克隆基因的表达

遗 传 信 息 从 DNA到 蛋 白 质 的 传 递 过程 中 心 法 则（ central dogma） 。 外 源 基 因 在 宿 主 细 胞 中 表 达 。外 源 基 因表 达 载 体 重 组 载 体 导 入 宿 主 细 胞在 宿 主 细 胞 中 表 达 出 蛋 白 质提 取 蛋 白宿 主 细 胞 ： 原 核 细 胞 或 真 核 细 胞 。 5、 mRNA5端 有 SD序 列 ， 是 mRNA结 合 到 核 糖体 上 必 需 的 。2、 基 因 的 表 达 是 以 操 纵 子 为 单 位 进 行 协 同 表 达 。3、 原 核 生 物 转 录 和 翻 译 是 偶 联 的 。4、 基 因 不 含 内 含 子 ， 真 核 生 物 mRNA在 原 核 生 物中 表 达 不 能 成 熟 。 表 达 载 体 的 必 要 元 件 TTGACAsextama box TATAATTGTACA 必 须 是 一 种 强 启 动 子能 使 外 源 基 因 的 蛋 白 产 量 达 到 细 胞 总 蛋 白 的10%-30%以 上 。 应 是 可 诱 导 型 的便 于 表 达 毒 性 蛋 白 等 。 应 呈 现 低 水 平 的 基 础 转 录用 温 度 或 化 学 试 剂 诱 导 。 CAP IAA与 Trp结构 相 似 ， 可 以与 阻 遏 蛋 白 结合 。 通 过 添 加IAA可 诱 导 P介 导 的 目 的 基因 的 表 达 。 调 节 基 因 cI ： 选 择 一 个 温 度 敏 感 性 的 突 变 基因 cI857， 克 隆 到 载 体 上 。42oC时 阻 遏 蛋 白 失 活 ， 外 源 基 因 大 量 转 录PL 外 源 基 因30oC时 阻 遏 PL， 外 源 基 因 不 转 录 。从 噬 菌 体 得 到 的 一 类 启 动 子 , PL、 PR是 否 转 录 与CI基 因 产 物 有 关 ， 决 定 了 噬 菌 体 是 进 入 溶 源 循 环 还是 溶 菌 循 环 。 RNA 聚 合 酶 滑 过 终 止 子 继 续 转 录 质 粒 上 邻 近 DNA 序列 ， 形 成 长 短 不 一 的 mRNA 混 合 物 。强 终 止 子 保 证 载 体 不 会转 录 非 必 须 基 因 ， 不 必浪 费 源 料 和 能 量 、 不 干扰 正 常 的 表 达 。 5-AG G AG G U-3 ？ ？ ？ ？S-D序 列 后 面 的 4个 碱 基 ： 如 是 A（ U） , 翻 译 效 率最 高 ； 如 是 G （ C） ,效 率 只 有 50%或 25%。u核 糖 体 结 合 位 点 对 外 源 基 因 表 达 的 影 响SD 与 AUG 的 距 离 保 证 mRNA 在 核 糖 体 上 定 位 ， 使 AUG 正 好 处 于 核 糖 体 复 合 物 的 P 位 ， 这 是 翻 译 启 动 的 前 提 条 件 。 外 源 基 因 密 码 子 在 大 肠 杆 菌 细 胞 中 获 得 最 佳 表 达 ： 5、 质 粒 拷 贝 数 ： 包 涵 体 （ Inclusion Bodies,IB） ： 某 些 生 长条 件 下 ， 大 肠 杆 菌 能 积 累 某 种 特 殊 的 生 物 大 分 子 ，它 们 致 密 地 集 聚 在 细 胞 内 ， 这 种 不 溶 性 的 结 构称 为 包 涵 体 。 包 涵 体 表 达 形 式 的 优 点 ： 简 化 外 源 基 因 表 达 产 物 的 分 离 操 作 ： 包 涵 体难 溶 于 水 ， 密 度 大 ， 易 于 分 离 。 在 一 定 程 度 上 保 持 表 达 产 物 的 结 构 稳 定 难 于 被蛋 白 酶 降 解 。 优 点 ： 目 的 蛋 白 稳 定 性 高 、 易 于 分 离 、 末 端 完 整不 含 Met。缺 点 ： 大 肠 杆 菌 分 泌 机 制 不 健 全 ， 难 于 进 行分 泌 型 表 达 ， 但 其 表 达 率 通 常 要 比 包 涵 体 方 式低 很 多 ， 表 达 量 少 。 融 合 形 式 表 达 目 的 蛋 白 优 缺 点 ：稳 定 性 高 ： 折 叠 成 正 确 构 象 ， 封 闭 蛋 白 酶 切 点 。易 于 分 离 ： 特 点 ： 每 种 蛋 白 酶 均 有 相 应 的 断 裂 位 点 。 在 残 基 处切 开 酰 胺 键 形 成 不 含 上 述 残 基 的 下 游 断 裂 肽 段外 源 蛋 白 分 子 内 部 不 能 含 有 精 氨 酸 、 谷 氨酸 或 赖 氨 酸 残 基 。 特 点 ：目 的 蛋 白 高 效 表 达 ： 不 提 高 质 粒 拷 贝 数 ， 增 加 目的 基 因 的 拷 贝 数 ， 可 以 改 善 表 达 量 。稳 定 表 达 小 分 子 短 肽 ： 串 联 短 肽 有 与 蛋 白 质 相 似的 长 度 及 空 间 结 构 。目 的 产 物 回 收 困 难 ： 寡 聚 短 肽 需 要 裂 解 和 分 离 。 基 本 战 略 染 色 体 DNA的 两 个 同 源 区 之 间 可 发 生 同 源 重 组 ，其 频 率 与 细 菌 种 类 、 同 源 程 度 、 两 个 同 源 区 之 间距 离 有 关 。 同 源 重 组 有 整 合 和 交 换 两 种 形 式 ， 前 者 只需 要 一 个 断 裂 位 点 ， 后 者 有 两 个 断 裂 位 点 。标 记 基 因 目 的 基 因 同 源 交 换 标 记 基 因目 的 基 因 1、 受 体 细 胞 中 限 制 修 饰 系 统 对 外 源 重 组 DNA分 子 降 解2、 外 源 基 因 的 高 效 表 达 严 重 干 扰 受 体 细 胞 正 常 的 生 长 代谢 能 量 、 物 质 的 匮 乏 和 外 源 基 因 表 达 产 物 的 毒 性 诱 导 受 体产 生 应 激 反 应 ： 关 闭 合 成 途 径 ， 启 动 降 解 程 序 。3、 重 组 质 粒 在 受 体 细 胞 分 裂 时 的 不 均 匀 分 配 ， 这 是 重 组质 粒 逃 逸 的 基 本 原 因4、 受 体 细 胞 内 源 性 的 转 座 元 件 促 进 重 组 分 子 的 缺 失 重 排