分子诊断与临床--课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ppt课件,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,分 子 诊 断 与 临 床,1,ppt课件,分 子 诊 断 与 临 床1ppt课件,主要内容,概述,分子诊断的常用技术,分子诊断在临床的应用,分子诊断在应用中的问题及对策,分子诊断的发展方向,2,ppt课件,主要内容概述2ppt课件,检验医学,临床基础检验学,临床生化检验学,临床免疫检验学,临床微生物检验学,临床血液检验学,临床寄生虫学,临床分子诊断学,(,基因诊断,=PCR,?,),科研平台？,3,ppt课件,检验医学临床基础检验学3ppt课件,分子诊断学,以分子生物学理论为基础,利用分子生物学的技术和方法,研究人体内源性或外源性的生物大分子（如,DNA,、,RNA,和蛋白）和大分子体系的,存在,、,结构,或,表达调控的变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据,检验医学的分支学科之一,4,ppt课件,分子诊断学以分子生物学理论为基础4ppt课件,分子诊断学的研究对象,生物大分子,核酸：,DNA,、,RNA,蛋白,大分子体系,基因,细胞,组织,5,ppt课件,分子诊断学的研究对象生物大分子5ppt课件,临床学诊断,细胞核,DNA,转录,翻译,mRNA,蛋白质,血清学诊断,分子 诊 断,生化学诊断,临 床 表 现,细胞膜,不同诊断方法的研究对象,6,ppt课件,临床学诊断细胞核DNA转录翻译mRNA蛋白质血清学诊断分子,分子诊断的策略,遵循实验诊断学的基本原则,不同疾病及病因采用不同方法,根据检测目的开展不同层次的检测,注重环境基因组学研究成果,发挥在耐药性方面的潜在作用,在疾病预测、健康检查、个体化治疗中的作用,关注分子诊断中的医学论理和生物安全问题,开发简便、快速、准确、特异、灵敏的方法,7,ppt课件,分子诊断的策略遵循实验诊断学的基本原则7ppt课件,二、分子诊断的主要技术,低通量技术,DNA,分析：,Southern blot,、,PCR,、,RFLP,、,ASO,、,SSCP,、,DGGE,、,DHPLC,、,DNA,含量测定,染色体分析：,FISH,、,CGH,RNA,分析：,ISH,、,Northern blot,、,RT-PCR,蛋白质分析：,IHC,、,Western blot,8,ppt课件,二、分子诊断的主要技术低通量技术8ppt课件,高通量技术,核酸测序技术,基因诊断的金标准,生物芯片,(,基因芯片,),技术,蛋白质组学技术,2-DE,质谱技术：,MALDI-TOF,组织芯片,蛋白质组信息学,9,ppt课件,高通量技术9ppt课件,RLFP,原理,10,ppt课件,RLFP原理10ppt课件,FISH,NTERT-1,与人着丝粒,DNA,片段杂交（,绿,），与人端粒,DNA,片段杂交（,红,）,11,ppt课件,FISH 11ppt课件,二、几种常用的分子诊断技术,核酸扩增,分子克隆,核酸分子杂交,DNA,测序,单核苷酸多态性分析技术,生物芯片技术,蛋白质组学技术,生物信息学,12,ppt课件,二、几种常用的分子诊断技术核酸扩增12ppt课件,1,、,PCR,体外核酸扩增,生物技术领域最重要四项技术之一,细胞整合技术,分子克隆技术,蛋白工程技术,13,ppt课件,1、PCR体外核酸扩增13ppt课件,模板,DNA,94,变性,55,退火,72,引物延伸,第二次循环,模板变性退火,延伸,经,25-30,次循环，目的,DNA,增加,10,6-7,PCR,原理示意图,14,ppt课件,模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板,2,、分子克隆,（基因克隆，基因重组）,基本步骤,分,切,接,转,筛,含重组子的阳性克隆,DNA,重组体,连,载体,+,目的基因,转化、筛选和鉴定阳性克隆,+,受体细胞,全基因,分,切,筛,转,15,ppt课件,2、分子克隆（基因克隆，基因重组）含重组子的阳性克隆DNA重,3,、核酸分子杂交,定义,不同来源的、具有互补序列的两条核酸单链,在一定条件下通过碱基配对原则形成双链的过程,分子杂交技术的理论基础,DNA,（,RNA,）的变性与复性,16,ppt课件,3、核酸分子杂交定义16ppt课件,核酸分子杂交,基本类型,Southern,杂交,-,待测核酸是,DNA,片段,Northern,杂交,-,待测核酸是,RNA,片段,衍生类型：斑点杂交、原位杂交 等,17,ppt课件,核酸分子杂交基本类型17ppt课件,Southern,blot,操作,流程,18,ppt课件,Southern18ppt课件,19,ppt课件,19ppt课件,斑点杂交示意图,20,ppt课件,斑点杂交示意图 20ppt课件,4,、,DNA,测序,已知序列的验证性测序策略,未知序列的从头测序策略,随机测序法,（,鸟枪法,、,人工转座子法,）,定向测序法,（,引物测序法,、,互套缺失法,）,全基因组测序策略,21,ppt课件,4、DNA测序已知序列的验证性测序策略 21ppt课件,DNA,测序常用技术,链末端终止法（,Sanger,法,）,化学降解法,测序新技术,MALDI-TOF MS,杂交测序法,焦磷酸测序技术,原子探针显微镜法,单分子测序技术,自动化测序,-,常规应用,22,ppt课件,DNA测序常用技术链末端终止法（ Sanger法）22ppt,链末端终止法测序原理,化学降解法测序原理,23,ppt课件,链末端终止法测序原理化学降解法测序原理23ppt课件,自动化测序,充分体现,DNA,序列自动化分析技术的简单、安全、精确、并行和高效等特点,目前，自动化测序已成为,DNA,序列分析的主流，几乎完全取代了手工测序,类型：,基于,单一荧光染料,标记的自动化测序系统,基于,多种荧光染料,标记的自动化测序系统,24,ppt课件,自动化测序充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、安全、精确,单荧光,多荧光（四荧光）,25,ppt课件,单荧光多荧光（四荧光）25ppt课件,377,型,DNA,全自动测序仪,26,ppt课件,377型DNA 全自动测序仪26ppt课件,5,、单核苷酸多态性分析技术,SNP,：第三代遗传标志，是决定人类疾病易感性和药物反应差异性的主要因素,SNP,检测技术基本步骤,靶序列的扩增,SNP,特异位点的区分,方法：杂交、,PCR,、分子构象、酶法等,数据的检测分析,方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、,质谱分析 等,27,ppt课件,5、单核苷酸多态性分析技术SNP：第三代遗传标志，是决定人类,主要的,SNP,检测方法,凝胶电泳分析技术,SSCP,、,TTGE,、,TGGE,、,DGGE,分子杂交技术,ASO,、,DASH,、,PNA,杂交、,LNA,杂交,荧光共振能量转移,Taqman,探针技术、分子信标技术、,蝎状探针技术、替代探针技术,28,ppt课件,主要的SNP检测方法凝胶电泳分析技术28ppt课件,PCR-SSCP,29,ppt课件,PCR-SSCP29ppt课件,6,、生物芯片技术,技术的核心：杂交技术,实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对）,步骤：,已知物质点样（阵列）,加标记的待测样品，杂交,检测,数据分析、处理,优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化,缺点：只能检测已知的大分子,不能发现未知的大分子,30,ppt课件,6、生物芯片技术技术的核心：杂交技术30ppt课件,应用,核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基因测序、基因图谱制作、多态性分析）、,药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定,主要类型,基因（,DNA,）芯片,RNA,芯片,蛋白质芯片,细胞芯片,组织芯片,芯片实验室,(Lab-on-a-chip,),31,ppt课件,应用31ppt课件,6400,点的基因芯片,（面积,12,14 mm),32,ppt课件,6400点的基因芯片32ppt课件,7,、蛋白质组学,蛋白质组,：一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。,蛋白质组学,：从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功能与细胞生命活动规律的相互关系。,研究对象的整体性,研究目标的动态性,体现生命的复杂性,33,ppt课件,7、蛋白质组学蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基因所,蛋白质组学,研究范畴：,蛋白质与蛋白质间的相互作用,蛋白质与核酸间相互作用,蛋白质及其组成质点的分离、分析与鉴定,蛋白质结构分析,生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质表达差异,丰富与完善蛋白质信息库,34,ppt课件,蛋白质组学研究范畴：34ppt课件,蛋白质组学的常用分析技术,从技术层面来讲的，它是一门综合的分析技术，主要有,3,个方向为蛋白质组学研究提供技术平台。,蛋白质组分离技术,：双向电泳（,2-DE,）,蛋白质组鉴定技术,：图像分析技术、微量测序、 蛋白质质谱、 氨基酸分析,蛋白质组数据库的建立和生物信息学,35,ppt课件,蛋白质组学的常用分析技术从技术层面来讲的，它是一门综合的分析,2-DE,36,ppt课件,2-DE36ppt课件,酵母双杂交技术的原理,37,ppt课件,酵母双杂交技术的原理37ppt课件,8,、生物信息学,概念：,以,数学、信息学、计算机学为主要手段，,以,计算机硬件、软件和网络为主要工具，,对,巨量的数量进行处理、存储、分配和解释，成为具有明确生物学意义的生物信息，,并,通过对生物信息的查询、搜索、比较和分析实现其研究目标（基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律律） ，,解释,生命的遗传语言，探索生命起源、生物进化的基本规律，,探索,细胞、器官和个体发生、发育、衰亡等生命科学中的重大问题。,研究对象：生物学数据,研究核心：基因组信息学,38,ppt课件,8、生物信息学概念：以数学、信息学、计算机学为主要手段，以计,生物信息学,广义：使用数学和信息学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的,生物数据和资料,的一门学科。,狭义：主要指,基因组信息学,，即以计算机和互联网为主要手段，采用计算机学和数学处理,DNA,及其编码的大分子物质的信息，寻找其规律性。,流程：,建立数据库，将获得的物质信息进行比较,39,ppt课件,生物信息学广义：使用数学和信息学的观点、理论和方法去研究生命,现有的数据库,基因组数据库,人类基因组数据库：,NCBI genome,、,GDB,、,Ensembl,、,Genatlas,模式生物基因组数据库：,SGD,、,MGI,核酸序列数据库：,GeneBank,、,EMBL-DNA,、,DDBJ,、,Unigene,、,HGMD,蛋白质数据库：,PIR,、,SWISS-PORT,结构数据库：,PDB,、,SCOP,、,CATH,、,COG,功能数据库：,KEGG,、,DIP,、,TRRD,、,ASDB,40,ppt课件,现有的数据库基因组数据库40ppt课件,中国生物信息数据库,中国国家生物医学数据库,中国核酸序列数据库,中国核酸序列数据库,中国人核酸序列统计数据库,41,ppt课件,中国生物信息数据库中国国家生物医学数据库41ppt课件,三、分子诊断在临床的应用,单基因疾病的分子诊断,多基因疾病的分子诊断,肿瘤的分子诊断与预测,感染性疾病的分子诊断,在耐药性研究中的价值,在个体化治疗中的应用,分子诊断在临床的其他应用,42,ppt课件,三、分子诊断在临床的应用单基因疾病的分子诊断42ppt课件,1,、单基因疾病的分子诊断,血红蛋白病的分子诊断,肌营养不良症的分子诊断,血友病的分子诊断,1,抗胰蛋白酶缺乏症的分子诊断,Lebers遗传性视神经病变的分子诊断,其他单基因疾病的分子诊断,43,ppt课件,1、单基因疾病的分子诊断血红蛋白病的分子诊断43ppt课件,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,谷氨酸,(G,A,N),缬氨酸,(G,U,N),HbA HbS,44,ppt课件,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析谷氨酸(GAN),镰状红细胞贫血基因组的,PCR-RFLP,电泳图,45,ppt课件,镰状红细胞贫血基因组的PCR-RFLP电泳图45ppt课件,DMD,基因缺失的多重,PCR,诊断。共采用,9,对引物，可见患者（,P,）有电泳带的缺失。,46,ppt课件,DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者（P,2,、多基因疾病的分子诊断,糖尿病的分子诊断,家族性高脂血症的分子诊断,高血压的分子诊断,支气管哮喘的分子诊断,皮肤的复杂疾病,其他：,冠心病、动脉粥样硬化、胃及十二指肠溃疡、精神分裂症、风湿病、癫痫、甲亢、唇裂、腭裂等。,47,ppt课件,2、多基因疾病的分子诊断糖尿病的分子诊断其他：冠心病、动脉粥,遗传病的基因诊断方法选择原则,48,ppt课件,遗传病的基因诊断方法选择原则48ppt课件,3,、肿瘤的分子诊断与预测,肿瘤的分子分类与分期,肿瘤的分子标志,肿瘤的分子诊断,肿瘤的分子预测,49,ppt课件,3、肿瘤的分子诊断与预测肿瘤的分子分类与分期49ppt课件,肿瘤的分子标志,50,ppt课件,肿瘤的分子标志50ppt课件,肿瘤基因的分子诊断,肿瘤的早期诊断和筛选,肿瘤的疗效监测,肿瘤的预后判断,肿瘤微转移检测,主要方向,51,ppt课件,肿瘤基因的分子诊断肿瘤的早期诊断和筛选主要方向51ppt课件,4,、感染性疾病的分子诊断,诊断途径：,感染性病原体的分子诊断,感染性病原体的分型检测,感染性病原体的耐药监测,人感染性疾病的易感基因检测,感染组学,-,对感染性疾病的总体性和综合性研究,52,ppt课件,4、感染性疾病的分子诊断诊断途径：52ppt课件,感染性疾病的分子诊断,分子诊断方法,核酸杂交技术,核酸扩增技术,基因定量诊断技术,基因芯片技术,蛋白质组学技术,53,ppt课件,感染性疾病的分子诊断分子诊断方法53ppt课件,感染性疾病的分子诊断,目前主要的应用,病毒的分子检测,细菌感染的分子检测,衣原体的分子检测,支原体的分子检测,螺旋体的分子检测,原虫的分子检测,54,ppt课件,感染性疾病的分子诊断目前主要的应用54ppt课件,5,、分子诊断在耐药性研究中的应用,微生物耐药性的研究,耐药基因的检测与分析,PCR,、,PCR-SSCP,、,PCR-RFLP,、核酸杂交、,FQ-PCR,、基因芯片等,耐药菌株的鉴定与分析,质粒谱,DNA,指纹分析、,DNA,的特异性位点分析、全基因,DNA,指纹、基因芯片,55,ppt课件,5、分子诊断在耐药性研究中的应用微生物耐药性的研究55ppt,分子诊断在耐药性研究中的应用,肿瘤的多药耐药基因的检测与分析,主要的MDR基因,mdr1-p-蛋白,MRP-多药耐药相关蛋白,LRP-肺耐药相关蛋白,Topo,-DNA拓扑异构酶,同工酶,GSTp1-谷胱甘胱S-转移酶P1-1同工酶,56,ppt课件,分子诊断在耐药性研究中的应用肿瘤的多药耐药基因的检测与分析5,6,、在个体化医疗中的应用,个体化医疗,个体化医疗的前提,药物基因组学与个体化用药,肿瘤的个体化治疗,57,ppt课件,6、在个体化医疗中的应用个体化医疗57ppt课件,7,、分子诊断的其他应用,在移植配型中的应用,在法医学中的应用,在产前诊断中的应用,在新生儿筛查中的应用,在预防医学检验中的应用,58,ppt课件,7、分子诊断的其他应用在移植配型中的应用58ppt课件,RFLP,在法医学中的应用,59,ppt课件,RFLP在法医学中的应用59ppt课件,四、分子诊断在应用中的问题及对策,在感染性疾病检测中的问题与对策,易感基因诊断中的问题与对策,肿瘤的分子诊断和预测的问题与对策,分子诊断中的伦理问题,分子诊断中的质量问题与标准化,60,ppt课件,四、分子诊断在应用中的问题及对策在感染性疾病检测中的问题与对,1.,在感染性疾病检测中的问题与对策,问题：,病原微生物日益复杂,新病原体的出现,耐药株的出现,对策：,开发快速、准确、特异、灵敏的新方法,新方法与传统方法、实验室检查与临床表现结合,多种方法联合应用,开发新方法，加强耐药性检测,利用人易感基因检测进行诊断（如,SNP,）,61,ppt课件,1. 在感染性疾病检测中的问题与对策问题：61ppt课件,2,、易感基因诊断中的问题与对策,问题：,遗传异质性,多因素复杂性,假阳性,存在拟表型,各种因素导致的误导,62,ppt课件,2、易感基因诊断中的问题与对策问题：62ppt课件,易感基因诊断中的问题与对策,对策,提高关联性检测的可能性,选择单体型作为标志,利用,LD,、,tagSNP,和单体型进行关联研究,采用大样本研究提高关联研究的效应,同时检测多个遗传标志,根据环境因素和多基因因素进行分析,63,ppt课件,易感基因诊断中的问题与对策对策63ppt课件,利用易感基因进行健康预测的问题,单基因疾病：检测相关基因或染色体畸变做健康预测，或产前诊断,-,可信的,易 感 基 因 ：,只能作有限的参考,原因：,易感基因的研究和检测技术正处发展过程中,并非所有疾病都可以预测,现阶段发现的部分疾病的易感基因还难以直接应用于临床治疗和预防,64,ppt课件,利用易感基因进行健康预测的问题单基因疾病：检测相关基因或染色,3,、肿瘤分子诊断的问题与对策,癌基因的激活、抑癌基因的失活（或缺失）,原癌基因,细胞癌基因,病毒癌基因,生长因子及受体、蛋白激酶、转录因子等,肿瘤抑制基因,肿瘤转移相关基因,肿瘤耐药基因 等,65,ppt课件,3、肿瘤分子诊断的问题与对策癌基因的激活、抑癌基因的失活（或,癌基因或抑癌基因在正常细胞的基因组中,存在,表达,/,不表达状态,表达程度,肿瘤标志的特异性,易感基因的关联性,肿瘤分子诊断的问题与对策,66,ppt课件,癌基因或抑癌基因在正常细胞的基因组中肿瘤分子诊断的问题与对策,4,、分子诊断中的伦理问题,医学论理学的一般原则：,有利、无害、公正、尊重,遗传服务：一种面向社会的应用遗传技术的医学实践,需遵守医学伦理学,实施依赖于分子诊断技术,内 容：遗传咨询、遗传检查、遗传筛查、,基因治疗、辅助生殖等,主要途径：基因检查、染色体检查,个人遗传信息的不当使用 遗传歧视,67,ppt课件,4、分子诊断中的伦理问题医学论理学的一般原则：67ppt课件,5,、分子诊断中的质量问题和标准化,分子诊断实验室的质量管理,一般实验室的质量管理,特殊性的质量管理,高技术性,高严谨性,高污染性,分子诊断实验的标准化,68,ppt课件,5、分子诊断中的质量问题和标准化分子诊断实验室的质量管理68,五、分子诊断的发展方向,DNA DNA,及其表达产物（,mRNA,和蛋白）,单一技术 多项技术的有机组合,定性诊断 半定量和定量诊断,治疗性诊断 疾病的预防、预测性分析,诊断技术由常规方法 生物芯片和蛋白质组学,范围由单基因疾病、感染性疾病 多基因疾病,应用范围由疾病的诊断、治疗 生命科学、环境学等领域,69,ppt课件,五、分子诊断的发展方向DNA DNA及其表,