实验蛋白质含量测定课件

生物化学与分子生物学基础实验,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物化学与分子生物学基础实验,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物化学与分子生物学基础实验,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生物化学与分子生物学基础实验,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,掌握紫外吸收法、,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）和考马斯亮蓝染色法（,Bradford,法）测定蛋白质含量的原理和方法,2,掌握分光光度计的原理和使用方法,实验目的,生物化学与分子生物学基础实验,1 掌握紫外吸收法、Folin酚试剂法（Lowry法）和考,1,有多少样品可供分析;,蛋白质样品浓度大约是多少;,样品中含有哪些可能影响定量的,化学物质,；,所选方法是否简单、可靠；,含量测定的专一性要求是否很高。,选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑,：,生物化学与分子生物学基础实验,有多少样品可供分析; 选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于,2,常用的方法,物理性质：,紫外吸收法,化学性质：,Folin,酚试剂法（,Lowry,法）,，,BCA,法（,Bicinchoninic acid,法），凯氏定氮法，双缩脲法（,Biuret,法），胶体金测定法，等等,染色性质：,考马斯亮蓝染色法,（,Bradford,法）,、银染法,测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为,16,）。,生物化学与分子生物学基础实验,常用的方法物理性质：紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验,3,蛋白质在紫外光区（190,nm-360nm）,有两个强烈吸收峰：280,nm,和,190nm。,280,nm,有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，,色氨酸(,Trp)、,和酪氨酸(,Tyr),有芳香环，可吸收280,nm,波长的光子，苯丙氨酸（,Phe）,、组氨酸（,His,）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此,相同浓度的不同种类蛋白质，其280,nm,的吸收值差别很大(图1)。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有,4,图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱,图,A,是15,g /ml,蛋白的吸收光谱。图,A,中插图是1,mg/ml,的牛免疫球蛋白,IgG(I)、,牛血清白蛋白(,B),和白明胶(,G),的吸收光谱，缓冲液为：0.01%,Brij35,0.1M K,2,SO,4,5mM KH,2,PO,4,pH7。,图,B,是10,g /ml RNA,和,DNA,的吸收光谱。,生物化学与分子生物学基础实验,图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱生物化学与分子生物学基础实验,5,肽键在,190nm,有强吸收峰。,一般分光光度计在,190nm,的光强较弱，且,O,2,在此波长有吸收，因此通常使用,205nm,或,210nm,波长，,Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg,的侧链在此波长有吸收。优点：,灵敏，,较稳定。,缺点,:,干扰因素多。许多化学物质特别是含,CC,双键和,CO,双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,肽键在190nm有强吸收峰。紫外吸收法生物化学与分子生物学基,6,优点：,不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏；,测量极其简单迅速；,蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。,适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,优点：紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验,7,缺点,：,干扰测定的影响因素多，尤其是,RNA,和,DNA,在此波长均,有强吸收,所以一定要考虑样品中是否有核酸,.,要得到准确可靠的结果，必须严格,控制样品溶液的,pH,和化学组成，,使待测样品和标准样品的实验条件一致。,敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。,用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,缺点：紫外吸收法生物化学与分子生物学基础实验,8,管号,0,1,2,3,4,5,6,7,标准蛋白溶液（,ml,）,0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,0,双蒸水（,ml,）,4.0,3.0,2.5,2.0,1.5,1.0,0,0,蛋白质含量,(,mg/ml),0,0.25,0.375,0.5,0.625,0.7,5,1.0,未知蛋白溶液（,ml,）,-,-,-,-,-,-,-,4.0,A,280,操作步骤,紫外吸收法,生物化学与分子生物学基础实验,管号01234567标准蛋白溶液（ml）01.01.52.0,9,考马斯亮蓝染色法（,Bradford,法）,原理：,该方法由,Bradford,于,1976,年建立。,在,酸性条件,下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由,465,nm,（,红色）,转移为,595,nm,（,蓝色,），起作用的主要氨基酸是,Arg,，,另外，,His, Lys, Tyr, Trp,和,Phe,也有作用。,25,min,呈最大光吸收，至少可稳定1小时,生物化学与分子生物学基础实验,考马斯亮蓝染色法（Bradford法）原理：该方法由Brad,10,简便,迅速，灵敏度较高,。只需要一种反应试剂,影响因素较少。,去污剂,和,两性物质,对测定有干扰,小于,3000Da,的多肽无法测定,蛋白浓度高时非线性,配制的染色液需过滤除去未溶解的,考马斯亮蓝,G250,考马斯亮蓝染色法（,Bradford,法）,生物化学与分子生物学基础实验,简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂考马斯亮蓝染色法,11,实验操作步骤,室温,放置,5,分钟后测,595,nm,的光吸。,考马斯亮蓝染料极易吸附于比色皿壁，每次测量后应用,乙醇,洗涤后，用双蒸水清洗。,注意混匀，但不要剧烈震荡。,考马斯亮蓝染色法（,Bradford,法）,生物化学与分子生物学基础实验,实验操作步骤 室温放置5分钟后测595nm的光吸。考马斯亮蓝,12,原理：,Folin-,酚试剂法的显色试剂由,试剂甲,和,试剂乙,组成。,试剂甲,中的,Cu,2+,碱性条件下与肽键形成络合物并被还原成,Cu,+,。,Cu,+,以及蛋白质中的,Tyr,等的侧链基团与,试剂乙,反应，,试剂乙中的磷钼酸盐,磷钨酸盐被蛋白质中的,Tyr,和,Phe,残基还原，产生蓝色化合物（钼兰和钨兰的混合物），显色反应在,30,分钟内接近极限。,颜色深浅与蛋白含量成正比，可在,640,nm,下测光吸收。,Folin-,酚试剂法（,Lowry,法）,生物化学与分子生物学基础实验,原理：Folin-酚试剂法的显色试剂由试剂甲和试剂乙 组,13,酸、铜离子螯合剂（如,EDTA、,柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙醇、,DTT、,苯酚等）干扰本反应,。,不同蛋白质主要因其所含的,Tyr,含量不同而呈现不同的吸收强度。,进行测定时，,加试剂乙时,要特别小心，因为,该试剂仅在酸性,pH,条件下稳定,，但上述还原反应只在,pH=10,的情况下发生，故当试剂乙加到碱性的铜,蛋白质溶液中时，,必须立即混匀,，以便在磷钼酸,磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。,这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱,。,因,Lowry,反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。,费时较长，试剂配制较繁琐,。,Folin-,酚试剂法（,Lowry,法）,生物化学与分子生物学基础实验,酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙醇,14,实验步骤,0,1,2,3,4,5,6,7,标准蛋白（,1mg/ml,）,ul,0,20,40,80,120,160,200,0,待测样品,ul,-,-,-,-,-,-,-,200,蒸馏水,ul,1000,980,960,920,880,840,800,800,Folin-,酚试剂甲,ml,4,4,4,4,4,4,4,4,混匀，于室温放置,10,分钟,Folin-,酚试剂乙,ul,250,250,250,250,250,250,250,250,迅速混匀，,30,水浴保温,30,分钟,A,640,Folin-,酚试剂法（,Lowry,法）,生物化学与分子生物学基础实验,实验步骤 01234567标准蛋白（1mg/ml）ul020,15,试剂、实验材料：,（已放在每个试验台的架子上）,标准蛋白溶液：,1mg/ml BSA,未知蛋白溶液,考马斯亮蓝染色液,Folin-,酚试剂甲,Folin-,酚试剂乙,生物化学与分子生物学基础实验,试剂、实验材料：（已放在每个试验台的架子上）标准蛋白溶液,16,Lowry,法的改进法。,碱性条件下，蛋白分子中的肽键与,Cu2+,形成络合物，并,将,Cu2+,还原成,Cu+,；,Cu+,与,BCA,结合成紫色复合物，在,562nm,处吸收值与浓度呈正比,BCA,法,生物化学与分子生物学基础实验,Lowry 法的改进法。BCA法生物化学与分子生物学基础实验,17,与,Lowry,方法相比，,BCA,法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到,0.5g/ml,），应用更加灵活。,可耐受高达,5%,的表面活性剂,测定不同蛋白样品时比,bradford,测定法结果均一,BCA,法,生物化学与分子生物学基础实验,与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几,18,常用的测定蛋白质含量方法的比较,方 法,测定范围,（,g/ml,）,不同种类,蛋白的差异,最大吸收,波长,(nm),特 点,凯氏定氮法,小,标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定,紫外吸收法,1001000,大,280,205,灵敏度稍低，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响,双缩脲法,100010000,小,540,重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大,Folin-,酚试剂法,20500,大,500-750,灵敏，费时较长，干扰物质多,考马氏亮蓝,G-250,50500,大,595,灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移,BCA,202000,大,562,灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长,生物化学与分子生物学基础实验,常用的测定蛋白质含量方法的比较测定范围不同种类最大吸收特,19,1,、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度可能会有较大差异。,2,、即使是用同一种比色法测定同一样品，选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，,寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品,。,3,、所有的样品（包括标准样品），都必须,在规定时间内测试,。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出的样品浓度与实际的浓度不符。,注 意,生物化学与分子生物学基础实验,1、由于各种方法测定原理不同，所以同时使用几种方法对同一样品,20,722型光栅分光光度计,光源,单色器,样品池,光电源件,读数单元,测量完毕，请把光度计的盖打开 ！,讲解完毕后，每个组出一个同学去,127,听老师讲解仪器使用。,生物化学与分子生物学基础实验,722型光栅分光光度计光源单色器样品池光电源件读数单元测量完,21,TU1800,紫外可见分光光度计,波长范围：,200,1100nm,测光系统：单光束,功能指标：光度测量,光谱扫描,定量测量,钨灯：3401100,nm,氘灯：200340,nm,生物化学与分子生物学基础实验,TU1800 紫外可见分光光度计波长范围：2001100n,22,1 测紫外吸收要用,石英比色皿,！,2 定量实验取液要准确。,3,从低浓度到高浓度,依次测量，比色皿不要润洗。 因此,3,ml,溶液,足够测定。,4,测量完毕，请把光度计的盖打开,！,5,每次实验时提交上一次的实验报告。,注意事项,生物化学与分子生物学基础实验,1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！注意事项生物化学与分子生物学,23,实验报告,原始数据需老师签字，附在实验报告上。,真实记录实验数据，以标准蛋白含量为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并标出未知溶液的蛋白含量。可以进行各种软件绘图。,单位,、,标示,要清楚,生物化学与分子生物学基础实验,实验报告原始数据需老师签字，附在实验报告上。生物化学与分子生,24,微量移液枪使用注意事项,轻拿轻放，不能摔、砸。,严禁将量程调出标准使用范围。,使用过程中携带有,Tip,头的移液枪不可以倒过来,(,特别是里面还有液体的时候,),，以防液体流入枪内，腐蚀部件。,不用移液枪时不要一直拿在手里，应挂于枪架上。,每日实验结束后，应将移液枪量程调至最大， 长期压紧弹簧会影响准确度。,5ml,白色,Tip,头回收！废,Tip,头放入废物烧杯中！污染问题！安全问题！,生物化学与分子生物学基础实验,微量移液枪使用注意事项轻拿轻放，不能摔、砸。5ml 白色Ti,25,实验二,葡聚糖凝胶柱层析,实验分两拨：,前两个实验台的同学下个星期来做实验；,后两个试验台的同学下下个星期做,生物化学与分子生物学基础实验,实验二 葡聚糖凝胶柱层析 实验分两拨：生物化学与分子生,26,xiexie!,谢谢！,xiexie!谢谢！,27,xiexie!,谢谢！,xiexie!谢谢！,28,