临床ELISA的基本原理资料课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,临床ELSA的基本原理和方法,临床ELSA的基本原理和方法,1,EL|SA的基本原理,EL|SA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫,结合反应为基础的固相吸附测定方法。因此,一个,ELISA测定试剂,其有机组成部分包括:(1)包被,的抗原或抗体的固相支持物,即聚苯乙烯塑料微孔或,试管;(2)酶标记的抗体或抗原和(3)酶的反应底,物等。抗原或抗体的固相化,并不影响其免疫结合活,性,酶标记的抗体或抗原亦是如此,并且标记酶的活,性不因标记过程而丧失。整个测定中,抗原与抗体的,结合反应在固相支持物上进行,反应结果的判断,以,酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标,准,显色或产生荧光或发光的强度,与临床标本中待,测物的浓度成正比或反比关系。目前国内的ELSA试,剂盒均以酶的显色反应来完成测定,EL|SA的基本原理,2,固相上抗原抗体相互作用的免疫化学,通常所提到的抗原与抗体的相互作用,一般指的是在液相状态下,而在固相状态,下,抗原与抗体的结合反应有其相应的特,点,主要表现在以下四个方面。,固相上抗原抗体相互作用的免疫化学,3,)固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态,下长,通常,固相免疫测定如ELSA中,抗原与抗体结合达到,平衡所需要的时间,较液相免疫测定要长,并随液体所占体,积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。当在微,孔板孔内进行免疫测定时,界面反应动,其对扩散作,用有很强的依赖性,扩散性越强,则反应所需时间越短,结,合越充分。这一点可通过旋转振荡来达到,微孔的旋转振荡,可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的,区域内。也可在微孔中放,性的塞子以使反应液体成为,个小体积,或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纟,维素,或使用微颗粒来做到这一点。微颗粒小于1m时,在,测定时即成胶体悬液,而当颗粒或珠较大时,则会在没有振,荡时,由于重力的作用而分开。所有上述方法均是通过减少,液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比,从而减少,固相免疫测定的扩散依赖,)固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态,4,二)固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相,测定,此处的反应体积并非是微孔中的液体体积,而是固相,免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分,这部,分体积到底有,难测定,但比反应,液体体积,要少得多。相抗原抗体反应发生于液体相界,能处于一级结合键的引力距离内,小于100A。液相中待,测抗原或抗体要进入到这个结合界面,需要经过扩散或质,量转移。微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多,因而处,抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。,反应的效率更,这也是全自动化免疫测定分,析仪均采用微颗粒固相的重要原,可参与结合反应,的抗体或抗原的浓度取决于可参与结合的反应体积,反应体积,从而难以使用通常的质量作用,抗体反应的Keq,值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性,二)固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相,5,(三)固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低,固相免疫测定中固相表面上抗原和抗体间的相互作用,类似于细胞,表面上蛋白与其受体间的结,表明,细胞表面上的蛋白与受体结,应的离,免疫测定,涉及到细胞表面受体的聚,由于多价复合物离解的减,合力增加。研,想的拉原和体也是成簇或集,的离解,呔其结佥所需的能昰要大表明在初始結拿键形成后,又形成了恣级结,的和来,或抗原,常以很高的浓度,使抗原和抗体有离解发,较液,种极缓慢的,使得ELSA和固相免疫测,测定的反复洗涤步骤,也可使受体配体,保持处于结合状态。,(三)固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低,6,(四)微孔内特异抗体免疫测定的亲和力依赖性,使用固相包被的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫测定,与液,相测定,相互作用的稳定,微孔内特异抗体的免疫测定亲和力依赖性和极,抗原浓度极,附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧失的结,由于固相吸附发,异拉体与甚结仓的亲和,/m浓度被动吸,的60-80%,的吸,在固相,就,500-800ng抗,m抗体的血清的,000稀释可提供大于10倍过量的,吸附,限性,不能解,结合的低亲和力,而更可能是由于,的丧失所致,(四)微孔内特异抗体免疫测定的亲和力依赖性,7,(五)固相的抗体或抗原与液相中的抗体或,抗原在构型上不一样,固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体,或抗原所展示的构型不一样,对抗体或抗原,由于固相化尤其是被动吸附或其它吸附方式,所致的构型改变已有众多的文献报道,(五)固相的抗体或抗原与液相中的抗体或,8,临床ELsA测定的常用模式,ELSA依其测定抗原和抗体的不同,测定模式有,很多,如直接法、间接法、双抗体夹心法(直接、,司接)、竞争抑制法(直接、夹心等)、捕获法,等4。在临床实验室,常用的ELSA测定模式有,双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑,制法和捕获法等。在抗原的测定上,蛋白大分子,抗原测定用的最多的模式是双抗体夹心法,而对,只有单个抗原表位的小分子,则使用竞争抑制法,抗体的测定通常使用间接法、双抗原夹心法、竞,争抑制法和捕获法等。,临床ELsA测定的常用模式,9,(一)抗原测定ELSA模式,1.双抗体夹心法对于含多个抗原表位的大分子蛋白,使用双抗体,lSA模式测定相当简便,现有的测蛋白抗原的商品试剂盒基本上,都采用此种测定模式。具体测定方法如下。,(1)首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中28下过夜包被聚苯乙烯,固相,形成固相,洗涤去除未与固相结合或结,牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭,洗涤去除未结合的部分及杂,(2)加入含待测物的临床样本如血清(浆)等,温育(通常为37,后,洗板;此时,待测抗原就会与固相上特异抗体结合而,吸附于固相,(3)加入酶标记的双抗体,温育(通常为37,定时间后,洗板;此时,在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。,(4)加入酶底物,温育(通常为37下)显色测定,(一)抗原测定ELSA模式,10,临床ELISA的基本原理资料课件,11,临床ELISA的基本原理资料课件,12,临床ELISA的基本原理资料课件,13,临床ELISA的基本原理资料课件,14,临床ELISA的基本原理资料课件,15,临床ELISA的基本原理资料课件,16,临床ELISA的基本原理资料课件,17,临床ELISA的基本原理资料课件,18,临床ELISA的基本原理资料课件,19,临床ELISA的基本原理资料课件,20,临床ELISA的基本原理资料课件,21,临床ELISA的基本原理资料课件,22,临床ELISA的基本原理资料课件,23,临床ELISA的基本原理资料课件,24,临床ELISA的基本原理资料课件,25,临床ELISA的基本原理资料课件,26,临床ELISA的基本原理资料课件,27,临床ELISA的基本原理资料课件,28,临床ELISA的基本原理资料课件,29,临床ELISA的基本原理资料课件,30,临床ELISA的基本原理资料课件,31,临床ELISA的基本原理资料课件,32,