发光细菌法急性毒性实验ppt课件

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,发光细菌法急性毒性的测定,发光细菌法急性毒性的测定,1,四、实验材料与方法,三、,实验原理,二、,实验目的与内容,一、,简 介,主要内容,五、实验步骤,六、注意事项,七、习题与思考,四、实验材料与方法 三、实验原理 二、实验目的与内容 一、,2,1978,年美国,Beckman,公司即推出功能完备的,生物发光光度计“,Microtox”,，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为,Microtox,测试。,简 介,发光菌,毒性测试是,20,世纪,70,年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。,1978年美国 Beckman 公司即推出功,3,采用现代光电检测手段,(,生物发光光度计,),的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。,1995,年,3,月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法,(GB/T 15441-1995),。,简 介,采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒,4,实验目的与内容,一、实验目的,1.,掌握发光细菌毒性测试的标准方法；,2.,根据发光细菌发光强度的变化判断,受试化合物的毒性；,3.,初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。,实验目的与内容一、实验目的1.掌握发光细菌毒性测试的标准方,5,二、实验内容,1.,发光细菌的复苏；,2.,发光细菌发光强度的测定；,3.,受试化合物毒性的计算。,二、实验内容1.发光细菌的复苏；,6,实验目的与内容,发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图,(1),所示。发光细菌发光反应途径可简单概述为：,FMNH,2,O,2,RCHO,荧光,FMN,H,2,O+RCOOH,（,1,）,这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，反应的结果便产生光。,实验目的与内容 发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光,7,发光菌的发光现象是其正常的代谢活动,在一定条件下发光强度是恒定的,与外来受试物,(,无机、有机毒物,抑菌、杀菌物等,),接触后,其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓度呈相关关系,同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光,:(1),直接抑制参与发光反应的酶类活性,;(2),抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程,(,如细胞呼吸等,),。,毒物的毒性可以用,EC50,表示,即发光菌发光强度降低,50%,时毒物的浓度。实验结果显示,毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小,用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。,实验原理,发光菌的发光现象是其正常的代谢活动,在一定,8,图,(1),发光细菌的发光反应模式。,E1:,细菌荧光素酶，由,、,2,个亚基组成，,为,4000042000D,，,为,3700039000D,。单独,、,亚基均无发光活性，只有,、,共存时才有活性。,E2:NADH,：,FMN,氧化还原酶，分子量为,3000D,，对,FMN,有高度特异性。,E3:,脂肪酸还原酶。,图(1)发光细菌的发光反应模式。E1:细菌荧光素酶，由,9,实验材料与方法,1.,试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。,氯化钠溶液，,2.0 g/100 ml(3.0 g/100 ml),，称取,2.0 g(3.0 g),氯化钠溶于,100ml,蒸馏水中，置于,2-5,冰箱备用。,氯化汞母液，,2 000 mg/L,，万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞,0.1000 g,于,50 ml,容量瓶中，用,3.0 g/100ml,氯化钠溶液稀释至刻度，置于,2-5,冰箱备用，保存期,6,个月。,实验材料与方法1.试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）,10,氯化汞工作液，,2.0 mg/L,，用移液管吸取氯化汞母液,10 ml,入,1000 ml,容量瓶，用,3.0 g/100ml,氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞,20 mg/L,液,25 ml,入,250 ml,容量瓶，用,3.0 g/100 ml,氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用,3.0 g/100 ml,氯化钠溶液将氯化汞,2.0 mg/L,溶液按表,1,稀释成系列浓度,(,稀释至,50 ml,容量瓶中,),。配制的稀释液保存期不超过,24,小时。,氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞,11,氯化汞工作液体积,，,ml,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,配制氯化汞浓度，,mg/L,0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24,表,1,氯化汞工作液稀释配制系列,(,稀释至,50 ml,容量瓶中,),0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0,12,2.,明亮发光杆菌,T3,小种,(Photobacterium phosphoreum T3 spp.),冻干粉，安培瓶包装，在,2-5,冰箱内有效保存期为,6,个月。新制备的发光细菌休眠细胞,(,冻干粉,),密度不低于每克,800,万个细胞；冻干粉复苏,2 min,后即发光，可在暗室内检验，肉眼可见微光，,稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于,1.6,万个细胞,(5,毫升测试管,),或,2,万个细胞,(2,毫升测试管,),。在,DXY-2,型毒性测试仪上测出的初始发光量应在,600-1900 mV,之间，低于,600 mV,允许将倍率调至“,X2”,档，高于,1900 mV,允许将倍率调至“,X0.5”,档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发光细菌的毒性实验在美国,Maxwell,（,MSI.,）,LuminMax-C,冷光仪完成。,2.明亮发光杆菌T3小种(Photobacterium,13,发光细菌的复苏,从冰箱内取出含有,0.5 g,发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置于含有冰块的小号保温瓶，用,1 ml,注射器吸取,0.5 ml,冷的氯化钠,2.0 g/100 ml,溶液,(,适用于,5ml,的测试管,),或,1 ml,冷的氯化钠,2.5,溶液,(,适用于,2 ml,的测试管,),注入冻干粉中，充分混匀。,2 min,后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。,发光细菌的复苏,14,发光细菌的培养,：,培养液：酵母浸出汁,5.0g,，胰蛋白胨,5.0g,，,NaCl 30.0g,，,NaHPO4 5.0g,，,KH2PO4 1.0g,，甘油,3.0g,，加蒸馏水至,1000ml,pH,调至,70.5,，趁热分装于,150ml,三角瓶中，每瓶约,50ml,，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经,115,、,20-30min,高压蒸汽灭菌后置于,4,左右冰箱中备用。,发光细菌的培养：,15,(2),固体培养基：,取上述培养液,100ml,，加入,1.52g,琼脂粉，电炉加热使溶解至透明，调节,pH,值为,70.5,，趁热用漏斗分装于试管中，每支试管各约,10ml,，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经,121,高压灭菌,20,30min,后，取出制成斜面。,(3),斜面菌种培养：,将发光菌冻干粉用,0.5ml 3%NaCl,溶解，迅速转入,50ml,培养液中，,20,恒温培养，每,24h,后转接一次斜面，将培养好的第三代斜面置,4,冰箱中备用。,(2)固体培养基：,16,(4),摇瓶菌液培养：将培养好的第三代新鲜斜面菌种,T3,接入装 有,50ml,培养液的,150ml,锥形瓶中，接种量不得超过一接种环，于,20,振荡,(180r/min),培养,12h(,即对数生长期,),后备用。,(5),工作菌液培养：吸取一定量刚培养好的摇瓶菌液，用,3%,的,NaCl,溶液稀释并磁力搅拌均匀。控制对照,(2.0ml 3%NaCl,溶液,+0.1ml,工作菌液,),发光强度,300mv-900mv,。,(4)摇瓶菌液培养：将培养好的第三代新鲜斜面菌种T3接入装,17,3.,仪器：,生物发光光度计，配制,2,或,5 ml,测试管，当氯化汞标准液浓度为,0.10 mg/L,时，发光细菌的相对发光度为,50,，其误差不超过,10,。,2,或,5 ml,测试样品管，具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造，分别适用于相应型号的生物放光光度计。注射器,(1 ml),、微量注射器,(10 l),、定量加液瓶,(5 ml),、吸管,(2,、,10,、,25 ml),、试剂瓶,(100 ml),、量桶,(100,、,500 ml),、棕色容量瓶,(50,、,250,、,1000 ml),、半微量滴定管,(,配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色，,10 ml),等若干。,3.仪器：,18,在预实验的基础上，将待测物配成,5-7,个浓度梯度，各取不同浓度梯度溶液,2ml,加入具塞磨口比色管中，取,0.2ml,工作菌液与各比色管中，加塞上下振荡摇匀，去塞，暴露,15min,，以,2ml3%,的,NaCl,溶液做空白对照。测发光强度。每个浓度梯度设,3,组平行。,测定,在预实验的基础上，将待测物配成5-7个浓度梯度，各取不同,19,受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示。,计算公式如下：,光强的相对抑制率与毒物毒性的大小成正比。通常用发光细菌光抑制,50,的受试化合物浓度来表征其毒性效应,(,EC,50,),。将计算的光相对抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的,EC,值。,(2),实验结果,受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示。,20,注意事项,（,1,）实验前判断发光细菌是否复合测试要求。,（,2,）平行或批处理样品的处理与测试应注意,操作时间的一致性。,注意事项（1）实验前判断发光细菌是否复合测试要求。,21,1.,测试结果误差的主要来源？,2.,测试过程中，暴露时间、温度以及体系的,pH,等 对发光细菌的发光特性是否有影响，及影响如何？,3.,本测试方法与上述三种测试方法的结果是否一致，应如何解释？,思考与讨论,1.测试结果误差的主要来源？思考与讨论,22,