作用,物理作用：,渗透作用：不牢固,吸附作用：,分子引力作用，色素粒子被吸附,吸收作用：牢固,化学作用,细胞主要成分：蛋白质,含,NH2 与酸性染料带负电荷,COOH 与碱性染料带正电荷,碱性,酸性,细胞核酸性物质多：与碱性染料亲和力强,细胞质碱性物质多：与酸性染料亲和力强,十二分化与封藏,1、分化分色,概念：把过染的局部褪至适当的程度，去掉不应着色的颜色。,对苏木素染色的组织分色,:,用,0.51%,的盐酸酒精。,分化剂脱色剂: 脱去切片上过染的颜色的试剂,以酸褪碱性染料，以碱褪酸性染料含碱的自来水,2、封藏固,1目的,防止退色、受潮、干裂及磨损等，使切片永久保存,2常用封藏固剂,干性常用：保存时间长，封固前：须脱水、透明,中性树胶液态或固态 廉价,加拿大树胶固态 较贵,香柏油 凝固太慢,水性：,甘油：液态，图象清晰度不佳,甘油明胶：固态，凝固性,不需脱水、透明，保存时间短,3封固本卷须知：,树胶不能搅拌,树胶量要适宜,标本外表二甲苯不能挥发干,盖玻片大小适宜：标本周围留2mm空白,封片时都防止产生气泡,十三免疫组化结果的观察和记录,1,、结果判断,:,阳性细胞的染色特征,(1),阳性细胞染色部位,:,胞浆,;,胞核,;,胞膜。胞浆：多,(3),阳性细胞分布：局灶性和弥漫性,(2),不同阳性细胞染色强度：不一。非特异染色：所有的细胞染色强度相同,(4),阳性染色细胞与阴性细胞：相互夹杂分布,;,非特异染色：累及一片细胞,(5),切片边缘、刀痕或皱褶区域、挤压的细胞以及结缔组织：假阳性,2,、对照,(1)阳性对照: 用抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫染色,对照切片：阳性,(2)阴性对照:用抗原阴性的切片与待检标本同时染色,对照切片：阴性.,(3)空白对照(替代对照): 用抗体稀释液替代第一抗体,结果：阴性.,(4),自身对照：同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。,结果：阴性或着色较浅,目的：排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。,3,、染色失败的原因,1全部切片都为阴性：,漏加一种抗体或抗体失效；,底物中过氧化氢量少或失效；,缓冲液中加叠氮钠，抑制酶活性；,复染使用不当,2所有切片均为弱阳性,抗体过浓或枯燥；,抗体温育时间过长；,呈色底物液变色或反响时间过长；,过氧化氢浓度过高，成色速度过快；,洗涤不彻底；黏附剂太厚,(3),所有切片背景过深,切片或涂片过厚,蛋白质封闭不够或所用血清溶血,使用全血清抗体稀释不够,底物成色反响过久,漂洗不够,4阳性对照染色良好,检测的阳性标本呈阴性：固定处理不当,4,、结果分析：,表中,1,5,结果无效，,6,、,7,结果可靠,（）,（）,（）,（）,（）,（）,（）,检测标本含抗体，结果可靠,（）,（）,（）,7,检测标本不含抗体,结果可靠,（）,（）,（）,6,非特异染色,（）,（）,（）,5,阳性对照不含定位抗原,（）,（）,（）,4,阴性对照内含定位抗原,(,)(,),（）,（）,3,非特异性染色,（）,（）,（）,2,抗体失活，操作有误,（）,（）,（）,1,结果判断,检测结果,替代对照,阴性对照,阳性对照,免疫组织化学石蜡切片制作程序小结,取材 固定 洗涤,脱水 透明,浸蜡,包埋 切片 贴片 脱蜡,下行入水,染色,复染,脱水 透明,封片 观察记录,免疫,解答问题：来自丁香园论坛中,1.,我研究的因子是核蛋白，但是免疫组织化学做出来却是在胞浆表达，这是什么原因啊。求高手指教！,3.,各位见帖好,:,兄弟在做大鼠脑缺血,5,天后，,bFGF,表达的免疫组化， 但，无奈，背景非常深，几乎看不出阳性细胞的颜色 请高手们指点，谢谢,2.大家好，我做了免疫组织化学的实验，但就是不显色，刚开始以为是一抗的原因，但是后来又换了一坑，但还是不显色，这最可能是什么原因呢？先谢谢啦,