育种出发菌的分离筛选课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第五章 育种出发菌的别离筛选,第五章 育种出发菌的别离筛选,向,菌种保藏机构索取,有关的菌株。,菌种来源的途径,国内外著名的菌种保藏机构有：,CCCCM(中国微生物保藏管理委员会,ATCC(美国典型菌种保藏中心,NCTC(英国国家典型菌种保藏所),IFO(大阪发酵研究所),2.从一些发酵制品中别离目的菌株。容易筛选到较理想的菌株。,3.由自然界采集样品中获得。如土壤、水、动植物 体等，从中进展别离筛选。容易发现新的菌株资源。,2024/8/9,2,向菌种保藏机构索取有关的菌株。菌种来源的途径国内外著,菌株别离与筛选,菌株别离(separation)：是将样品中混杂生长的各种微生物通过别离技术区分开，获得所需微生物的过程。,菌株筛选(screening)：在目的菌株别离的根底上，结合常规生产性能测定，选择目的产物合成能力相对高的菌株的过程。,2024/8/9,3,菌株别离与筛选菌株别离(separation)：是将样品中混,菌株别离和筛选,2024/8/9,4,菌株别离和筛选2023/8/24,第一节 含微生物样品的采集,第二节 含微生物样品的富集培养,第三节 微生物的别离,第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定,主要内容,2024/8/9,5,第一节 含微生物样品的采集主要内容2023/8/25,第一节,含微生物样品的采集,2024/8/9,6,第一节 含微生物样品的采集2023/8/26,含微生物样品的采集,一、从土壤中采样,1,根据土壤特点采集,土壤有机质含量和通气状况,2024/8/9,7,含微生物样品的采集一、从土壤中采样1 根据土壤特点采集 土,典型的土壤层次构造,A soil profile,B,堆积枯枝落叶，下部已初步分解,腐殖质含量高，与矿物颗粒紧密结合形成暗色土层,物质淋失，颜色较浅,淋滤层淋移物质在沉积层沉积，,多形成核状、柱状、棱状结,构，较紧实,土层较深，受成土因素影响,小，保持母质特性,2024/8/9,8,典型的土壤层次构造A soil profile B堆,不同土壤类型,2024/8/9,9,不同土壤类型2023/8/29,地理条件,南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多,。,季节条件,秋季是采样的良好季节,土壤的酸碱度,2024/8/9,10,地理条件 季节条件 土壤的酸碱度 2023/8,2,土壤中采样的方法,选点,取土,装袋,标记,用取样铲，将表层5,cm,左右的浮土除去，,取5-25,cm,处的土样10-25,g,，,记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件,2024/8/9,11,2 土壤中采样的方法选点取土装袋标记用取样铲，将表层5cm,二、根据微生物生理特点采样,根据微生物营养类型,微生物的营养需要和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。,在筛选一些,具有特殊性能,的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。,根据微生物的生理特性,2024/8/9,12,二、根据微生物生理特点采样 根据微生物营养类型,局部环境条件。如：海洋、肠道、温泉、堆肥,极端环境条件。,在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端环境微生物。,三、特殊环境下采样,2024/8/9,13,局部环境条件。如：海洋、肠道、温泉、堆肥 极端环境条件。,第二节 含微生物样品的富集培养,2024/8/9,14,第二节 含微生物样品的富集培养2023/8/214,富集(enrichment)培养：是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，并创造有利的生长条件，使目的微生物在适宜的环境下迅速生长繁殖，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利别离到所需要菌株的过程。,富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧情况等生理因素加以控制。,2024/8/9,15,富集(enrichment)培养：是在目的微生物含量,一、控制培养基的营养成分,二、控制培养条件,通过对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，到达有效的别离目的。,如 pH,细菌、放线菌：一般要求偏碱(pH7.2-7.5)，,霉菌和酵母菌：要求偏酸(pH4.5-6)。,2024/8/9,16,一、控制培养基的营养成分 二、控制培养条件2023/8,三、抑制不需要的菌类,通过高温、高压、参加抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，到达富集的目的。,如：,硫乙醇酸钠造成厌氧环境，利于厌氧菌生长。,抗生素可抑制细菌生长，用于培养霉菌。,2024/8/9,17,三、抑制不需要的菌类 通过高温、高压、参加抗生素等方法,被分离的,微生物,添加物质及其浓度,被抑制的,微生物,放线菌,放线菌酮（,50,），制霉菌素（,50,），环己亚氨（,50,），匹马霉素（,50,），丙酸钠（,4mg,）,霉菌,革兰氏阴性菌,其他革兰氏阳性菌,环己亚氨,+,多黏菌素,+,枯草菌素（各,20,单位），多黏菌素,B,（,5,）,+,青霉素（,1,）,细菌,放线菌酮（,50-500,），制霉菌素（,100,），优洛杀菌素（,30-100,）（,eu-rocidin,）,霉菌、酵母菌,原虫霉素（,5,）,原生动物,革兰氏阳性菌,多黏菌素,B,（,5,）,革兰氏阴性菌,革兰氏阴性菌,青霉素（,1,），月桂酸钠（,2mg,）,革兰氏阳性菌,酵母菌,氯霉素（,100,），青霉素（,20,）,+,链霉素（,40,），玫瑰红（,50,）,+,放线菌酮（,10,）,细菌,放线菌酮,霉菌,霉菌菌,氯霉素（,100,），青霉素（,20,）,+,链霉素（,40,），玫瑰红（,35-67,）,氯霉素（,50,）,+,放线菌酮（,10,），青霉素（,100,）,细菌,细菌、酵母菌,2024/8/9,18,被分离的添加物质及其浓度被抑制的放线菌放线菌酮（50），制霉,第三节 微生物的别离,2024/8/9,19,第三节 微生物的别离2023/8/219,一、好气微生物的别离,别离的方法很多，可分为“菌落纯和“菌株纯。,1,稀释涂布法,2024/8/9,20,一、好气微生物的别离别离的方法很多，可分为“菌落纯和“菌株,2 划线别离法,2024/8/9,21,2 划线别离法2023/8/221,3 利用生化反响进展别离,饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈,固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用某种营养缺陷型微生物作为指示菌，若待筛选菌具有将前体物转化成营养物的能力，指示菌就能围绕该菌生长。,待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制指示菌生长的物质,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液,2024/8/9,22,3 利用生化反响进展别离饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片,变色圈法：,2024/8/9,23,变色圈法：2023/8/223,透明圈法,2024/8/9,24,透明圈法2023/8/224,脂酶产生菌的别离：,可采用固体平板变色圈法。,甘油三丁酸脂为底物，罗丹明 B 为指示剂，观察荧光圈；,制备维多利亚蓝乳脂琼脂培养基(pH 7.0)，将样品涂布在平板上培养，阳性反响由粉红色变为蓝色。,改进双层法：平皿底层倒一层营养琼脂，把一片浸有被维多利亚蓝染色的乳脂的圆纸片铺在上面，然后覆盖一薄层含样品营养琼脂，保温培养，阳性反响为蓝色。,2024/8/9,25,脂酶产生菌的别离：2023/8/225,4 组织别离法,是从一些罹病组织或特殊组织中别离菌株的方法。,对一般患病组织的别离方法,取样,无菌水洗涤,外表消毒,无菌水洗涤外表,植入平板，培养,镜检，别离纯化,2024/8/9,26,4 组织别离法是从一些罹病组织或特殊组织中别离菌株的方法。,食用菌孢子别离法,a.多孢子别离法,孢子采集装置,2024/8/9,27,食用菌孢子别离法a.多孢子别离法2023/8/227,NT-88NE,NT-88NE,显微,操作系统：(,NARISHIGE),适用于各种用途：转基因、遗传工程、人工受精、胚胎移植、和电生理学方面。,b.单孢子别离法,2024/8/9,28,NT-88NE NT-88NE 显微操作系统：(NARIS,5 特殊菌类环保菌的别离,在别离某类污染物或废弃物的降解微生物时，通常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进展富集培养，经过几个月的富集培养后，通过划线或涂布的方法进展在别离平板上别离、筛选。,该法在别离苯胺、DDT、甲基对硫磷MP、石油、甲胺磷等污染物降解菌时取得良好效果。,注意：环境污染物一般对微生物的生长有抑制作用，需要根据不同情况设计合理的筛选模型。,2024/8/9,29,5 特殊菌类环保菌的别离 在别离某类污染物或废弃物,二、厌气菌的别离,加复原剂,焦性没食子酸法,平皿厌气培养法,试管厌气培养法,玻璃板隔绝空气培养法,生物吸氧法,2024/8/9,30,二、厌气菌的别离 加复原剂 焦性没食子酸法 平皿厌气培,厌氧培养袋,厌氧培养罐,厌氧工作站,厌氧操作仪器,2024/8/9,31,厌氧培养袋厌氧培养罐厌氧工作站厌氧操作仪器2023/8/23,第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定,2024/8/9,32,第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定2023/8/232,一、初筛,定义：从大量别离到的微生物中将能合成目的产物的微生物筛选出来的过程。筛选的方法有以下两种：,1,平板筛选,用于在别离纯化阶段随机挑选的菌株，用选择性平板进展定性测定。,特点：快速，简捷，效率高。,2024/8/9,33,一、初筛 定义：从大量别离到的微生物中将能合成目的产物,2,摇瓶发酵筛选,用于经过定性筛选的菌种，通过摇瓶发酵进一步测定菌株相互之间产物活性的差异。,特点：比较接近发酵罐培养条件。,接种发酵,制作,含指示菌或底物,的琼脂平板,琼脂平板打孔,加发酵液,测透明圈,2024/8/9,34,2 摇瓶发酵筛选 用于经过定性筛选的菌种，通过摇瓶发酵,二、复筛,将初筛得到的菌株进展发酵罐发酵，然后准确分析如：电泳、色谱、质谱等精细仪器测定其确切的产量水平，从而确定用于生产的菌株的过程。,复筛的工作：优化培养基成分；注意各种培养条件对菌体量或产物量的影响，并对各种影响因子进展组合实验，初步掌握该菌的适合培养条件。,三、筛选结果评价,2024/8/9,35,二、复筛 将初筛得到的菌株进展发酵罐发酵，然,Thanks for your attention,2024/8/9,36,Thanks for your attention2023,思考题,1、菌株别离和筛选的一般过程是什么？,2、利用生化反响进展菌株别离的主要方法有哪些？,2024/8/9,37,思考题1、菌株别离和筛选的一般过程是什么？2023/8/23,