基因工程菌培养课件

*,*,单击此处编辑母版标题样式,基因工程菌培养,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程菌培养,1,基因工程菌培养,基因工程菌培养1基因工程菌培养,什么是基因工程菌？,为什么要构建基因工程菌？,遗传性状的改良,代谢途径的加工,生物反应器,2,基因工程菌培养,什么是基因工程菌？2基因工程菌培养,基因工程菌的构建,宿主菌：,大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,是应用最广泛,最成功的表达体系,外源基因：,质粒,3,基因工程菌培养,基因工程菌的构建3基因工程菌培养,基因工程菌生长的特点：,外源基因与宿主的互相影响,产物，资源的争夺,基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？,4,基因工程菌培养,4基因工程菌培养,微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。,基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。,5,基因工程菌培养,微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产,基因工程菌发酵的设备,气升式发酵罐的优点：,结构简单，不易污染，能耗低，操作简单，低剪切力,适合高浓度发酵。,基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）,6,基因工程菌培养,基因工程菌发酵的设备气升式发酵罐的优点：6基因工程菌培养,基因工程菌的高密度发酵,在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产物的表达都是在对数期内完成的，因此，发酵工艺的改进就集中在如何,延长工程菌的对数生长时间，缩短衰亡时间,高密度发酵工艺,是基因工程菌发酵的主要生产工艺,7,基因工程菌培养,基因工程菌的高密度发酵 在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产,高密度发酵,培养基的要求,高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。,成分的要求：使用甘油的原因？,浓度的要求,8,基因工程菌培养,高密度发酵培养基的要求8基因工程菌培养,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。,比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽()时,在发酵开始和进行12后,各添加2.0/腺苷三磷酸()和9/前体氨基酸,可以使细胞浓度和的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍,9,基因工程菌培养,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋,培养方式,分批补料培养方式,补充营养,稀释代谢产物,分离与培养耦合,固定化培养技术,固定化技术与连续培养，透析培养相结合是基因工程菌发酵的发展方向,10,基因工程菌培养,培养方式分批补料培养方式10基因工程菌培养,接种量的控制,接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快。,11,基因工程菌培养,接种量的控制接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明,接种量过小，延迟期太长,较接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。,接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。,12,基因工程菌培养,接种量过小，延迟期太长12基因工程菌培养,发酵中溶解氧的控制,纯氧？富氧！,添加提高传氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，血红蛋白，小球藻。,溶氧过高或局部过高，会使某些微生物氧中毒,13,基因工程菌培养,发酵中溶解氧的控制纯氧？富氧！13基因工程菌培养,pH值的控制,在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和2,可使值显著降低。,常用于控制的酸碱有,和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当4+浓度高于170/时会严重抑制大肠杆菌的生长。,14,基因工程菌培养,pH值的控制在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和2,培养温度,高温提高生长速度,低温增加重组菌稳定性,对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。,15,基因工程菌培养,培养温度高温提高生长速度15基因工程菌培养,诱导剂及诱导时间控制,乳糖操纵子，IPTG,诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。,16,基因工程菌培养,诱导剂及诱导时间控制 乳糖操纵子，IPTG16基因工程菌培养,基因工程菌的不稳定性及对策,基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在,重组质粒的不稳定性,：,结构不稳定性,重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失,分配不稳定性,整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。,质粒拷贝数的影响,17,基因工程菌培养,基因工程菌的不稳定性及对策基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在,质粒的拷贝数的影响,外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数，在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降，高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。,18,基因工程菌培养,质粒的拷贝数的影响18基因工程菌培养,基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制,受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解,外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢,重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配,受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,19,基因工程菌培养,基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制受体细胞中的限制修饰系,影响质粒稳定的因素,与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响,宿主对质粒稳定的影响,质粒拷贝数,重组质粒的表达对质粒稳定性的影响,培养条件的影响（培养基，温度，pH等等）,20,基因工程菌培养,影响质粒稳定的因素与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定,稳定基因工程菌的措施,改进重组质粒的结构,选择适当宿主,增加外界环境压力,调节培养条件,21,基因工程菌培养,稳定基因工程菌的措施改进重组质粒的结构21基因工程菌培养,施加选择压力,根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素,药物和食品生产时禁止使用抗生素,加入大量的抗生素会使生产成本增加,添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间,添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力,载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份,培养基复杂，成本较高,22,基因工程菌培养,施加选择压力22基因工程菌培养,分阶段控制培养,因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制,两阶段培养法：,先使菌体生长至一定密度；,再诱导外源基因的表达,23,基因工程菌培养,分阶段控制培养23基因工程菌培养,控制目的基因的过量表达,使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度,控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数,优化基因工程菌的培养工艺,培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定件较用合成培养基为高,培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定,24,基因工程菌培养,控制目的基因的过量表达24基因工程菌培养,选择合适拷贝数的菌株,在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。,25,基因工程菌培养,选择合适拷贝数的菌株25基因工程菌培养,改进质粒结构,插入促进稳定的DNA片段，删去多余的部分；去除含有转座结构的DNA片段，使用温度敏感性质粒。,26,基因工程菌培养,改进质粒结构26基因工程菌培养,固定化,固定化可以提高基因重组大肠杆菌的稳定性,基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。,在大规模生产中往往采用固定化方法,不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性,。,27,基因工程菌培养,固定化27基因工程菌培养,基因工程菌的安全性问题,美、日等国都制定了有关DNA重组实验的准则，即在试管内用酶等构建异种DNA的重组分子，并用它转入活细胞中的实验，以及使用重组体的实验应遵循的规程。其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。,28,基因工程菌培养,基因工程菌的安全性问题美、日等国都制定了有关DNA重组实验的,物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。,29,基因工程菌培养,物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界,生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。,30,基因工程菌培养,生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不,企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是：(1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置；,(2)培养装置的排气由除菌器排出；,(3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。,31,基因工程菌培养,企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS,在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有：,排气，,机械密封，,接种，,取样，,培养后的灭菌(通入湿热蒸气)，,排液(输至下一工序)。,32,基因工程菌培养,在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有,基因工程菌发酵的后处理技术,传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在下列方面：,(1)传统发酵产品多为小分子，其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因此放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。,33,基因工程菌培养,基因工程菌发酵的后处理技术传统的发酵产品和基因工程产品在提取,（2）基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。而且发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加上一般大分子较小分子不稳定(如对剪切力)，故提取较困难，常需利用高分辨力的精制方法，如色层分离等。,（3）基因工程产蛋白提取的要求纯度更高，对于安全性的要求更为严格。,34,基因工程菌培养,（2）基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了,细胞的破碎,蛋白质的浓缩与分离,35,基因工程菌培养,细胞的破碎35基因工程菌培养,基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品在化工、食品、环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。但能否实现高密度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本,最终使目标产物生产的规模化和产业化得以实现。,36,基因工程菌培养,基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品,