外源化学物致癌作用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,外源化学物的,致癌作用,Carcinogenesis of Xenobiotics,2,目的要求,掌握：化学致癌作用、化学致癌物、直接致癌物、间接致癌物、终致癌物、完全致癌物的概念，致癌物的分类（,IARC,）；,熟悉：细胞癌变过程的,3,个阶段、致癌物评价的主要方法；,了解：致癌机制、化学致癌的阻断。,3,内容,一、化学致癌作用与致癌物,二、化学致癌机制,三、化学致癌物的分类,四、化学致癌物的评价,五、化学致癌过程的阻断,4,第一节,化学致癌作用与致癌物,一、概 述,癌症是严重威胁人类健康和生命的疾病。,恶性肿瘤,发病和死亡率不断增高,，且,发病年龄年轻化,。,在很多国家中，癌症死亡率占死因顺位的第二位，甚至,第一位,。,5,据,IACR,的癌症发病资料,全球每年新发癌症患者总数约为,840,万，其中发达国家约占,46,，发展中国家占,54,。,每年全世界约有,700,万人死于癌症。,6,2006,年中国城乡居民主要死亡原因统计结果显示，恶性肿瘤已成为中国城乡居民首要死因（,2007,年,5,月,8,日卫生部）。,与,2005,年相比，城市和农村居民恶性肿瘤的死亡率分别上升了,18.6,和,23.1,，呈显著增高状态。,7,8,全世界新发癌症患者中，仅中国就占有,1/5,。,肿瘤是我国劳动年龄人口尤其是最佳劳动人口的首要死亡原因，在,35-59,岁年龄人口中，所有年龄组的第一位死因都是肿瘤。,只有,60,岁以后脑血管或心血管疾病才上升为第一位死亡原因。,9,降低癌症的发生率和死亡率,是整个医学面临的重大挑战。,10,化学物致癌的历史可追溯到数千年前,Edwin Smith,的文献中关于乳腺癌的记载。,1700,年，,Ramazzini,描述了第一例职业肿瘤。他注意到修女中乳腺癌高发，并将其归因于独身生活。,二、化学物致癌研究简史,11,1775,年,Pott,指出煤烟、煤焦油可引起烟囱清洁工发生,阴囊癌,。,1915,年日本,Yamagava,和,Ichikawa,用煤焦油涂抹兔耳成功地诱发了实验性皮肤癌。,1922,年英国,Kennway,从煤焦油中分离出多种,多环芳烃类,物质，其中有几种可诱发动物皮肤癌，证实了化学物质的致癌性。,12,1930,年生产出第一个致癌性多环芳烃,二苯并蒽，并证实其可诱发小鼠皮肤癌。,1932,年强致癌物,苯并,(a),芘,的分离和合成获得成功。,13,1895,年，德国外科医生,Rehn,又发现苯胺染料生产厂工人,膀胱癌,发病率高。,1937,年，美国人,Huepper,用狗做实验证明苯胺工人接触的联苯胺和,2-,荼胺可致膀胱癌。,1945,年英国,Case,对染料工业膀肮癌流行病学调查，证实,2-,荼胺,及,联苯胺,的致癌性。,14,研究发现，通常在染料化工发展,15-20,年后,，职业性,膀胱癌,相继发生。,德国,1860,年始制造染料，,1895,年首先报道品红染料生产工中,3,例膀胱癌；,美国染料生产始于,1917,年，,1934,年出现职业性膀胱癌；,日本的染料化工,1925,投产，报道首例职业性膀胱癌的时间是,1940,年；,我国的染料生产大约在,1940,年开始，,1959,年天津报道第,1,例职业性膀胱癌。,肿瘤发生是宿主与环境之间发生复杂、动态的相互作用过程,宿主因素,：遗传构成和健康状况。,环境因素,：一般估计，,80-90,的人类肿瘤与环境有关。包括物理因素，生物因素，化学因素。,其中主要是,化学因素,。占,70-90,以上。,15,归因于环境因素的癌症死亡构成比,17,要降低肿瘤的发生率，首先必须识别、鉴定化学,致癌因素,和有害的生活方式，并阐明其,作用机制,，然后采取措施加以防治。,18,三、有关概念,肿瘤,：指有分裂潜能的细胞受致癌因素的作用后发生克隆性增生和恶性转化所形成的新生物，在人体任何部位、任何组织都可以发生。,良性肿瘤,癌,：上皮细胞的恶性病变,肉瘤,：间质细胞的恶性病变,毒理学中“癌”的概念是广义的。,19,化学致癌作用,(chemical carcinogenesis),化学致癌物引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。,化学致癌物,(chemical carcinogen),应用于未经其他物质作用过的动物后，能引起一种或多种组织恶性肿瘤发生率升高，并且与未处理动物相比，统计学差异有显著性的化学物。,20,第二节 化学致癌机制,一、与致癌作用有关的代谢,代谢活化：,有些致癌物通过不同的途径进入人体后，需经过,、,相代谢，所产生的代谢产物才有致癌活性。这个过程成为代谢活化。,代谢灭活：,各种有活性的致癌物经历不同的代谢过程成为致癌性减弱，极性增高的产物排出体外。这个过程成为代谢灭活。,前致癌物,(precarcinogens),：本身不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其所形成的代谢产物才具致癌作用。,近致癌物,(proximate carcinogens),：前致癌物经代谢活化过程形成一种或一系列中间代谢产物。,终致癌物,(ultimate carcinogens),：不需代谢活化的直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所形成的具有致癌作用的代谢产物的统称。,体内,致癌物,靶部位,活性致癌物,致癌性下降、极性高的产物,体外,靶分子,灭活,活化,代谢灭活,代谢活化,致癌,有效剂量,直接致癌物,23,苯并,(a),芘在体内的代谢活化,AHH:,芳烃氢化酶,EH:,环氧化物水化酶,AHH,环氧化物,B(a)P,极性增加，,易排出体外,代谢灭活,GSH-S,复合物,GST,EH,7,8-,二醇,-9,10,环氧化物等,7,8-,二氢二醇等,P450,与,DNA,结合活性最高，是,B(a)P,主要终致癌物,代谢活化,24,二、化学致癌过程,化学致癌作用机制目前还有许多尚未彻底阐明。一般认为，化学致癌作用是一个,多因素,、,多基因,参与的,多阶段,过程。,25,肿瘤的发生是一个长期的、多阶段改变累积的过程，具有多基因控制和多因素调节的复杂性。目前较公认的阶段学说认为,至少包括,3,个阶段,引发阶段,(initiation),促长阶段,(promotion),进展阶段,(progression),该学说已在,动物实验模型,中得到证实。,26,1,、引发阶段（启动阶段）,致癌物直接作用于,DNA,的初级序列，引起基因突变，使单个细胞或少量细胞发生永久性的、不可逆的遗传性改变，成为具有发展为肿瘤潜能的突变细胞，称“,引发细胞,”或“启动细胞”,(initiated cell),。,致癌物,不可逆,地将正常细胞转变为肿瘤细胞的起始步骤。,引发剂,(initiator),或启动剂,：具有引发作用的化学物质。,27,引发剂可,直接改变细胞遗传物质,DNA,的成分或结构。,一般一次接触即可完成，,历时短,。,剂量,-,反应显示没有可测定的阈值，无可测定的最大反应。,不可逆,。但并非所有引发细胞都构成肿瘤，其中大多数将凋亡。,需要通过一次或多次细胞分裂加以固定。,引发阶段的主要特征,28,引发细胞在形态上与正常细胞很难区别。,引发细胞不,具有生长自主性，因此不是肿瘤细胞,。,只有引发无促长时不导致肿瘤,。,引发剂作用的靶主要是原癌基因和肿瘤抑制基因。,对外源化学物及其他化学因子敏感。,29,2,、促长阶段,为化学致癌作用第二阶段。引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤（引发细胞群）的过程。,促进作用选择性地使启动细胞增殖加快或细胞凋亡减缓，实现克隆扩增，导致局部增殖并引起良性局灶性病理损害如乳头瘤、结节或息肉。,促长剂（,promotor,）或促癌物：,具有促长作用的化学物质，称为促长剂。,30,促长阶段主要特征,促长必须在引,发之后,。,只有促癌物的慢性作用而没有引发作用也不会引起肿瘤。,剂量,-,反应曲线显示有可测定的阈值，有可测定的最大效应。,促长阶段,历时较长,，是长期、慢性的作用，必须持续和反复暴露（特别在早期），才能引起肿瘤。,促进剂有一定的物种特异性，有些具有器官特异性。,31,促癌物通常是非致突变物。早期有,可逆性,，很多病损会消退，仅少数细胞发生进一步突变引成恶性肿瘤。,对生理调节因素的敏感，如衰老、饮食和激素。,促长阶段是肿瘤形成过程较,易受干扰,的阶段，是最容易取得,预防,效果的阶段。,32,3,、进展阶段,化学致癌作用的第三阶段，指从癌前病变或良性肿瘤转变成恶性肿瘤，并进一步演变成更具侵袭特征的肿瘤的过程。,在进展阶段肿瘤获得恶性化的特征，在形态上或功能代谢和行为方面逐渐表现出如生长加快、侵袭、转移、抗药性及生化、免疫性能改变等。,进展剂,（,progressor,）或,催展物,：作用于促长阶段的细胞转变成进展期的化学物,。,肿瘤的发生、发展非常复杂。引发、促长和进展,三个阶段常难以清楚地界定,。,动物实验致癌模型中，某些致癌物的致癌过程的阶段划分较明确。,人由于可同时或反复接触引发剂、促长剂或致癌剂，而且一种因素可以起多种作用，致癌分期不很清楚。,完全致癌物,（,complete carcinogen,）兼有引发剂、促长剂和进展剂作用的化学致癌物。,促长期是最可能控制癌症发生,的环节，可在此期进行采用化学预防，如使用促长剂抑制剂（如维生素,A,类）、抑制促长期转变成进展期的抑制剂（如抗氧化剂）等。,34,35,亚致癌剂量涂抹,小鼠皮肤，,20,周,巴豆油涂抹,同一部位,20,周,苯并,(a),芘,不发生肿瘤,皮肤癌,启动剂,促癌剂,不可逆,可逆,36,正常上皮,上皮过度增殖,早期腺瘤,中期腺瘤,晚期腺瘤,癌症,转移,结肠癌的多阶段模型,引发阶段,:,促长阶段,:,进展阶段,:,正常细胞转变为突变,(,引发,),细胞,肿瘤细胞分裂增殖，形成癌前恶变或良性肿瘤,(,引发细胞群,),癌前恶变或良性肿瘤转变成恶性肿瘤,37,三、化学致癌机制学说,肿瘤的发生是一复杂的生物学过程。,是细胞遗传物质异常的结果，也涉及机体的内环境的各种因素，包括机体的免疫能力、各种生长因子和生物活性物质。,至今化学致癌机制还未完全阐明。,38,目前主流的化学致癌机制学说为,体细胞突变致癌学说,：即造成,DNA,损伤而引发肿瘤的遗传毒性机制，专指,DNA,碱基序列的改变，可通过细胞分裂传递给子代。,非突变致癌学说,：即对,DNA,以外靶分子作用的非遗传毒性机制。,目前认为化学致癌物诱导肿瘤发生可能是两种机制共同作用，即相互作用，共同控制细胞癌变的过程。,39,一、化学致癌作用的遗传毒性机制,大多数环境因素的致癌作用都是通过影响遗传基因起作用的,，肿瘤是细胞中多种基因突变累积的结果。,40,大多数致癌物同时也是致突变物。,对某些致癌物的易感性取决于细胞代谢活化酶转化致癌物成为致突变物的活力。,DNA,修复能力的缺失增加癌发生的可能性。,在多种癌观察到染色体和基因组的不稳定性。,41,某些癌具有可遗传性。,某些癌有突变的癌基因。,某些癌有肿瘤抑制基因的丢失或突变。,许多致癌物的致突变和致癌性质取决于它们是否能转变为亲电子的代谢产物。,DNA,加合物的水平通常与致癌性和致突变性成正相关。,42,（一）,DNA,加合物,（二）,DNA,修复与致癌过程,（三）癌基因、原癌基因和抑癌基因,1,、癌基因和原癌基因,2,、抑癌基因,43,生物转化,酶系统,致癌物,代谢活化,DNA,加合物,DNA,分子,部分恶性转化,肿瘤,(,一,)DNA,加合物,修复失败,终致癌物,(,亲电基团,),DNA,突变,44,DNA,加合物提供了致癌物暴露和,DNA,原始损伤的证据，反映致癌物吸收、代谢和修复等互相作用的综合效应，代表致癌物的生物有效剂量。,DNA,加合物的数量,与,致癌性,有密切关系。,DNA,加合物可作为人类肿瘤的接触（效应）,生物学标志,。,45,(,二,)DNA,修复与化学致癌,化学致癌物对于人体内,DNA,损伤的方式是多种多样的，机体对,DNA,损伤相应有了多种形式的修复机制。,DNA,修复有两种后果：,一是正确修复，,使机体内受损的,DNA,完全回复原有的结构和功能。,一是错误修复，,指经修复的,DNA,部分仍可能在结构和功能上有缺陷。通常，经错误修复的细胞，尽管能够生存并保持了部分功能，但其代价是,出现突变,。,46,突变的出现呈现为,损伤,-,修复,-,突变,模式，即,DNA,损伤能够正确修复，突变就不会发生；如果修复错误或未经修复，进行,DNA,复制后，可出现突变。,损伤,-,修复,-,突变,-,肿瘤，,所以，,DNA,修复与化学致癌作用在一定程度上相关。,47,（三）原癌基因、癌基因及抑癌基因,癌基因与抑癌基因的发现对于阐明肿瘤的发生机制、肿瘤的基因治疗以及抗肿瘤药物的发展提供了科学依据。,48,原癌基因、癌基因,原癌基因（,prooncogene,）,，即癌基因的原型，普遍存在于正常动物细胞的基因组内，在进化过程中高度保守，具有正常的生物学功能，对细胞增殖、分化和信息传递的调控起重要作用。,截至,2004,年，已经发现超过,100,种的原癌基因。,49,癌基因,(oncogene),原癌基因受到致癌因素（膳食和营养因素、化学致癌、某些病毒、放射线等）作用激活即活化为,癌基因,，显示致癌活性。,癌基因是显性基因。,在自然或实验条件下具有诱发恶性转化的潜在能力，是致癌物的主要靶分子。,癌基因指导合成的蛋白质能够促成细胞恶性表型的形成。,50,抑癌基因,(anti-oncogene),又称,肿瘤抑制基因,（,tumor suppressor gene,）或,抗癌基因,，是正常细胞生长、增殖和分化的负性调节因子，其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂活性。,可抑制肿瘤细胞的肿瘤性状的表达。,抑癌基因为隐性基因，只有处于纯合失活状态时，细胞才会因正常抑制的解除而恶性转化。,51,抑癌基因的产物能阻断肿瘤的细胞生长，抑癌基因突变后丧失其功能。,抑癌基因,失活,肿瘤细胞增殖失控。,52,遗传毒性致癌物主要通过原癌基因突变激活为癌基因和,/,或抑癌基因突变失活引起致癌作用。,正常细胞转化为肿瘤细胞涉及两类基因的遗传学改变，即,癌基因和抑癌基因的改变。,53,二、化学致癌的非遗传毒性机制,有的化学致癌物对细胞,DNA,并无致突变作用，用常用,致突变试验方法不能检出,其致突变性。,当基因以外的物质或因素如蛋白质、,RNA,、生物膜发生了改变，而使与细胞生长、分化有关的基因异常地关闭或启动表达，这样的细胞就可能转化为癌细胞。,表观遗传学,细胞异常增生,免疫抑制,激素失调,54,第三节 化学致癌物的分类,一、根据人类和动物致癌作用证据分类,自,1971,年起，,WHO,下属,IARC,根据对人类和对实验动物致癌性资料，以及实验系统和人类其他有关的资料，将各种化学物质（并扩展到物理因子、生物因子）分类。,55,其分类只与致癌物的,证据权重,有关。,将化学物对,人,类和,动物,致癌资料分为,4,级,致癌证据充分,(sufficient),致癌证据有限,(limited),致癌证据不足,(inadequate),证据提示缺乏致癌性,(lack of carcinogenicity),56,目前估计有,7000,种化学物已经过动物致癌试验，其中约,1700,种为阳性反应。,至,2012,年,3,月，,IARC,已评价,951,种化学物、混合物和接触环境，,根据对人类和对实验动物致癌性资料，及其他有关资料进行综合评价,，,将环境致癌因素分为,四类,。,57,58,组,l(group 1),：对人类是致癌物,(carcinogenic to human),对人的致癌性有足够,(sufficient),的证据。,某种因子对人致癌性证据尚不足够,(1ess than sufficient),，但实验动物致癌证据足够,(sufficient),和暴露人体有该因子强有力的致癌机制证据,(strong evidence),时，也可归为此类。,107,种，如砷及其化合物、黄曲毒素、苯、雌激素、氯乙烯、镉及其化合物、镍化合物、铍及其化合物、酒精饮料、槟榔与烟草同嚼、腌鱼,(,中国式,),等。,组,2(group 2),根据流行病学、动物致癌及其他有关资料分为,2A,和,2B,两类。,59,组,2 A(group 2A),：对人类很可能是致癌物,(possible carcinogenic to human),对人的致癌性的流行病学证据有限,(limited evidence),，在实验动物的致癌证据足够,(sufficient),。,某些情况下，将对人的致癌性证据不充分,(inadequate evidence),、在实验动物的致癌证据足够,(sufficient),、有在人体同样发挥作用的致癌机制的强有力证据,(strong evidence),的因子归于此类。,63,种，苯并,(a),芘、多氯联苯、氧化苯乙烯等。,60,组,2B(group 2B),：对人类是可能致癌物,(probably carcinogenic to human),对人的致癌性有有限的证据,(1imited evidence),，动物致癌性证据不足够,(less than sufficient),。,或对人致癌性证据不充分,(inadequate evidence),，实验动物致癌证据足够,(sufficient),。,某些情况下，将对人的致癌性证据不充分,(inadequate evidence),而实验动物的致癌证据有限,(1immited evidence),，但具有其他相关资料的支持证据,(supporting evidence),的化学物、混合物和接触环境归为此类。,271,种，如四氯二苯并对二噁英,(TCDD),、苯乙烯、乌拉坦。,61,组,3(group 3),：对人的致癌性尚不能确定,(unclassifiable as to carcinogenicity to human),对人的致癌性证据不充分,(inadequate evidence),，动物致癌性资料也不充分或有限,(inadequate or limited),的化学物、混合物和接触环境。,对人的致癌性证据不充分,(inadequate evidence),，动物致癌性资料足够,(sufficient),，但有强有力证据,(strong evidence),表明动物致癌机制在人体不适用的化合物、混合物和接触环境也归此类。,509,种，如丙烯醛、丙烯酸、偶氮苯、氯消毒饮用水等。,62,组,4(group 4),：可能对人类不致癌,(probably not carcinogenic to human),证据提示在人类和动物不具致癌性,(lack of carcinogenicity),的化学物、混合物和接触环境。,有时，将对人的致癌性证据不充分,(inadequate evidence),，动物不具致癌性,(lack of carcinogenicity),，并被大量其他相关资料一致和强有力支持的因子或混合物归为此类。,仅,1,种，己内酰胺。,63,美国,EPA,1986,年致癌物危险性评价方法将致癌物分为六类,A,：人的致癌物，,B1,：人的可能致癌物，,B2,：或许为人的致癌物，,C,：可疑的人类致癌物，,D,：证据不足尚不能进行分类，,E,：人类非致癌物。,64,1996,年，美国,EPA,又建议将致癌物分为三类,已知,/,可能,(know/likely),不能确定,(cannot be determined),不可能,(no 1ikely),65,2005,年美国,EPA,致癌危险性评价指南最终报告以证据权重分为五类,对人是致癌性的,(carcinogenic to humans),对人可能是致癌的,(likely to be carcinogenic to humans),证据提示有致癌可能,(suggestive evidence of carcinogenic potential),评价致癌性的信息不足,(indicate information to access carcinogenic potential),对人可能不是致癌性的,(not likely to be carcinogenic to humans),66,欧共体（,EEC,）,分为,三组,已知为人类,致癌物,(know to be carcinogenic to humans),认为是人类,致癌物,(regarded as of carcinogenic to humans),证据不足以进行满意的评价,(causes concern due to possible carcinogenic effects),67,68,1,、遗传毒性致癌物,(genotoxic carcinogens),进入人细胞后与,DNA,共价结合，引起机体遗传物质改变，导致癌变的化学物质。这类致癌物约占化学致癌物的大多数，因其作用机制是损伤遗传物质，故可利用,遗传毒理学试验来检测,这类致癌物。,二、根据化学致癌物作用模式分类,69,(1),直接致癌物（,direct carcinogens,）,本身直接具有致癌作用，在体内不需要经过代谢活化即可致癌。例如，各种烷化剂，其大多为亲电子反应物。,(2),间接致癌物,(indirect carcinogens),本身并不直接致癌，必须在体内经代谢转化，其所形成的代谢产物才具致癌作用。例如，多环芳烃、芳香胺类化合物等。,70,2,、非遗传毒性致癌物,(epigenotoxic carcinogens),指不作用于机体遗传物质的化学致癌物。非遗传毒性致癌物包括以下几种：,71,（,1,）促长剂,（,2,）内分泌调控剂,（,3,）免疫抑制剂,（,4,）细胞毒剂,（,5,）过氧化物酶体增殖剂,（,6,）固态物质（膜片）,（,7,）助癌物,72,三、根据致癌物是否需要活化来分,（,1,）前致癌物,（,procarcinogen,）,（,2,）近致癌物（,proximate carcinogen,）,（,3,）终致癌物（,ultimate carcinogen,）,73,四、按化学结构分类,（,1,）烷化剂：芥子气、甲醛、氯甲醚,（,2,）多环芳烃类：煤焦油、二苯蒽,（,3,）芳香胺类：乙萘胺、硝基联苯,（,4,）氨基偶氮染料,（,5,）亚硝胺类化合物,（,6,）黄曲霉毒素,（,7,）植物毒素,（,8,）金属致癌物：镍、铬、镉,74,第四节,化学致癌物的评价,化学致癌物危险评价包括两方面,一是,定性,的，即该化学物能否致癌；,二是,定量,的，即进行剂量,-,反应关系分析，推算可接受的危险度的剂量或人体实际可能接触剂量下的危险度。,75,一、定量构效关系分析,构效关系分析从一种同系物着手，找出该系物质化学结构中与致癌性关系最密切的,结构成分,，以及其他构分改变时对其致癌性的影响。,如对数百种,PAHs,类化合物的小鼠皮肤癌诱发试验结果做的构效关系分析表明，不仅化学结构的微小变化都关系着致癌性的强弱，而且与其立体结构的变化也有密切关系。,二、遗传毒性试验,遗传毒性试验即,致突变筛检试验,，,又称为短期致癌物筛检试验。,致突变筛检试验的理论依据是：,化学物的,致突变性与致癌性相联系,，即,大多数致癌物具有致突变性，而大多数非致癌物无致突变性。,76,77,局限性：,无法确定非遗传毒性致癌物,(,假阴性,),和具有遗传毒性的非致癌物,(,假阳性,),。,致癌物的筛选需,一组致突变试验,，最好每一遗传学终点均有一个试验。假如在组合试验中有一项是阳性结果，即可认为该受试物为致突变物。组合试验中出现的阳性结果愈多，受试物致癌的可能性就愈大。,Ames,试验,是应用筛检致癌物最广泛和最敏感的致突变试验。,78,三、细胞恶性转化试验,体外培养,条件下，细胞在有害因素（受试物）作用下发生一系列与肿瘤形成有关的细胞形态学及生物学特性的改变。,观察内容,包括：生长自控能力、细胞形态、细胞生长能力、生化表型以及移植于动物体内形成肿瘤的能力等。,在,敏感宿主中的成瘤性,是确定转化细胞恶性变性质的可靠指标。,79,常用细胞,原代细胞,：常用叙利亚仓鼠胚体细胞,(SHE,细胞,),、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等。,细胞系,：常用细胞系,BALB/C-3T3,，,C3Hl0Tl/2,和,BHK21,；,病毒感染细胞,：如,RLV/RE,细胞,(,劳舍尔白血病病毒感染,Fisher,大鼠胚胎细胞,),和,SA7/SHE,细胞,(,猿猴腺病毒感染的,SHE,细胞,),。,80,试验的观察终点：,恶性变的细胞,细胞偏大，且大小不等,核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚，核仁增生而肥大,多见核分裂现象,正常的接触抑制消失，它的克隆不是单层细胞且细胞排列有序，而是多层细胞且细胞排列紊乱,生长表型的改变,如将此种细胞,移植于动物体内（一般为裸鼠）可形成肿瘤,。,由于它不以致突变为观察终点，可以弥补以致突变试验来筛查化学致癌物的不足，即它,可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物,。,81,82,局限性,本试验所指的转化大多数为形态转化或恶性前期转化。它们可以发展成为真正的恶性变，但亦可能到此为止，其,结局不一定形成肿瘤,。,动物短期致癌试验,（,long-term carcinogenicity study),也叫有限动物试验,（,limited,in vivo,bioassay,）或,中期致癌试验（,medium-term test,）,哺乳动物长期诱癌试验,（,limited carcinogenicity study),即终身试验（,life-time test,）,83,四、哺乳动物致癌试验,84,在哺乳动物致癌试验中，发现受试化合物对某些,特定组织,的致瘤作用比对其他组织更为明显，据此建立了比常规动物致癌试验时间更短，更敏感的哺乳动物短期致癌试验，又称为有限体内试验。,在这些试验中仅观察特定靶器官的肿瘤发生情况，试验期限一般,在数周到数月,。,1,、动物短期致癌试验,在有限的短时间内完成而不是终生，又指观察的靶器官限定为一个而不是全部器官和组织。主要有四种：,小鼠肺肿瘤诱发试验,大鼠肝转变灶试验,小鼠皮肤肿瘤诱发试验,雌性,SD,大鼠乳腺癌诱发试验,。,小鼠肺肿瘤诱发试验,一次或多次给予受试物后，或一次给予受试物一至两周后持续多次给予促癌剂，,16,周至,30,周左右结束试验。如在肺组织发现肿瘤，可认为受试物具有诱发肿瘤作用。,大鼠肝转变灶诱发试验,肝癌发生过程有几种明显肝细胞病灶，较早发现的是转变灶，进一步发展为瘤性结节。,用酶组织化学和免疫组织化学方法将转变灶和结节中的谷氨酰转肽酶和胚体型谷胱甘肽转移酶染色，显色表明有肝癌细胞生化表型的癌前细胞。,86,87,小鼠皮肤肿瘤诱发试验,小鼠皮肤表面涂抹某些致癌物能诱发乳头状瘤或癌，皮下注射可诱发肉瘤。,一般,9,个月左右结束试验，如在启动后加用佛波醇酯，则缩短至,20,周左右。,适用于煤、石油和烟草的焦油以及其中所含的多环芳烃，还有许多直接致癌物如硫芥、氮芥、双氯甲醚和丙环内醋等。,雌性,SD,大鼠乳腺癌诱发试验,适用于多环芳烃、芳香胺、氯烷、亚硝基脲等。能在,9,个月以内诱发乳腺癌。,肺和肝是最常见的发生肿瘤器官，也是许多致癌物的靶器官，故小鼠肺肿瘤和大鼠肝转变灶试验的应用价值较高。,上述任一试验的,阳性结果，其意义与长期动物致癌试验相当,。,由于实验期短，又未检查其他器官和系统，特别是皮肤肿瘤和乳腺癌的诱发试验一般仅适用于较小范围的化学物质类型，所以哺乳动物短期致短试验,阴性结果的意义较差,。,88,89,2,、哺乳动物长期致癌试验,是目前公认的,确认动物致癌物的经典方法,。,用来确定受试物对试验动物的致癌性、剂量,-,反应关系及诱发肿瘤的靶器官等。,化学致癌的最大特点是,潜伏期长,。啮齿类动物,1-2,年的试验，相当于人类大半生的时间。,动物试验可,严格控制试验条件,，而人群流行病学调查不易排除混杂因素的影响。,局限性,需时长（约,2,年），耗费人力、物力大，需用的染毒剂量大。,致癌试验所用的动物种系有限，试验用动物数量也有限,。,最大,局限性,是动物试验结果,外推,至人存在不确定性。,动物长期,致癌试验的一般原则,人体可能长期暴露于该化学物；,该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；,短期,染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变等。,91,92,(1),动物选择,物种的选择,：,根据动物对,肿瘤的易感性,，选择具有特定靶器官的物种和品系。,如果无法知道受试物的靶器官时，可选用两种啮齿类动物。,应选择,自发肿瘤率,低的物种。,啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，使用最广泛。常用的是,大鼠和小鼠,，也可用,仓鼠,。为避免动物种属敏感性的差异影响评价的结果，一般也用,两种物种,进行试验。,93,年龄,：,断乳或断乳不久,的动物。,性别,：,一般是,雌雄各半,。除非已证明该受试物结构近似的致癌物有易感性性别差异。,动物数量,：,原则上根据对照组肿瘤的自发率及试验组肿瘤的发生率来确定。对照组自发率越低及试验组发生率越高，每组需要的动物数越少。一般每组动物数为,雌雄各,50,只。,（,2,）,染毒方式,根据受试物的理化特性和对人有代表性的接触方式,，,多为,经口和经呼吸道,接触染毒,。,也可经皮。,94,胃肠道,染毒,最好,采,用口服,，,把受试物混入饲料、饮水中，或用管饲法连续给予动物。混入饲料中的受试物的最高浓度不应超过,5%,。,若受试物有异味影响动物自由摄入，可采用灌胃法。应保证实验动物的营养平衡。,营养成分受试物应尽可能采用高剂量,。,较理想的应是每周,7,天均,染毒,，,也可,每周,5,天,。,但是中断染毒可使动物得到恢复或毒性缓解。,95,呼吸道染毒,每日接触时间依试验要求而定,。,工业毒物试验通常每日吸,入,4-6,h；,环境污染物每日吸,入,8,h,或更长。,96,97,(3),剂量设计,l,个对照组,(,必要时设阳性对照组）,3-5,个染毒剂量组：,最高剂量为最大耐受剂量（,MTD,NCI,）。,最低剂量最好相当于人类实际可能接触的剂量。,等比差别，,1/4-1/2,。,98,（,4,）试验期限与染毒时间,原则上试验期限要求,长期甚至终生,，最少不低于受试动物寿命的,2/3,时间。一般情况下小鼠,1.5-2,年，大鼠,2-2.5,年。,一般染毒直至试验结束。,出现第一个肿瘤时，每组还有不少于,25,只动物。,当最低剂量组或对照组存活的动物只有,25,时，可以结束试验。,有明显性别差异的试验，结束时间对不同的性别应有所不同。,因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。,一个合格的阴性对照试验应符合：,因自溶、同类自食，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于,10,。,小鼠和仓鼠在,18,个月，大鼠在,24,个月时各组存活的动物不能少于,50,。,101,(5),结果的观察、分析和评定,每天密切观察动物,1-2,次，及时发现濒死动物并进行病理学解剖。,试验最初三个月每周,称体重,一次，以后每,4,周称体重一次。,掺,入,饲料或饮水中染毒时，应记录,食物消耗量或饮水量,。,发现第一例肿瘤时存活的动物数，作为试验终结时的,有效动物数,。,体表及体内各组织器官均应肉眼观察，找出可疑肿块，并进行组织病理学检查。,确定肿瘤的性质和,靶器官,。对已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。,102,致癌试验常用的指标,肿瘤发生率：是最重要的指标,肿瘤总发生率；,恶性肿瘤总发生率；,各器官或组织肿瘤发生率和恶性肿瘤发生率；,各种类型肿瘤发生率。,103,104,2.,多发性,：,是化学致癌的又一特征，指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个肿瘤。,计算每组动物的平均肿瘤数。,每组中出现,2,个（或以上）肿瘤的动物数或比例。,105,潜伏期,体表肿瘤,：从接触致癌物到各组第一个肿瘤出现的时间作为该组潜伏期。,内脏肿瘤,：分批剖杀，计算平均潜伏期。或将肿瘤引起动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。,4,.,阳性结果的判断,存在,剂量,-,反应关系,，并,与对照组差异显著,时,，为阳性结果。,WHO,提出,，需满足下列反应的一种或数种,阴性对照组出现的一种或数种肿瘤，试验组均有发生，,但,肿瘤发生率高于对照组；,试验组动物发生阴性组没有的肿瘤类型；,试验组动物肿瘤发生早于阴性对照组；,试验组每个动物的平均肿瘤数超过阴性对照组。,106,107,五、促癌剂的检测,可用于促癌剂检测的试验,1.,小鼠肺癌诱发试验,2.,大鼠肝转变灶试验,3.,小鼠皮肤肿瘤诱发试验,首先选用适当的启动剂,启动,后,l-2,周开始用受试物染毒。,引发剂的剂量应较低,，不致引起或仅引起少量肿瘤。,108,由于有些促癌剂对某些器官具有特异性，上述三种试验应同时做才不致漏检。,也可做体外细胞培养试验，让受试物直接与细胞接触，以解决某些促癌剂的亲器官特性。,六、转基因或基因敲除动物在,致癌物,评价中的应用,将目的基因导入动物受精卵中，使其与细胞核染色体整合，从而获得带外源基因并能表达和遗传的动物,。,集整体、细胞和分子水平于一体，更能体现生命整体研究的效果，是目前最高层次的实验体系。,109,利用转基因动物模型可了解基因的改变与肿瘤的关系，进而了解外来物质的致癌作用,机制,。,已建立的检测或研究模型,主要,有,过量表达癌基因的转基因动物模型,基因删除动物致癌检测模型,转基因动物致癌试验,时间短,，,而且比较,敏感,，节省人力物力。,110,由于特定的癌基因的表达是针对特定组织的，因此只可针对性地用于分析特定组织的肿瘤发生情况，应用这类模型作为短期致癌试验，用途还有限。,111,112,七、人群流行病学调查,流行病学资料在确定人类致癌物中方面具,有决定性意义，是确定人类致癌物的唯一手段,。,一般先通过动物肿瘤诱发试验，根据阳性结果检出潜在的人类致癌物，或先进行描述性流行病学调查或临床观察发现可疑人类致癌物后再进行分析性流行病学研究，即病例对照研究和队列研究。,113,动物肿瘤诱发试验,描述性研究,临床观察,分析性流病学调查研究,可疑人类致癌物,人类致癌物,人群肿瘤流行病学调查程序,肿瘤流行病学调查的结果为阳性，且能够重复并有剂量,-,反应关系，又可得到动物实验的验证，则该受试物较易被承认为人类致癌物。,肿瘤流行病学调查结果如为阴性，也不能完全确定受试物为非致癌物，仅能认为未观察到致癌作用的接触条件（剂量和时间）的上限。,114,当接触年限较短或剂量较低时，流行病学调查的阴性结果不能否定对同一受试物进行另一调查的阳性结果。,任何肿瘤流行病学调查，必须,设计周密严谨,，否则无论阳性结果或阴性结果的意义均将大为降低。,116,但是完整的、可信的流行病学资料来之不易，而且对于结果的判断是后期的，,不能用于早期发现，早期阻断,。,近年来在流行病学研究中引进了生物标记，特别是,分子水平标记,的方法，使分子流行病学在一定条件下应用于判断某些化合物对人类的致癌性、致癌危险性评价以及肿瘤化学预防的干预实验等方面。,117,八、致癌物的确定和评价,动物致癌物的确定,IARC,对动物致癌物的概念较为严格：,在多种或多品系动物试验中，或在几个不同实验中，特别是不同剂量或不同染毒途径的实验中，见到恶性肿瘤发生率增高，或在肿瘤发生率、出现肿瘤的部位、肿瘤类型或出现肿瘤的年龄提前等各方面极为明显突出。,118,人类致癌物的最终判定依据,1.,肿瘤流行病学调查结果能够重复。,2.,有明确的剂量,-,反应关系。,3.,有另外的调查资料验证，或,有动,物致癌试验阳性结果支持。,第,五,节,化学致癌过程的阻断,从理论上来说，在致癌过程中的任何一个阶段上给予阻断，都可以避免或减少肿瘤的发生和发展。,119,一、,避免或减少致癌物的接触,：,对已知的致癌因素，避免或减少与其接触,。,二、,改变不良生活方式,：,吸烟、酗酒和不良饮食习惯，在引起癌症的各种化学因素中占了将近,70%,。,三、,高危人群的检出与保护。,120,121,四、,化学预防,应用天然或人工合成的化合物去阻断、逆转或预防侵袭性肿瘤的发生。,已发现可能具有肿瘤预防作用的物质达到数百种，主要是食物来源的天然化合物、人工合成药物如雌激素受体调节剂、非甾体类抗炎药物、维甲酸类化合物等。,其作用机制可在肿瘤发生过程的任一环节。,降低致癌物的吸收；,防止致癌物的生成；,促进致癌活性物质的灭活；,阻止致癌物作用于靶点；,促进损伤的修复；,阻止癌变的发展等。,122,