EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达与检测课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,*,EGFP,在,E,.coli,中的表达与检测,3,组,EGFP在E.coli中的表达与检测,1,一,二,三,四,五,背景介绍,实验流程,实验步骤,预期结果,参考文献,contents,一二三四五背景介绍实验流程实验步骤预期结果 参考文献cont,2,第几章,一、背景介绍,1,、绿色荧光蛋白（,GFP,）,2,、质粒,3,、大肠杆菌表达载体及表达系统,4,、,SDS-PAGE,原理及蛋白分离与检测,第几章一、背景介绍1、绿色荧光蛋白（GFP）,3,1,-,绿色荧光蛋白,1.1,发现,下村修,马丁,-,查尔菲,钱学健,发现,GFP,发光的遗传标签,科研,1 -绿色荧光蛋白1.1发现下村修马丁-查尔菲钱学健发现G,4,1,-,绿色荧光蛋白（,GFP,）,1.1,发现,1 -绿色荧光蛋白（GFP）1.1发现,5,GFP,的,分子质量为,26 kDa,，,晶体结构,如左图所示。,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，,长,420 nm,，宽,240 nm,，由,11,个围绕中心,螺旋的反平行,折叠组成，荧光基团的形成就是从,该,螺旋开始，桶的顶部由,3,个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第,65,67,位的,“,丝氨酸,-,酪氨酸,-,甘氨酸,”,自身环化和氧化形成。,1,-,绿色荧光蛋白（,GFP,）,1.2,特性,GFP 的分子质量为26 kDa，晶体结构如左图所示。蛋白质,6,GFP,在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为,395 nm,，另一小吸收峰为,470 nm,，最大发射峰为,505 nm,。,1,-,绿色荧光蛋白,1.2,特性,GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395 nm，另,7,1,-,绿色荧光蛋白,1.2,特性,优点：易于检测，荧光稳定，无毒害，通用性，易于构建载体，活细胞观察,1 -绿色荧光蛋白1.2特性优点：易于检测，荧光稳定，无毒,8,1,-,绿色荧光蛋白,1.3,应用,1 -绿色荧光蛋白1.3应用,9,2,-,质粒,2.1,pEGFP-N3,质粒,2 -质粒2.1pEGFP-N3质粒,10,2,-,质粒,2.1.1,pEGFP-N3,质粒描述,pEGFP-N3 encodes a red-shifted variant of wild-type GFP (13) which has been optimized for brighter fluorescence and higher expression in mammalian cells. (Excitation maximum = 488 nm; emission maximum = 507 nm.) pEGFP-N3 encodes the GFPmut1 variant (4) which contains the double-amino-acid substitution of Phe-64 to Leu and Ser-65 to Thr. The coding sequence of the EGFP gene contains more than 190 silent base changes which correspond to human codon-usage preferences (5). Sequences flanking EGFP have been converted to a Kozak consensus translation initiation site (6) to further increase the translation efficiency in eukaryotic cells. The MCS in pEGFP-N3 is between the immediate early promoter of CMV (PCMV IE) and the EGFP coding sequences. Genes cloned into the MCS will be expressed as fusions to the N terminus of EGFP if they are in the same reading frame as EGFP and there are no intervening stop codons. SV40 polyadenylation signals downstream of the EGFP gene direct proper processing of the 3 end of the EGFP mRNA. The vector backbone also contains an SV40 origin for replication in mammalian cells expressing the SV40 T-antigen. A neomycin resistance cassette (Neor), consisting of the SV40 early promoter, the neomycin/kanamycin resistance gene of Tn5, and polyadenylation signals from the Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV TK) gene, allows stably transfected eukaryotic cells to be selected using G418. A bacterial promoter upstream of this cassette expresses kanamycin resistance in E. coli. The pEGFP-N3 backbone also provides a pUC origin of replication for propagation in E. coli and an f1 origin for single-stranded DNA production.,2 -质粒2.1.1pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N,11,2,-,质粒,2.1.2,pEGFP-N3,质粒应用,Fusions to the N terminus of EGFP retain the fluorescent properties of the native protein allowing the localization of the fusion protein in vivo . The target gene should be cloned into pEGFP-N3 so that it is in frame with the EGFP coding sequences, with no intervening in-frame stop codons. The inserted gene should include the initiating ATG codon. The recombinant EGFP vector can be transfected into mammalian cells using any standard transfection method. If required, stable transformants can be selected using G418 (7). pEGFP-N3 can also be used simply to express EGFP in a cell line of interest (e.g., as a transfection marker).,2 -质粒2.1.2pEGFP-N3质粒应用Fusions,12,2,-,质粒,2.1.3,pEGFP-N3,质粒图谱,675bp,1394bp,2 -质粒2.1.3pEGFP-N3质粒图谱675bp1,13,pEGFP-N3,质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达,EGFP,融合蛋白的质粒，它编码,GFPmut1,突变体，发生了两个氨基酸的替换。,2,-,质粒,2.1.4,pEGFP-N3,的,EGFP,Leu,Phe-64,Ser-65,Thr,荧光强度增加了,35,倍,pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP,14,2,-,质粒,2.1.5,编码,EGFP,的基因片段,675,1394bp,长度,720 bp,651 GCGGGCCCGGGATCCATCGCCACC,A,TGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT700,701 CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC750,751 ACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG800,801 CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCC850,851 CACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC900,901 CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC950,951 TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC1000,1001 CCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGC1050,1051 TGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG1100,1101 GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA1150,1151 GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA1200,1201 GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC1250,1251 CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG1300,1301 CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA1350,1351 CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA,A,GCGGC1400,1401 CGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTT1450,2 -质粒2.1.5编码EGFP的基因片段 675139,15,2,-,质粒,2.2,pET28a,质粒,2 -质粒2.2pET28a质粒,16,2,-,质粒,2.2.1,pET28a,质粒描述,The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal HisTag/ thrombin/ T7Tag configuration plus an optional C-terminal HisTag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).,2 -质粒2.2.1pET28a质粒描述The pET-2,17,2,-,质粒,2.2.2,pET28a,质粒图谱,卡那霉素抗性,2 -质粒2.2.2pET28a质粒图谱卡那霉素抗性,18,2,-,质粒,2.2.2,pET28a,质粒图谱,2 -质粒2.2.2pET28a质粒图谱,19,3,-,大肠杆菌表达载体及表达系统,3.1,表达系统,常见的大肠杆菌表达系统如下：,T7,表达系统：,T7,噬菌体,RNA,聚合酶能选择性的激活,T7,噬菌体启动子的转录，其,mRNA,合成速率相当于大肠杆菌,RNA,聚合酶的,35,倍,Lac,表达系统是,-,半乳糖甘酶编码基因,lac Z,的转录的调控序列，该启动子可以被,IPTG,诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。,Tac,表达系统是一种由,Lac,和,Trp,启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被,IPTG,诱导,PL,表达系统是负责,DNA,分子转录的启动子之一，是一种很强的启动子,一个完整的大肠杆菌表达系统至少要由表达载体和宿主菌两部分构成。,3 -大肠杆菌表达载体及表达系统3.1表达系统常见的大肠杆菌,20,3,-,大肠杆菌表达载体及表达系统,3.2,大肠杆菌表达体系,大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：,易于生长和控制；,用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；,有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。,3 -大肠杆菌表达载体及表达系统3.2大肠杆菌表达体系大肠杆,21,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：,3,-,大肠杆菌表达载体及表达系统,3.3,原核表达载体,选择标志的编码序列,可控转录的启动子,转录调控序列,(,转录终止子，核糖体结合位点,),一个多限制酶切位点接头,宿主体内自主复制的序列,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：3,22,3,-,大肠杆菌表达载体及表达系统,3.4,本实验表达系统,宿主菌,载体,筛选,启动子,融合标签,BL21(DE3),pET28a,卡那霉素,T7 lac,His-Tag T7-Tag,表达系统,3 -大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统宿主菌载,23,3,-,大肠杆菌表达载体及表达系统,3.4,本实验表达系统,菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。,堪称经典的,BL21,系列就是,lon,和,ompT,蛋白酶缺陷型。,而,BL21,（,DE3,）就是一株由,LacUV5,启动子控制的,T7,噬菌体,RNA,聚合酶基因的溶源菌,pET28a,是具有,His,标签，利用,T7 RNA,聚合酶系统在大肠杆菌中诱导型高效表达外源蛋白的表达质粒，外源基因可与,N,端的,His,标签或者,T7,标签融合，以提高外源基因的表达量。,3 -大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统菌株,24,3,-,大肠杆菌表达载体及表达系统,3.5,宿主菌的表达,3 -大肠杆菌表达载体及表达系统3.5宿主菌的表达,25,4,-,SDS-PAGE,分离蛋白原理,4 -SDS-PAGE分离蛋白原理,26,4,-,SDS-PAGE,分离蛋白原理,4 -SDS-PAGE分离蛋白原理,27,第几章,二、实验流程,第几章二、实验流程,28,第几点,实验流程,大肠杆菌,E.coli DH5,阳性克隆转化,BL21(DE3,),IPTG,诱导表达,SDS-PAGE,分离检测,第几点实验流程大肠杆菌E.coli DH5阳性克隆转化BL,29,第几章,三、实验步骤,第几章三、实验步骤,30,第几章,扩增菌株提取质粒,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,EGFP,基因和,pET28a,载体的双酶切,pET28a-EGFP,重组表达载体的构建,EGFP,基因的原核表达与检测,SDS-PAGE,凝胶电泳分离蛋白质,第几章扩增菌株提取质粒 EGFP基因的PCR扩增和回收E,31,(,含,pEGFP-N3,和,pET-28a,的大肠杆菌,DH5,),（,1,）固,-,液接种：从,LB,平板上挑取,含有以上质粒,的,E.,coli,DH5,单菌落，接种于,5mL LB,培养基中，,37,振荡培养过夜。,（,2,）液,-,液转接：以,1%,接种量将过夜培养的,E.,coli,DH5,接种于新鲜,LB,培养基中，,37,，,220 rpm,振荡培养,2,2.5h,。,1-,扩增菌株及提取质粒,1.1,扩增菌株,(含pEGFP-N3和pET-28a的大肠杆菌DH5)1-,32,（,1,）取,1.0,5.0 mL,的菌液，室温下,13000 rpm,离心,1 min,收集细菌。,（,2,）倒弃培养基，加入,250,L Solution,/RNase A,混合液，,涡旋振荡,使细胞完全悬浮。,（,3,）往重悬混合液中加入,250,L Solution,，轻轻颠倒混匀,4,6,次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过,5 min,。,（,4,）加入,250,L Solution,，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。,（,5,）室温下，,13000 rpm,离心,10 min,。,（,6,）转移上清液至套有,2 mL,收集管的,HiBind DNA,结合柱中，室温下，,13000 rpm,离心,1 min,，倒去收集管中的滤液。,（,7,）把柱子重新装回收集管，加入,500,L HB Buffer,，按上述条件离心，弃去滤液。,（,8,）把柱子重新装回收集管，加入,700,L DNA Wash Buffer,，按上述条件离心，弃去滤液（注意：浓缩的,DNA Wash Buffer,在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释）。,（,9,）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，,13000 rpm,离心空柱,2 min,以甩干柱子基质（注意：不要忽略此步这对去除柱子中残留的乙醇至关重要）。,（,10,）把柱子装在干净的,1.5 mL,离心管上，加入,50,L Elution Buffer,到柱子基质中，静置,1,2min,，,13000 rpm,离心,1 min,，洗脱出,DNA,。,1-,扩增菌株及提取质粒,1.2,提取质粒（,pEGFP-N3,、,pET28a,）,（1）取1.05.0 mL的菌液，室温下13000 rpm,33,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,引物设计？,合适位点直接酶切还是,PCR,？,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,34,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,35,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,36,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,37,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,E,coR,（,192,）,H,ind,（,173,）,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,38,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,39,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,40,以,pEGFP-N3,中的,EGFP,片段作为,PCR,反应的模板，设计引入,Eco,R I,酶切位点的上游引物,(5-GGA,GAATTC,ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3),和引入,Hind,酶切位点的下游引物,(5,一,CCG,AAGCTT,GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3),2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,产物,5,GGA,GAATTC,ATG GTGTCA GCC,AAGCTT,CGG,3,3,CCT,CTTAAG,TAC CACAGT CGG,TTCGAA,GCC,5,以pEGFP-N3中的EGFP片段作为PCR反应的模板，设计,41,3-,EGFP,基因和,pET28a,载体的双酶切,3.1,酶切位点分析,选择重组酶切位点的,3,个原则：,读码框正确,不能破坏载体或目的片段,两个酶缓冲液相似，从而可以同时酶切,Eco,R I,Hin,d III,3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1酶切位点分析,42,3-,EGFP,基因和,pET28a,载体的双酶切,3.1,读码框分析,GAA TTC ATG GTGTCA GCC AAG CTT,CTT AAG TAC CACAGT CGG TTC GAA,正常表达,未发生移码,3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1读码框分析G,43,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,编号,组分,加量（,L,）,1,dNTP,mixture,5.0,2,10 x,buffer,5.0,3,上游引物,(10,M/L),2.0,4,下游引物,(10,M/L),2.0,5,模板,4.0,6,Taq,酶,1.0,7,ddH,2,0,6.0,total,25,PCR,反应体系,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,44,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增,PCR,反应体系,预变性,95,2min,变性,95,30s,退火,58.7,30s,延伸,72,1min,终延伸,72,7min,保存,4,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,45,2-,EGFP,基因的,PCR,扩增和回收,2.1,EGFP,基因的,PCR,扩增产物的检验及回收,扩增产物经,1%,琼脂糖凝胶电泳检验后，用,DNA,纯化试剂盒回收后待用。,（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取质量。,（2）以0.1 g凝胶对应300 L的体积加入溶胶液PN。50水浴放置10 min，其间不保持水浴温度不变并上下翻动离心管至胶完全融解。,（3）将上一步得到的溶液加入到吸附柱中，吸附柱放入收集管，室温静置1 min，13000 rpm离心30 s，弃上清液。,（4）加入700 L漂洗液Pw，13000 rpm离心60 s，弃上清液。,（5）加入500L漂洗液Pw，13000 rpm离心60 s，弃上清液。,（6）13000 rpm离心2 min，彻底除去漂洗液Pw。,（7）取出吸附柱，置于室温数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。,（8）将吸附柱放人一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液应先在65水浴预热，体积应大于30L），室温放置2 min，13000 rpm离心2 min。,（9）然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤（8）。,（10）经纯化回收的DNA置于-20保存。,2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR,46,3-,EGFP,基因和,pET28a,载体的双酶切,3.2,EGFP,基因的双酶切,双酶切反应体系,反应物,体积,/L,EGFP,片段,10,10buffer,2,Eco,R ,1,Hind,1,ddH,2,0,6,总计,20,37,保温,1h,65,条件下处理,20 min,进行热失活,经,1%,的琼脂糖凝胶电泳检验,DNA,纯化试剂盒纯化回收,3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.2EGFP基因,47,3-,EGFP,基因和,pET28a,载体的双酶切,3.3,pET28a,载体的双酶切,双酶切反应体系,反应物,体积,/L,EGFP,片段,10,10,buffer,2,Eco,R ,1,Hind,1,ddH,2,0,6,总计,20,经,1%,的琼脂糖凝胶电泳检验,DNA,纯化试剂盒纯化回收线性质粒条带,3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.3pET28a,48,4-,pET28a-EGFP,重组表达载体的构建,4.1,连接反应,连接反应体系,16,保温过夜,成分,加样量,/,L,ddH,2,0,3,10T4 ligase buffer,1.0,EGFP,片段,8,pET28a,2,10T4,连接酶,1,4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.1连接反应连,49,4-,pET28a-EGFP,重组表达载体的构建,4.2,转化,感受态细胞的制备,（,1,）固,-,液接种：从,LB,平板上挑取新活化的,E.,coli,DH5,单菌落，接种于,5 mL LB,培养基中，,37,振荡培养过夜。,（,2,）液,-,液转接：以,1%,接种量将过夜培养的,E.,coli,DH5,接种于新鲜,LB,培养基中，,37,，,220 rpm,振荡培养,2,2.5 h,。,（,3,）菌液冰浴：将菌液置于冰浴中。,（,4,）取两个无菌的,1.5 mL,离心,管，各加入,1.5 mL,菌液，,4,，,4000 rpm,离心,5 min,，弃上清。重复上述操作，使每个,1.5 mL,离心,管中收集,3 mL,培养液的菌体。,（,5,）残留液体涡旋细胞，加,800,L,预冷的,0.1M CaCl,2,，冰浴悬浮细胞。,4,，,4000 rpm,离心,5 min,，弃上清。,（,6,）加入,100,L,预冷的,0.1M CaCl,2,，轻轻悬浮细胞，冰浴,20 min,。,（,7,）分装至,50,L/,管，感受态细胞制备完成（现用或者,48 h,内使用，,4,保存）,4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化感,50,4-,pET28a-EGFP,重组表达载体的构建,4.2,转化,涂布平板,1,2,3,4,5,6,7,实验设组,感受态细胞,（,L/,管）,DNA,（,L,）,冰浴,热击,冰浴,复苏,培养基,涂布平板（,42,）,I,试验组,100,连接物,5.0,10,min,90 s,5,min,LB,：,0.9 ml/,管,，,0.5-1 h,LB+,kan,50l,2,100l,2,150l,2,200l,2,II,转化对照,50,Pbv220,1.0,LB+,kan,50l,1,III,细胞对照,50,LB+,kan,50l,1,LB,50l,1,预留一个空白,+,kan,平板。,4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化涂,51,4-,pET28a-EGFP,重组表达载体的构建,4.2,转化,筛选,37,平板培养过夜后，挑选,3,5,个菌落做,PCR,验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于,DNA,测序。对经测序确证的、含,pET28a-EGFP,重组质粒的菌落进行质粒提纯。,4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化筛,52,5-,EGFP,基因的原核表达与检测,5.1,转化表达宿主,取,1,L,“,pET28a-EGFP”,重组表达质粒，转化至,E.coli,BL 21 (DE3),感受态细胞，经,37,培养过夜。,5-EGFP基因的原核表达与检测5.1转化表达宿主取1 L,53,5-,EGFP,基因的原核表达与检测,5.2,诱导表达目的基因,（,1,）随机挑选,10,个阳性菌落克隆于含卡那霉素,(50,g/mL),的,LB,液体培养液中。,（,2,）,37,摇床培养至,OD,值为,0.4,1,。,（,3,）取出,3 mL,样品作为未诱导对照，,4000 rpm,离心,5 min,，收集细胞冻存于,-20,。,（,4,）剩下的样品继续加入,100 mM IPTG,储液至终浓度为,0.5 mM,，继续,37,摇床培养,然后分别在日光灯和紫外灯下照射。,5-EGFP基因的原核表达与检测5.2诱导表达目的基因（1）,54,6-,SDS-PAGE,凝胶电泳分离蛋白质,样品的准备,制胶,电泳,染色,脱色,分析,6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品的准备制胶电泳染色,55,6-,SDS-PAGE,凝胶电泳分离蛋白质,6.1,样品的制备,（,1,）将诱导表达后的菌体重悬于,100,L PBS,中，分别进行超声裂解，每个样品超声,2,3 s,，处理,2 min,。,（,2,）取超声后溶液适量留待制备菌体表达总蛋白质样品。,4,12000 rpm,离心,10 min,，分别获取超声上清和沉淀，然后超声上清，测蛋白质含量，调整浓度一致。超声离心后沉淀用适量,PBS,重悬。,（,3,）将菌体表达的总蛋白样品、超声上清、超声沉淀各取,20,L,与,5,样品缓冲液在,EP,管中混合，放入,100,加热,5 min,。,（,4,）常温离心,10000 rpm,，取适量上清准备上样。,6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.1样品的制备（1）,56,6-,SDS-PAGE,凝胶电泳分离蛋白质,6.2,分离胶及浓缩胶的制备,分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约,30,40min,后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。,分离胶,去离子水 3.5 mL,4分离胶缓冲液（pH=8.8）2.5 mL,丙烯酰胺储液（30） 4 mL,TEMED 10 L,10AP 80 L,浓缩胶,去离子水 2.3 mL,4浓缩胶缓冲液（pH=8.8） 1 mL,丙烯酰胺储液（30） 0.67 mL,TEMED 10 L 10AP 50 L,6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.2分离胶及浓缩胶的,57,6-,SDS-PAGE,凝胶电泳分离蛋白质,6.3,凝胶电泳,取,80 ml,电极缓冲液稀释,5,倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。,80 V,恒压,20,min,，,120 V,恒压,2,h,。,6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.3凝胶电泳取80,58,6-,SDS-PAGE,凝胶电泳分离蛋白质,6.4,染色、脱色,取电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色,0.5,1,小时；之后，在脱色液中脱色,1,h,，观察目的蛋白表达情况。,6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.4染色、脱色取电泳,59,第几章,四、预期结果,1,、菌落,PCR,的结果,2,、重组质粒的双酶切结果,3,、测序的结果,4,、,EGFP,基因的表达结果,5,、分生实验课上的实验结果,第几章四、预期结果1、菌落PCR的结果,60,第几点,1,、菌落,PCR,的结果,PCR,产物经,1,琼脂糖凝胶电泳后，可发现在靠近,750 bp,处有清晰条带，这便是阳性。,第几点1、菌落PCR的结果PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳后，,61,第几点,2,、重组质粒的双酶切结果,进一步对阳性菌落中的质粒进行提纯、用,Eco,R I,和,Hin,d ,对质粒进行双酶切，经,1.0,琼脂糖凝胶电泳后。可在靠近,750 bp,处看到目的片段的条带。,第几点2、重组质粒的双酶切结果进一步对阳性菌落中的质粒进行提,62,第几点,3,、测序结果,将,PCR,进行测序，正确结果应该与,genebank,序列完全一致，由此可以证明目的片段“,EGFP”,已正确连接到,pET28a,表达载体，并且核苷酸序列未发生任何碱基突变。,第几点3、测序结果将PCR进行测序，正确结果应该与geneb,63,第几点,4,、,EGFP,基因的表达结果,加入,IPTG,诱导后，可观察到菌体细胞呈现绿色如图所示，说明目的基因在表达菌,E,. coli,BL21,中表达。如图所示在紫外光下可以观察到菌体细胞发绿色荧光,第几点4、EGFP基因的表达结果加入IPTG诱导后，可观察到,64,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,在,6,月,5,日、,10,日和,12,日的分生实验课上，我们进行了“,EGFP,、,DsRed,和,YFP,在,E.,coli,中的诱导表达和检测”的实验，得到了一些实验结果，现进行实验结果分析如下：,第几点5、分生实验课上的实验结果在6月5日、10日和12日的,65,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,在本次实验中，我们向LB固体培养基平板中进行接种的表达菌株分别可以表达GFP基因、 RFP基因和YFP基因，从而经过IPTG诱导后可以产生相应的荧光蛋白。6月10日下午我们在平板上进行划线接种，接种工具可以使用灭菌后的牙签、棉棒以及灼烧后的接种环。我对两个平板进行接种。其中一个平板接种后的图案如下图所示。图中可以很明显地看出平板划线的痕迹。接种完成后将平板倒置放在37恒温培养箱中培养。,第几点5、分生实验课上的实验结果在本次实验中，我们向LB固体,66,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,6月12日下午我们从恒温培养箱中取出平板观察实验结果。观察发现，在我做的2个平板中，表达菌株在平板中生长状态良好，在日光下就可以看到平板上的绿色、红色和黄色的菌落颜色（实际上是大肠杆菌产生的荧光蛋白的颜色）。其中一个平板在6月10日接种了可以产生RFP的表达菌株， 6月12日观察发现该平板在日光灯下即可见红色菌落组成的图案，如下图所示。,第几点5、分生实验课上的实验结果6月12日下午我们从恒温培养,67,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,不过该平板不小心被捏碎，导致没有在紫外灯下观察和拍照。我只对另一个平板在紫外灯下进行观察和拍照，实验结果如下图所示。,第几点5、分生实验课上的实验结果不过该平板不小心被捏碎，导致,68,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,上图所示的平板中我只接种了可以产生GFP的表达菌株，从而在平板中可以产生绿色菌落。该平板在日光灯下便可见绿色菌落，在紫外灯下观察更加明显。在紫外灯的照射下，平板中的菌落发出绿色荧光，非常明亮，可以清晰地看到平板中的图案。在6月10日的平板划线过程中，我花了很多时间对第一个平板进行划线接种，第二个平板只是简单地划线接种。但是很不巧的是6月12日第一个平板被捏碎导致没有在紫外灯下观察拍照，因此最终的实验结果只能呈现第二个平板图案。第二个平板的图案设计没有什么独特的地方，设计该图案的原因是我们宿舍有一个舍友叫邱伟，外号是伟哥，他的口头禅是“厉害！”。因此我就随手在平板上写下了“伟哥厉害”四个字。,第几点5、分生实验课上的实验结果上图所示的平板中我只接种了可,69,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,6月12日我们同时对GFP、RFP和YFP三种蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测。 SDS-PAGE电泳的加样顺序如下面两表所示。,泳道,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,样品,pET28a-3,GFP-0,GFP-1,M,GFP-3,GFP-5,RFP-5,RFP-0,RFP-1,RFP-3,样量,20L,20L,20L,10L,20L,20L,20L,20L,20L,20L,泳道,11,12,13,14,15,16,17,18,样品,M,pET28a-0,pET28a-1,pET28a-5,YFP-1,YFP-0,YFP-3,YFP-5,样量,20L,20L,20L,20L,20L,20L,20L,20L,第几点5、分生实验课上的实验结果6月12日我们同时对GFP、,70,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,SDS-PAGE,电泳图（,1,）,SDS-PAGE电泳结果如下所示：,第几点5、分生实验课上的实验结果12345678910SDS,71,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,11,12,13,14,15,16,17,18,SDS-PAGE,电泳图（,2,）,第几点5、分生实验课上的实验结果11121314151617,72,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,泳道4和泳道11中加的是marker，其SDS-PAGE电泳理论条带如右图所示。电泳后的marker中有7条带，指示的蛋白质大小分别是14.4 kDa、18.4 kDa、25.0 kDa、35.0 kDa、45.0 kDa、66.2 kDa和116.0 kDa。在电泳图（1）和（2）中两个marker跑出的条带都较清晰，可以看到marker中7条指示条带，电泳效果较好。,泳道12、泳道13、泳道1、泳道14加的是空载体pET28a分别培养0小时、 1小时、 3小时和5小时后的样品，从SDS-PAGE电泳图（1）和（2）中可以看到，这4个泳道中有若干条条带，这些条带的位置和亮度相近，都是表达载体自身的蛋白质电泳结果。在这三种荧光蛋白对应的条带位置处没有观察到相应的条带，说明不含荧光蛋白基因的表达载体无法产生荧光蛋白。,第几点5、分生实验课上的实验结果泳道4和泳道11中加的是ma,73,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,泳道2、泳道3、泳道5和泳道6加的是可以产生GFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时、 1小时、 3小时和5小时后的样品。GFP的分子质量为26 kDa，处于marker 25.0 kDa和35.0 kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。理论上可以产生GFP的表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的GFP越多，电泳后得到的GFP对应的条带越亮越宽。从图中可以很明显地看出，泳道2中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到GFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导表达的表达菌株不能产生GFP。泳道3、泳道5、泳道6中均有符合GFP对应条带位置的又宽又明亮的条带，而且条带宽度增加亮度增加，这说明经IPTG诱导表达时间越长，表达菌株产生的GFP越多。,第几点5、分生实验课上的实验结果泳道2、泳道3、泳道5和泳道,74,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,泳道8、泳道9、泳道10和泳道7加的是可以产生RFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时、 1小时、 3小时和5小时后的样品。RFP的分子质量处于marker 25.0 kDa和35.0 kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。泳道8中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到RFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导的表达菌株不能产生RFP 。理论上可以产生RFP的表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的RFP越多，电泳后得到的RFP对应的条带越亮越宽。泳道9、泳道10和泳道7中均含有符合RFP对应条带位置的又宽又明亮的条带。泳道10中的样品是表达菌株经IPTG诱导3小时后得到的，比泳道9中样品对应的表达菌株诱导时间长，实际实验结果可以看出，泳道10比泳道9中的条带宽度增加亮度增加，说明GFP含量增加，符合理论情况。不过，泳道7中跑出的条带较窄， RFP对应的条带没有明显地变宽变亮，该实验现象不明显。,第几点5、分生实验课上的实验结果泳道8、泳道9、泳道10和泳,75,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,泳道16、泳道15、泳道17和泳道18加的是可以产生YFP的表达菌株分别经IPTG诱导表达0小时、 1小时、 3小时和5小时后的样品。YFP的分子质量处于marker 25.0 kDa和35.0 kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。泳道16中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到YFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导的表达菌株不能产生YFP。理论上表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的YFP越多，电泳后得到的YFP对应的条带越亮越宽。从此次实验结果看出，泳道15中没有观察到YFP对应的条带，说明此表达菌株经IPTG诱导表达 1小时后产生的YFP含量很少。泳道17和泳道18中均有符合YFP位置的条带，较宽较明亮，但是泳道18中的条带不如泳道17中的条带宽和明亮。泳道18中的表达菌株经IPTG诱导的时间比泳道17中的样品长，理论上条带应该更宽更明亮。这出现了实际情况与理论情况不相符的情况，具体原因需要进一步的实验探究。,第几点5、分生实验课上的实验结果泳道16、泳道15、泳道17,76,第几点,5,、分生实验课上的实验结果,综观实验结果，我发现可以产生GFP的表达菌株的实验结果最好。探究其原因我发现在此次实验中，表达菌株产生的荧光蛋白其实分别是EGFP、DsRed和YFP。EGFP是增强型绿色荧光蛋白，表达菌株产生EGFP蛋白，会使实验现象要好于另外二者。不过，实际情况是否如此仍需要进一步的实验探究。,第几点5、分生实验课上的实验结果综观实验结果，我发现可以产生,77,第几章,五、参考文献,1,Shimomura O.,The discovery of aequorin and green fluorescent protein,J,.,J Microsc. 2005 Jan;217(Pt 1):1-15.,2,张新生，刘小裕，任双义,.,绿色荧光蛋白的发现及其应用,J.,大连医科大学学报，,2009,31(4).,3,崔志芳，邹玉红，季爱云,.,绿色荧光蛋白研究的三个里程碑,2008,年诺贝尔化学奖简介,J,.,自然杂志，,2008,30(6).,4,季爱加，宁喜斌,.,原核表达载体的构建与表达,J,.,微生物学杂志，,2011,31(4).,第几章五、参考文献1 Shimomura O.,78,Thank you,！,Thank you！,79,此课件下载可自行编辑修改，供参考！,感谢您的支持，我们努力做得更好！,此课件下载可自行编辑修改，供参考！,80,