免疫细胞分离试验课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免疫细胞分离和保存技术,免疫细胞分离和保存技术,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离试验课件,免疫细胞分离和保存技术,免疫细胞分离和保存技术,?,临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤,等疾病均可出现淋巴细胞或淋巴亚群的数量和功能的,变化。因此用体外方法对机体具有免疫反应的外周血,淋巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所显示的功,能的强弱进行检测，是判断机体细胞免疫水平的一种,重要手段。这对于临床认识疾病、探讨其发病机制、,观察病情变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等方,面均有重要意义。,免疫细胞分离和保存技术,?临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤等疾病均可出,免疫细胞分离和保存技术,?,用途,?,体外进行细胞免疫检测,?,要求,?,分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失,活性，同时也要求分离技术简单、操作方便,。,免疫细胞分离和保存技术?用途?体外进行细胞免疫检测?要求?分,?,原理,?,外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至,上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉,降速度也就不同。利用自然沉降法、密度梯度,离心法或二者结合，可以将淋巴细胞从血液中,分离出来。,免疫细胞分离和保存技术,?原理?外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一，两,?,常用方法：葡聚糖,-,泛影葡甲胺密度梯度离心法（,ficoll-,hypaque density gradient centrifugation,）。,?,分离特点,：分离纯度高，可达,95,，淋巴细胞约占,90,，,其中,T,淋巴细胞占,80,，,B,淋巴细胞占,4,10,。,?常用方法：葡聚糖-泛影葡甲胺密度梯度离心法（ficoll-,?,分离原理,：,ficoll-hypaque,混合溶液，又称淋,巴细胞分层液，血液中各有形成分的比重存,在差异，利用比重为,1.077,、近于等渗的,ficoll-hypaque,混合溶液（又称淋巴细胞分层,液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按,密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度,较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒,细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；,淋巴细胞密度稍低于分层液，故位于分层液,界面上，这样就可获得淋巴细胞。,?分离原理：ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细,一、免疫细胞分离,?,以豚鼠为例，讲解免疫细胞分离,实验及其具体步骤,一、免疫细胞分离?以豚鼠为例，讲解免疫细胞分离实验及其具体步,?,采血前的准备,?,用注射器取,3 ml,淋巴细胞分层液于一试管中,.,?,再用注射器吸取,ml,的阿氏液，并保存在注,射器中,一、免疫细胞分离,?采血前的准备?用注射器取3 ml淋巴细胞分层液于一试管中.,?,心脏采血,取血前应探明心脏搏动最强部,位，通常在胸骨左缘的正中，选心跳最,显的部位作穿刺。针头宜稍细长些，以,免发生手术后穿刺孔出血,.,因豚鼠身体较,小，一般可不必将动物固定在解剖台上，,而可由助手握住前后肢进行采血即可。,一、免疫细胞分离,?心脏采血取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘的正中,?,取豚鼠抗凝血,4,毫升，加,3,毫升,Hanks,液使之,稀释。加于,3,毫升淋巴细胞分层液液面之上,（,沿管壁轻轻加入，勿使两液相混,）。,一、免疫细胞分离,?取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫,?,2000,转,/,分离心,30,分钟，吸淋巴细胞层到,1.5ml,离心管中加,5,倍体积的,Hanks,液，然后,心（,1500,转,/,分离心,10,分钟）弃上清即成,。,?,重复离心一次,?,离心之前一定要配平,一、免疫细胞分离,?2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到1.5ml离心管,一、免疫细胞分离,一、免疫细胞分离,?,用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单个核细,胞，置于离心管中，用,anks,重复离心两次,（,1000r/min,离心,10min,），最后用,hanks,液,配成,1,10,7,个细胞,/ml,浓度的细胞悬液,.,一、免疫细胞分离,?用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单个核细胞，置于离心管中，,?,心脏采血,?,把采取的血液轻轻沿壁注入到试管中并轻轻,摇晃几次,二、家兔红细胞分离,?心脏采血?把采取的血液轻轻沿壁注入到试管中并轻轻摇晃几次,?,取家兔阿氏液混合的血液，以,Hanks,洗三次（,2000r/min,离心,10,分钟）。然后，将压积红细,胞用,Hanks,液配制成,1%,悬液。,二、家兔红细胞分离,?取家兔阿氏液混合的血液，以Hanks洗三次（2000r/m,三、免疫细胞的保存和活力测定,?,1,、分离细胞的保存,（,1,）短期保存,用含有,10%20%,灭活小牛血清的,Hanks,、,Tc-,199,、,RPMI,1640,培养液可保存数周,（,2,）长期保存及复苏,保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（,-196,),中保存。其,过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，,取沉积细胞用含有,10%,二甲亚砜的小牛血清配制成适当,浓度的细胞悬,液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡,站,( -80,),中，继而进行降温,(-196,),冷冻。,三、免疫细胞的保存和活力测定?1、分离细胞的保存（1）短期保,三、免疫细胞的保存和活力测定,?,复苏：将其从液氮中取出，立即放入,40,温水中，融化,后加入,10,倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再,悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。,2,、细胞活力的检测,常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正,常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜,通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝,色）。,三、免疫细胞的保存和活力测定?复苏：将其从液氮中取出，立即放,