酶的生物合成与发酵生产-课件

第二章第二章 酶的生物合成与发酵生产酶的生物合成与发酵生产 提取分离法提取分离法 微生物细胞发酵产酶微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法酶的生产方法 生物合成法生物合成法 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶 化学合成法化学合成法 动物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶 1 第一节第一节 酶生物合成及调节酶生物合成及调节一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则转转录录传传递递给给RNA，再再由由RNA 蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA 2（一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-转录转录(transcription)(transcription)定义定义 以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNARNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA分子的过分子的过程。程。.3转录模板转录模板 启动子（启动子（promotor)终止子终止子(terminator)模板链（模板链（template strand）反意义链反意义链(antisense strand)编码链编码链(coding strand)有意义链有意义链(sense strand)DNADNA5533反意义链反意义链:指导转录作用的一条指导转录作用的一条DNADNA链链有意义链有意义链:无转录功能的一条无转录功能的一条DNADNA链链.4T C G A G T A CA G C T C A T GC G A G U A CG C A URNA聚合酶聚合酶有意义链有意义链反意义链反意义链RNAPPi555533GTPUTPCTPATPUTPRNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成3333555RNA的转录过程的转录过程(三步三步)1.1.起始起始2.2.延长延长3.3.终止终止 6 原核生物的原核生物的RNA聚合酶聚合酶(DDRP)E.coliE.coli的的RNARNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（2 2 ）起始因子7RNARNA合成过程合成过程起始起始双链双链DNA局部解开局部解开磷酸二酯磷酸二酯键形成键形成终止阶段终止阶段解链区到达解链区到达基因终点基因终点延长阶段延长阶段5 3 RNA 启动子启动子（promotor)终止子终止子(terminator)5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开8RNA链的延伸图解链的延伸图解35RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋聚合酶的移动方向聚合酶的移动方向新生新生RNA复链复链解链解链有义链有义链模板链（反义链）模板链（反义链）延长部位延长部位9 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种体上通过各种tRNAtRNA、酶和辅助因子的作用，合、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。成多肽链的过程。（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成-翻译翻译翻译翻译(translation)(translation)(translation)(translation)10酪酪555533AUGGUU UAC ACA酪氨酰酪氨酰-tRNA反密码反密码mRNA密码与反密码的碱基配对密码与反密码的碱基配对11AUG ACA55蛋蛋苏苏UGUGUU33受受 位位(A位位)给给 位位(P位位)大亚基大亚基小亚基小亚基12 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）（大肠杆菌）v 氨基酸的活化氨基酸的活化v 肽链合成的起始肽链合成的起始v 肽链的延伸肽链的延伸v 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放13氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运反应式：反应式：AA +tRNA +ATPAA +tRNA +ATP氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi+AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时的第一个而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。14在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段）1 1、起始阶段、起始阶段2 2、延伸阶段、延伸阶段3 3、终止阶段、终止阶段15肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段1.1.mRNAmRNA与小亚基结合：与小亚基结合：形成形成30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3复合物复合物2.2.AUGAUG与蛋氨酰与蛋氨酰-tRNAtRNA结合：结合：30S-mRNA-IF 30S-mRNA-IF3 3 fMet-tRNA-IFfMet-tRNA-IF2 2-GTP-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA的起始密码子上（的起始密码子上（AUGAUG）。）。3.3.大小亚基结合大小亚基结合IF130S30S起始复合物起始复合物16AUG ACA5533AUG ACA5533UACUACAUG ACA5533小亚基小亚基mRNA蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP大亚基大亚基GDP+Pi受位受位给位给位蛋蛋蛋蛋肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段17肽链合成的延伸阶段肽链合成的延伸阶段1.1.进位进位:氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA进入受位进入受位;2.2.转肽转肽:形成肽键形成肽键,在转肽酶作用下在转肽酶作用下,给位与给位与 受位结合受位结合;3.3.移位移位:核蛋白体向核蛋白体向33端移动一个密码子的端移动一个密码子的 位置位置,空出受位空出受位,不断地进位、转肽、不断地进位、转肽、移位移位,使肽链延长。使肽链延长。18AUG ACA5533UAC蛋蛋苏苏UGUAUG ACA55UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA55UAC蛋蛋苏苏UGUGUUAUG ACA55蛋蛋苏苏UGUGUU333333GTP GDP+PiGDP+PiGTP起始复合体起始复合体进位进位转肽转肽移位移位Mg+K+19肽链合成的终止阶段肽链合成的终止阶段1.1.出现终止密码并与终止因子结合出现终止密码并与终止因子结合;2.2.肽键水解肽键水解,多肽释放多肽释放;3.3.tRNA,mRNAtRNA,mRNA,大小亚基解离大小亚基解离.20AUG UAA55UACAUG UAA55UAC3333终终终终AUG UAA55UAC33终终5533UAC终终肽链肽链2122二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节定义：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。进行的。意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。23 操纵子基因表达的协同单位操纵子操纵子结构基因结构基因（编码蛋白质（编码蛋白质,structural gene,S）控制部位控制部位操纵基因（操纵基因（operator gene,O）启动子（启动子（promotor gene,P）（一）基因调控理论（一）基因调控理论 Jacob and Monod的的操纵子学说（operon theoryoperon theory）24基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-）RNA聚合酶聚合酶 （+）转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子25 调节基因调节基因(regulator gene)(regulator gene)：可产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory(regulatory protein)protein)（一种（一种变构蛋白变构蛋白），通过与效应物，通过与效应物(effector)(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。26 cAMP-CRP复合物的作用示意图 启动基因（启动基因（promotor genepromotor gene）（启动子）：）（启动子）：有两个位点：有两个位点：（1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白（：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又称环腺苷酸受体蛋白），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP(cAMP receptor proteinreceptor protein，CRPCRP）。）。只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。能开始。27操纵基因（操纵基因（Operater geneOperater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（结构基因（Structural geneStructural gene）:决定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自的模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。28(二二)酶合成调节的类型酶合成调节的类型 1.1.诱导诱导 (induction)(induction)组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。物而临时合成的一类酶。2.2.阻遏阻遏(repression)(repression)分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression)反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)(feedback repression)29（三）酶合成的调节机制 1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。30调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性）基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）诱诱导导31 2.2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象：实验：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成不需要就不合成。32 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基与操纵基因结合，结构基因不能表达因不能表达33酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物34调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比353.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。36分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象：实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二二次生长现象次生长现象”(diauxie”(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。这一现象又称葡萄糖效应，这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（受体蛋白（CRPCRP）,亦称亦称降解物降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPCAP）。）。37分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态38三、提高酶产量的策略三、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）（一）菌种选育（一劳永逸）1.1.诱变育种诱变育种 (1)使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 2.基因工程育种基因工程育种 39（二）条件控制（二）条件控制1.1.添加诱导物添加诱导物 酶的底物类似物最有效。酶的底物类似物最有效。2.2.降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度 除去终产物除去终产物产物阻遏产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富避免培养基过于丰富 添加一定量的添加一定量的cAMPcAMP403.3.添加表面活性剂添加表面活性剂 离子型离子型 对细胞有毒害作用对细胞有毒害作用表面活性剂表面活性剂 Tween Tween8080 非离子型非离子型 增加细胞通透性增加细胞通透性 TritonXTritonX1001004.4.添加产酶促进剂添加产酶促进剂41 第二节第二节 酶发酵动力学酶发酵动力学 一、细胞生长动力学一、细胞生长动力学 在分批培养在分批培养(batch culture)(batch culture)过程中，细胞生过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期止期和衰亡期5 5个阶段。个阶段。42 细胞生长曲线细胞生长曲线 O-A 延迟期延迟期 A-B指数生长期指数生长期 B-C减速期减速期 C-D 静止期静止期 D-E 衰亡期衰亡期 43 营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：之间的动力学关系：MonodMonod模型模型n:比生长速率（比生长速率（1/h）（specific growth rate）nmax：最大比生长速率（最大比生长速率（1/h）nS：营养物浓度（生长限制基质浓度）：营养物浓度（生长限制基质浓度）克克/LnKs：莫诺德常数或莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数饱和常数或营养物利用常数 克克/L，或，或 mol/L4445 二、产酶动力学二、产酶动力学 （一）（一）酶生物合成的模式酶生物合成的模式 根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为的生物合成分为3 3种模式，即：种模式，即：同步合成型同步合成型 生长偶联型生长偶联型 中期合成型中期合成型 部分生长偶联型部分生长偶联型延续合成型延续合成型 非生长偶联型非生长偶联型 滞后合成型滞后合成型461.1.生长偶联型（又称同步合成型）生长偶联型（又称同步合成型）酶的生物合成与细胞生长同步。酶的生物合成与细胞生长同步。特点：特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。反应产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表明这类酶所对应的即停止，表明这类酶所对应的mRNAmRNA很不稳定。很不稳定。47生长偶联型中的特殊形式生长偶联型中的特殊形式中期合成型中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所对应的所对应的mRNAmRNA是不稳定的。是不稳定的。枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线 482.2.部分生长偶联型（又称延续合成型）部分生长偶联型（又称延续合成型）酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所对应的所对应的mRNAmRNA相当稳定。相当稳定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线493.3.非生长偶联型（又称滞后合成型）非生长偶联型（又称滞后合成型）只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点特点：受分解代谢物的阻遏作用。：受分解代谢物的阻遏作用。所对应的所对应的mRNAmRNA稳定性高。稳定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线 50总结：影响酶生物合成模式的主要因素 高：可在细胞停止生长后继 1）mRNA的稳定性 续合成酶 差：随着细胞停止生长而终 止酶的合成 2）培养基中阻遏物的存在 不受阻遏：随着细胞的生长而开始酶的合成。受阻遏：细胞生长一段时间或平衡期后，酶才开始 合成。51 酶生产中最理想的合成模式：酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。对于：对于：同步合成型：同步合成型：提高对应的提高对应的mRNAmRNA的稳定性，如降低发酵的稳定性，如降低发酵 温度温度 。滞后合成型：滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。酶的合成提早开始。中期合成型：中期合成型：要在提高要在提高mRNAmRNA稳定性以及解除阻遏两方稳定性以及解除阻遏两方 面努力面努力。52(二二)产酶动力学产酶动力学一般产酶动力学方程可表达为：一般产酶动力学方程可表达为：式中式中 X X细胞浓度细胞浓度(g/L)(g/L)细胞比生长速率细胞比生长速率(h(h-1-1)生长偶联的比产酶系数生长偶联的比产酶系数(IU/g)(IU/g)非生长偶联的比产酶速率非生长偶联的比产酶速率(IU/(g(IU/(g h)h)E E酶浓度酶浓度(IU/L)(IU/L)t t时间时间(h)(h)53生长偶联型生长偶联型部分生长偶联型部分生长偶联型 非生长偶联型非生长偶联型 54 第三节第三节 微生物发酵产酶微生物发酵产酶 一、产酶微生物的分离和选育一、产酶微生物的分离和选育 1.1.优良产酶菌种应具备的条件优良产酶菌种应具备的条件 （1 1）酶产量高）酶产量高 （2 2）易培养（生长速率高、营养要求低）易培养（生长速率高、营养要求低）（3 3）遗传性能稳定，不易退化）遗传性能稳定，不易退化 （4 4）易分离提纯）易分离提纯 （5 5）安全可靠（不是致病菌）安全可靠（不是致病菌）552.2.常用的产酶微生物常用的产酶微生物Escherichia coli Pseudomonas Bacillus subtilis Micrococcus Streptococcus StreptomycesAspergillus nigerAspergillus oryzaeMonascusPenicilliumTrichoderma Rhizopus Mucor Absidia Saccharomyces cerevisiae Candida56 3.3.产酶微生物的分离和筛选产酶微生物的分离和筛选 1)1)样品的采集样品的采集:从富含该酶作用底物的场所采集样品从富含该酶作用底物的场所采集样品 2)2)富集培养富集培养:投其所好，取其所抗投其所好，取其所抗 3)3)分离获得微生物的纯培养（分离获得微生物的纯培养（pure culturepure culture）。）。4)4)初筛：选出产酶菌种，以多为主。初筛：选出产酶菌种，以多为主。5)5)复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。复筛：选出产酶水平相对较高的菌株，以质为主。57 -淀粉酶的筛选淀粉酶的筛选58蛋白酶产生菌的获得方法蛋白酶产生菌的获得方法应应用用含含酪酪蛋蛋白白的的培培养养基基594.4.产酶微生物优良菌种的选育产酶微生物优良菌种的选育 诱变育种诱变育种 原生质体融合育种原生质体融合育种 基因工程育种基因工程育种 60 二二.微生物发酵产酶方法微生物发酵产酶方法 1.1.固体培养固体培养:特别适合于霉菌培养特别适合于霉菌培养 2.2.液体培养液体培养:目前酶发酵生产的主要方式目前酶发酵生产的主要方式 3.3.固定化细胞固定化细胞:需要特殊的固定化细胞反应器需要特殊的固定化细胞反应器 61三三.微生物酶的类型微生物酶的类型 1.1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞大分子而释放到细胞外的，即使胞外浓度很高，胞内也能维持较低水平，受到的调节控制少。内也能维持较低水平，受到的调节控制少。2.2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。酶活性和浓度受到中间产物和终产物的调控。62酶发酵生产的一般工艺流程酶发酵生产的一般工艺流程 63第四节第四节 动、植物细胞培养产酶动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。需采用各自不同的培养工艺。64动物细胞模式图65植物细胞结构66 植物、动物、微生物细胞的特性比较植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色色素素、药药物物、香精、酶等香精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫疫苗苗、激激素素、单单克克隆隆抗抗体体、酶等酶等67三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。68一、植物细胞培养产酶一、植物细胞培养产酶 1.1.植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点 2.2.培养基特点培养基特点 应用最广的是应用最广的是MSMS培养基和培养基和LSLS培养基培养基 MS MS培养基是培养基是19621962年由年由MurashingeMurashinge和和SkoogSkoog为烟草细胞培养而设计的培养基。为烟草细胞培养而设计的培养基。LSLS培养基是培养基是在其基础上演变而来的。在其基础上演变而来的。693.3.培养方法：培养方法：悬浮细胞培养悬浮细胞培养细胞株的建立；外植体与愈伤组织细胞株的建立；外植体与愈伤组织扩大培养；扩大培养；大罐培养；大罐培养；70外植体：外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于将上述外植体植入诱导培养基中，于2525左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。小细胞团。71水稻的外植体（幼水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织胚）和愈伤组织外植体外植体愈伤组织愈伤组织724.4.培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制（1 1）温度）温度（2 2）pHpH（3 3）通气与搅拌）通气与搅拌（4 4）光照的控制）光照的控制（5 5）前体的添加（饲喂）前体的添加（饲喂）（6 6）诱导子（）诱导子（elicitorselicitors）的应用）的应用735.5.植物细胞培养产酶实例植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SODSOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用去除外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升升汞消毒汞消毒10min10min，然后无菌水漂洗，然后无菌水漂洗3 3次。次。在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小块，植入的小块，植入含有含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的半固体的半固体MSMS培养基中，在培养基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下光照条件下培养培养18d18d，诱导得到愈伤组织，每，诱导得到愈伤组织，每1818天继代一次。天继代一次。74(2)(2)大蒜悬浮细胞培养大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体将上述在半固体MSMS培养基上培养培养基上培养18d18d的愈的愈伤组织，在无菌条件下转入含有伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）（苄基腺嘌呤）的液体的液体MSMS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，培养基中，加入灭菌的玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d，使，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的液体的液体MSMS培养基中，培养基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d。75(3)(3)酶的分离纯化酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。76二、动物细胞培养产酶二、动物细胞培养产酶 1.1.动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点细胞生长速度慢。（细胞生长速度慢。（需添加抗生素需添加抗生素）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵。反应过程成本高，产品价格贵。细胞具有锚地依赖性。细胞具有锚地依赖性。原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代。代。77 2.2.培养基培养基 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 无血清培养基无血清培养基783.3.培养方法培养方法(1)(1)悬浮培养悬浮培养(suspension culture)(suspension culture)(2)(2)贴壁培养贴壁培养(anchorage-dependent culture)(anchorage-dependent culture)(3)(3)贴壁悬浮培养贴壁悬浮培养(pseudo-suspension(pseudo-suspension culture)culture)微载体培养微载体培养(microcarrier culture)(microcarrier culture)包埋包埋(entrapment)(entrapment)和微囊和微囊(microencapsulation)(microencapsulation)培养培养 结团培养结团培养(aggregate culture)(aggregate culture)79 4.4.培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制（1 1）温度：一般控制在）温度：一般控制在36.5.36.5.（2 2）pHpH值：一般控制在值：一般控制在7.0-7.67.0-7.6的微碱性范围内。的微碱性范围内。（3 3）渗透压）渗透压:应与细胞内渗透压相同。应与细胞内渗透压相同。（4 4）溶解氧：根据情况随时调节）溶解氧：根据情况随时调节。80思考题：81