实验具体步骤结果

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,综合性实验 具体安排,实验思路,确定目标基因，目标生物,DNA,提取,目标基因,PCR,扩增,PCR,产物纯化,pUC19,骨架进行重组,转化大肠杆菌,重组子筛选,琼脂糖电泳,琼脂糖电泳,PCR,电泳,蓝白斑筛选,具体安排,理解实验原理（第,9,周）,第,11,周 每个小组交一份实验计划,第,12,周,DNA,提取和,PCR,第,13,周,DNA,纯化和重组转化,第,14,周,PCR,验证重组子,选定扩增基因,每个组,4,个人，可以选做两个基因片段（建议每两个人做一个基因片段）,每步工作的具体负责人和主要任务,绘一个实验流程图和构建好的载体示意图,实验计划要求,供选择基因,CG1844(G-rich,666bp),果蝇硒蛋白，功能未知,www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_004354.4?report=genbank&from=11887284&to=11888240,供选择基因,-2,CG7050(neurexin-1,，,5514bp),果蝇学习记忆相关基因,www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NT_033777.3?report=genbank&from=22468512&to=22486969,供选择基因,-3,CG8864,（,Cyp28a5,，,2900bp,）,乙醇代谢解毒相关,www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NT_033779.5?report=genbank&from=13977302&to=13979569,引物序列（红色标记为,pUC19,的同源序列）,CG1844length200,PrimerF1,5-,acacaggaaacagctatgaccatgattacgcca,aacggattgccgagtaacac,PrimerR1,5-,cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcg,actatgtggcgccttcattc,CG7050,length,250,PrimerF2,5-,acacaggaaacagctatgaccatgattacgcca,cctcgaaattgaaccgaaaa,PrimerR2,5-,cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcg,ttactgcggttgattccaca,CG8864 length 237bp,PrimerF3,5-,acacaggaaacagctatgaccatgattacgcca,gttaacatccgcagccaact,PrimerR3,5-,cacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcg,acccacacagaggcacctac,第,12,周,DNA,提取和,PCR,扩增,DNA,提取：以果蝇为例课件介绍,电泳检测,DNA,质量和大致浓度,PCR,扩增，具体操作见课件介绍原理和实验步骤。,图一 果蝇基因组,DNA,提取电泳图,Marker:15000bp,PCR,程序,Takara,公司的,Premix Taq,TM,Hot Start Version,成分,使用量,Premix Taq HS,25l,上游引物,2l,下游引物,2l,总基因组,1.5l,ddH,2,O(20l),Up to 50l,循环参数,32cycle,94,90,sec,94,30 sec,57,30 sec,72,45 sec,72,10 min,4,取,5l,扩增产物以,1%,琼脂糖凝胶电泳检测,PCR,结果。,图二,PCR,电泳检测图,M2 1 1 2 2 3 3,图二,PCR,电泳检测图,M2 1 1 2 2 3 3,图二,PCR,电泳检测图,M2 1 1 2 2 3 3,第,13,周,DNA,纯化、重组和转化,1,：,DNA,纯化，试剂盒完成，根据买回来的试剂盒来完成实验步骤,2,：重组，以,pUC19,为骨架，进行重组；购买重组酶试剂盒完成；,3,：转化,DNA,纯化,1.,实验试剂 上海生工,SanPrep,柱式,PCR,产物纯化试剂盒,2.,实验步骤,DNA,纯化,1.,实验试剂 上海生工,SanPrep,柱式,PCR,产物纯化试剂盒,2.,实验步骤,DNA,纯化,2.,实验步骤,第,13,周,DNA,纯化、重组和转化,本实验的骨架是,puc19,载体,第,13,周,DNA,纯化、重组和转化,第,13,周,DNA,纯化、重组和转化,第,13,周,DNA,纯化、重组和转化,(1 uL),(4 uL),(,灭菌,),(1 uL),第,13,周,DNA,纯化、重组和转化,转化,建议所使用的感受态细胞效率,1,10,8,cfu/g.,1,）冰上,融化一管,100 l,的,DH5a,感受态细胞,，加入,5l,已稀释的的反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育,30,分钟。,2,）,42,水浴中热激,90,秒,后快速放入冰上,3,分钟。,3,）加入,500l SOC,液体培养基,，,37,复苏,45-60,分钟。,4,）,9,000rpm,离心,3,分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在,含抗生素平板（,Amp.50-100 ug/mL),上。,5)37,培养,18-24h,后，平板置于,4,保存。,第,14,周 重组子筛选,单克隆菌落直接,PCR,PCR,原理和步骤同第,13,周。,电泳检测,菌落,PCR,从平板任意挑选,5,个菌落，用灭菌牙签挑取菌落（不要掺杂培养基及挑取过多菌体）,成分,使用量,Premix Taq HS,10l,上游引物,0.8l,下游引物,0.8l,菌落,-,ddH,2,O,Up to 20l,循环参数,32cycle,94,90,sec,94,30 sec,57,30 sec,72,45 sec,72,10 min,4,菌落,PCR,结果的琼脂糖电泳验证,1.5%agarose gel:60mL 1XTAE+0.9 g agarose+0.6 uL GoldView,Marker:Sangon DNA Marker D,Cat B600336-0260,PCR,产物,3-8 uL+Loading buffer(6X)1uL,电泳条件,130V,约,30-60 min,班级结果,:,下午（左）、晚上（右）,晚上班的从,marker,开始依次为：,1.2A,2.2A,3.2,遗传学综合性实验要求如下，,1,）实验报告以,综合性小论文,方式提交；,2,）每人自己写一份，,注明小组成员,，同时小组成员之间论文不能完全雷同，,结果图相同，文字陈述不能完全拷贝；,3,）论文重点突出同源重组问题，部分结果不理想试验组,重点分析试验中出现的问题,；论文前言最好了解一下相关资料，比如同源重组的原理以及相关基因的信息；,4,）实验论文提交最后时间为,2015,年,6,月,15,日,（第,16,周星期一）。,5,）针对图的结果，都要把自己小组的结果陈述清楚，不能只有图，没有文字！,最后论文成绩占总成绩,30%,喔！,实验课成绩,总成绩,=7,次基础实验平均成绩*,60%+,论文成绩,*30%+,平时成绩,*10%,