酶组织化学应用1127课件

酶组织化学的应用酶组织化学的应用姜玉峰姜玉峰石河子大学医学院组胚教研室石河子大学医学院组胚教研室酶组织化学基本反应原理 酶作用底物酶作用底物 +相关化学试剂相关化学试剂 反应产物沉淀反应产物沉淀（有色有色）酶酶（孵（孵育液育液内）内）（组织细胞内）（组织细胞内）（镜（镜下下观察）观察）显示酶的组织化学方法显示酶的组织化学方法1.1.金属沉淀法：磷酸酶的显示金属沉淀法：磷酸酶的显示 甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+铅铅 磷酸铅磷酸铅 硫化铅硫化铅2.2.偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法偶氮偶联法：显示各种酶类最重要的方法 3.3.电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示电子传递法：氧化酶和脱氢酶的显示 酸性磷酸酶酸性磷酸酶底物底物 酶酶初级反应产物（初级反应产物（PRPPRP）重氮盐重氮盐 最终反应产物（最终反应产物（FRPFRP）（一）碱性磷酸酶（一）碱性磷酸酶（alkaline alkaline phosphatasephosphatase，AKPAKP）又称碱性磷酸单酯酶（又称碱性磷酸单酯酶（EC3.1.3.1EC3.1.3.1）在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解在碱性环境下催化多种醇和酚的磷酸酯水解 最适最适PH PH 9.2-9.49.2-9.4 激活剂激活剂:如如Mg+,Mg+,MnMn+,+,某些氨基酸等某些氨基酸等 抑制剂抑制剂:氰化物、砷酸盐等氰化物、砷酸盐等（一）碱性磷酸酶（一）碱性磷酸酶（alkaline alkaline phosphatasephosphatase，AKPAKP）分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运分布：广泛存在于机体组织，常见于具有活跃转运功功 能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的能的细胞膜内，如毛细血管及毛细血管动脉部分的内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘内皮细胞，肾近曲小管刷状缘和肠上皮纹状缘;应用：应用：1.1.肝脏病、白血病的研究诊断肝脏病、白血病的研究诊断;2.2.骨的发生和代谢疾病骨的发生和代谢疾病;显示碱性磷酸酶的常用方法显示碱性磷酸酶的常用方法:1.1.钙钴法钙钴法(GomoriGomori-Takamatsu-Takamatsu法法)【基本原理基本原理】甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+CaCa+磷酸钙磷酸钙 磷酸钴磷酸钴 硫化钴硫化钴【孵育液孵育液】孵育液的成分：孵育液的成分：3%-3%-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 10 ml10 ml2%2%巴比妥钠巴比妥钠 10 ml10 ml2%CaCl2%CaCl2 2 20 ml 20 ml5%MgSO5%MgSO4 4 1 ml 1 ml双蒸水双蒸水 5 ml5 mlAKP显示碱性磷酸酶的常用方法显示碱性磷酸酶的常用方法:1.1.钙钴法钙钴法(GomoriGomori-Takamatsu-Takamatsu法法)【操作步骤操作步骤】1.1.新鲜组织低温冰冻切片新鲜组织低温冰冻切片 2.2.不固定切片直接进作用液不固定切片直接进作用液,或用或用1%1%氯化钙固定氯化钙固定5 5 分钟分钟-2-2小时小时,4,4,蒸馏水洗蒸馏水洗 3.3.作用液作用液10-6010-60分钟分钟,37,37 4.4.蒸馏水洗蒸馏水洗 5.2%5.2%硝酸钴硝酸钴1 1分钟分钟 6.6.蒸馏水洗蒸馏水洗 显示碱性磷酸酶的常用方法显示碱性磷酸酶的常用方法:1.1.钙钴法钙钴法(GomoriGomori-Takamatsu-Takamatsu法法)【操作步骤操作步骤】7.12%7.12%硫化铵硫化铵1 1分钟分钟 8.8.蒸馏水洗蒸馏水洗 9.9.甘油明胶封片甘油明胶封片,或脱水或脱水,透明透明,中性树胶封片中性树胶封片【结果结果】碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀碱性磷酸酶活性处有黑色的硫化钴沉淀肾曲管碱性磷酸酶肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法钙钴法 X100X100肾曲管碱性磷酸酶肾曲管碱性磷酸酶-钙钴法钙钴法 X200X2002.2.偶氮偶联法偶氮偶联法 GomoriGomori萘酚磷酸酯法萘酚磷酸酯法 AKPAKP在碱性条件下将在碱性条件下将-萘基磷酸钠水解出萘基磷酸钠水解出-萘萘酚酚,随后随后-萘酚与固蓝萘酚与固蓝B B盐在酶活性部位偶联盐在酶活性部位偶联,形形成紫红至紫黑色的不溶性沉淀成紫红至紫黑色的不溶性沉淀【孵育液孵育液】-萘基磷酸钠萘基磷酸钠,蒸馏水蒸馏水,5%,5%四硼酸钠四硼酸钠,10%10%硫酸镁硫酸镁,固蓝固蓝B B盐盐 2.2.偶氮偶联法偶氮偶联法 六偶氮对品红与六偶氮对品红与-萘酚偶联萘酚偶联-以萘酚以萘酚AS-BIAS-BI磷磷酸酯或萘酚酸酯或萘酚AS-TRAS-TR磷酸酯与六偶氮对品红偶联磷酸酯与六偶氮对品红偶联【孵育液孵育液】萘酚萘酚AS-BIAS-BI磷酸钠磷酸钠,二甲基甲酰胺二甲基甲酰胺(DMF)DMF)或或二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO),DMSO),TrisTris-clcl或巴比妥醋酸缓冲液或巴比妥醋酸缓冲液,六偶氮对品红六偶氮对品红【操作步骤操作步骤】1.1.小块组织液氮骤冷小块组织液氮骤冷,低温冰箱切片低温冰箱切片 2.2.甲醛钙液甲醛钙液(FcaFca)固定固定5 5分钟分钟,4,4,然后蒸馏水然后蒸馏水洗洗,也可不固定也可不固定3.3.作用液作用液5-605-60分钟分钟,37,37或室温或室温4.4.蒸馏水洗蒸馏水洗5.4%5.4%甲醛固定甲醛固定1515分钟分钟-2-2小时小时,室温室温6.6.自来水洗自来水洗,蒸馏水洗蒸馏水洗7.1%7.1%甲基绿甲基绿5-105-10分钟分钟,蒸馏水洗蒸馏水洗8.8.甘油明胶封片甘油明胶封片,或丙酮或丙酮-丙酮甲苯丙酮甲苯-DPXDPX封固封固【结果结果】酶活性处出现红色无定形的沉淀酶活性处出现红色无定形的沉淀,核呈蓝绿色核呈蓝绿色 (二二)酸性磷酸酶酸性磷酸酶(acid acid phosphatasephosphatase,ACP),ACP)在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解在酸性条件下催化醇和酚类磷酸酯的水解 最适最适PHPH为为4.8-5.24.8-5.2 抑制剂因组织差异而不同抑制剂因组织差异而不同:酒石酸酒石酸,氟化物氟化物,0.5%,0.5%甲甲醛醛 分布分布:主要位于溶酶体内主要位于溶酶体内 应用应用:前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌前列腺癌和其他脏器的转移性前列腺癌(+)(+)HodginsHodgins淋巴淋巴,胃癌胃癌,肺癌肺癌,乳腺癌等乳腺癌等(+)(+)尤文氏瘤尤文氏瘤,成骨肉瘤等成骨肉瘤等(-)(-)显示酸性磷酸酶的常用方法显示酸性磷酸酶的常用方法1.酸性磷酸酶硝酸铅法酸性磷酸酶硝酸铅法【基本原理基本原理】与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似与碱性磷酸酶钙钴法的原理相似甘油磷酸钠甘油磷酸钠 磷酸酯磷酸酯+铅铅 磷酸铅磷酸铅 硫化铅（黑色）硫化铅（黑色）【孵育液孵育液】硝酸铅硝酸铅,巴比妥巴比妥-硝酸盐缓冲液，硝酸盐缓冲液，-甘油磷酸钠甘油磷酸钠【结果结果】酸性磷酸酶活性处呈棕黑色酸性磷酸酶活性处呈棕黑色ACP显示酸性磷酸酶的常用方法显示酸性磷酸酶的常用方法2.同时偶联法同时偶联法【基本原理基本原理】ACPACP在酸性条件下水解萘酚在酸性条件下水解萘酚AS-TRAS-TR磷酸酯为磷酸酯为萘酚萘酚AS-TRAS-TR和磷酸和磷酸,萘酚萘酚AS-TRAS-TR和六偶氮对和六偶氮对品红偶联品红偶联,在酶活性处形成红色的不溶性复合物在酶活性处形成红色的不溶性复合物【孵育液孵育液】萘酚萘酚AS-TRAS-TR磷酸酯磷酸酯,六偶氮对品红六偶氮对品红【操作步骤操作步骤】1.1.新鲜组织低温冰箱切片新鲜组织低温冰箱切片2.2.不固定或吹干后丙酮固定不固定或吹干后丙酮固定1515分钟分钟3.3.用孵育液置于用孵育液置于3737水浴箱水浴箱1212小时小时4.4.流水洗流水洗,晾干晾干(1-2(1-2分钟分钟)5.5.用用MayerMayer苏木精或苏木精或1%1%甲基绿复染甲基绿复染6.6.流水洗流水洗1010分钟分钟7.7.常规脱水透明常规脱水透明,中性树胶封片中性树胶封片【结果结果】酸性磷酸酶活性处呈桔红色酸性磷酸酶活性处呈桔红色,胞核兰色胞核兰色(苏木精复染苏木精复染)或绿色或绿色(甲基绿复染甲基绿复染)涂片涂片-腹腔巨噬细胞腹腔巨噬细胞酸性磷酸酶酸性磷酸酶 X400(三三)5)5核苷酸酶核苷酸酶(5(5nucleotidasenucleotidase)催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在催化核糖核苷和脱氧核糖核苷在C-5C-5位置水解磷酸位置水解磷酸酯的水解酶酯的水解酶 最适最适PHPH因组织而异因组织而异,小鼠肾为小鼠肾为7.5,7.5,睾丸、脑、肝分睾丸、脑、肝分别为别为8.58.5、7.5-8.57.5-8.5、8.08.0 激活剂：激活剂：Mg+Mg+，MnMn+抑制剂：氟化钠（抑制剂：氟化钠（0.10.1M M NaF NaF），），硼酸钠硼酸钠OHOHHOHOHHOHH碱碱基基(嘌呤、嘌呤、嘧啶）嘧啶）（H）+H2O Pi5NaseHO-CH2OHHOHHOH（H）H碱基碱基CH2OPHO55核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶核苷酸酶存在于胞膜，为胞膜的标志酶55核苷酸酶的显示核苷酸酶的显示-铅法铅法【基本原理基本原理】55NaseNase水解底物水解底物55单磷酸腺苷单磷酸腺苷AMP 磷酸磷酸+铅铅 磷酸铅磷酸铅 硫化铅（黑色）硫化铅（黑色）【注意注意】5核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似核苷酸酶在作用上和碱性磷酸酶相似 5Nase AKP1.肾组织中分布肾组织中分布 肾小管刷状缘肾小管刷状缘(+),所有所有 仅肾小管刷状缘仅肾小管刷状缘(+)基膜也基膜也(+)2.-甘油磷酸钠甘油磷酸钠 ()(+)5Nase作为底物作为底物(四四)葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸酶磷酸酶(glucose-6-(glucose-6-phosphatase,G-6-p-phosphatase,G-6-p-酶酶)肝细胞特有的功能性酶肝细胞特有的功能性酶,分解糖原分解糖原,维持血糖浓度维持血糖浓度,是糖代谢的关键酶是糖代谢的关键酶 PH6PH6时活性最强时活性最强,PH8,PH8时最稳定时最稳定,PH5,PH5时易变性时易变性 抑制剂抑制剂:氟化物氟化物,锌和氰离子锌和氰离子 酒精固定酒精固定,石蜡包埋后石蜡包埋后,G6p,G6p酶被完全抑制酶被完全抑制;经甲醛固经甲醛固定而失活定而失活 硝酸铅法显示硝酸铅法显示G6pG6p酶酶:葡萄糖葡萄糖-6-p 葡萄糖葡萄糖+磷酸磷酸 磷酸铅磷酸铅 硫化铅硫化铅G6p酶酶(五五)腺苷三磷酸酶腺苷三磷酸酶又称又称ATPATP酶酶 ATP ATP ADPADP+Pi+Pi+能量能量 根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可根据所用激活剂、抑制剂以及酶定位的不同，可分为三类分为三类ATPATP酶酶1.1.肌球蛋白腺苷三磷酸酶肌球蛋白腺苷三磷酸酶q定位于骨骼肌定位于骨骼肌q最适最适PHPH为为9.0-9.49.0-9.4q被被Ca+Ca+激活激活,而被而被Mg+Mg+抑制抑制q常用作区分二型肌纤维常用作区分二型肌纤维:型型(红肌红肌)-)-收缩慢收缩慢,活动持久活动持久,其酶活性高其酶活性高,染色深染色深 型型(白肌白肌)-)-收缩快收缩快,活动不持久活动不持久,其酶活性低其酶活性低,染色淡染色淡ATPase2.2.膜性腺苷三磷酸酶膜性腺苷三磷酸酶q 又称钠又称钠-钾离子激活腺苷三磷酸酶钾离子激活腺苷三磷酸酶q 最适最适PH7.2-7.5PH7.2-7.5q 激活剂激活剂:Mg+,Na+,K+:Mg+,Na+,K+抑制剂抑制剂:Ca+,:Ca+,苦毒毛旋苦毒毛旋花子甙花子甙q 常存在于细胞膜常存在于细胞膜,特别是分泌功能活跃的细胞膜。特别是分泌功能活跃的细胞膜。3.3.线粒线粒体腺苷三磷酸酶体腺苷三磷酸酶q 心肌最丰富心肌最丰富,肝脏次之肝脏次之q 心肌的线粒体心肌的线粒体ATPATP酶被酶被Mg+Mg+激活，而被激活，而被Ca+Ca+抑制抑制q 肝细胞线粒体肝细胞线粒体ATPATP酶可同时被酶可同时被Mg+Mg+、Ca+Ca+激活激活 心肌和肝的线粒体心肌和肝的线粒体ATPATP酶均可被对酶均可被对-氯汞苯甲酸氯汞苯甲酸 （PCMBPCMB）抑制）抑制 腺苷三磷酸酶的显示方法腺苷三磷酸酶的显示方法1.镁激活的镁激活的ATPATP酶法酶法(铅法铅法):):在在ATPATP酶活性处酶活性处,出现棕出现棕黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性黑色的硫化铅沉淀。主要用于显示膜性ATPaseATPase，也可示线粒体也可示线粒体ATPaseATPase2.钙激活的钙激活的ATPATP酶法酶法(钙钴法钙钴法):):在在ATPATP酶活性处酶活性处,出现出现黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白黑色硫化钴沉淀。主要用于显示肌球蛋白ATPaseATPase，区分红肌纤维和白肌纤维区分红肌纤维和白肌纤维（六）非特异性酯酶六）非特异性酯酶酯酶可分为三类酯酶可分为三类非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶非特异性酯酶、脂酶、胆碱酯酶非特异性酯酶非特异性酯酶-水解短链脂肪酸的酯水解短链脂肪酸的酯脂酶脂酶-水解长链脂肪酸的酯水解长链脂肪酸的酯胆碱酯酶胆碱酯酶-水解胆碱的酯酶水解胆碱的酯酶 非特异性酯酶非特异性酯酶u 最适最适PH 5.0 PH 5.0-8.0 8.0u 定位在溶酶体和内质网定位在溶酶体和内质网,在肝、肾、胰和小肠具有较在肝、肾、胰和小肠具有较高的酶活性高的酶活性 应用应用-单核巨噬细胞、单核巨噬细胞、T T淋巴、中性粒细胞都有淋巴、中性粒细胞都有非特异性酯酶反应非特异性酯酶反应 1.1.在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多在急性白血病分类诊断时，非特异性酯酶含量多少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值少、有无颗粒及颗粒大小，都有一定的诊断价值 2.2.可作为可作为T T、B B淋巴细胞的鉴别淋巴细胞的鉴别显示非特异性酯酶法显示非特异性酯酶法-同时偶联法同时偶联法 用乙酸用乙酸-萘酯或萘酚萘酯或萘酚ASAS衍生物为底物，在衍生物为底物，在酶作用下，释出酶作用下，释出-萘酚，与固蓝萘酚，与固蓝B B或六偶氮对品红或六偶氮对品红偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料偶联，生成紫黑色或红棕色不溶的偶氮染料（七）胆碱酯酶七）胆碱酯酶 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶-神经组织、肌肉、红细胞中神经组织、肌肉、红细胞中 胆碱酯酶胆碱酯酶-血浆中含量丰富血浆中含量丰富 显示乙酰胆碱酯酶的方法显示乙酰胆碱酯酶的方法Karnovsky-Rotts亚铁氰亚铁氰化铜法化铜法【基本原理基本原理】碘化乙酰硫化胆碱碘化乙酰硫化胆碱 硫代胆碱硫代胆碱+乙酸乙酸 铁氰化钾铁氰化钾 亚铁氰化钾亚铁氰化钾 亚铁氰化铜沉淀亚铁氰化铜沉淀 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶（-SH）Cu+v 氧化还原酶氧化还原酶 一类转移电子，催化作用物的氧化还原反应的酶一类转移电子，催化作用物的氧化还原反应的酶 脱氢酶脱氢酶 如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶如琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶 氧化酶氧化酶 如如DOPADOPA氧化酶、细胞色素氧化酶氧化酶、细胞色素氧化酶 （一）脱氢酶一）脱氢酶q 脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出脱氢酶的显示：底物为脱氢酶氧化，从底物释放出氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色氢，经氢传递系统，使受氢体还原而显色常以常以四唑盐四唑盐和和铁氰化钾铁氰化钾作为受氢体作为受氢体q 组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种组化示脱氢酶分为不需辅酶和必需辅酶二种1.瑚珀酸脱氢酶（瑚珀酸脱氢酶（SDH）u SDHSDH是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。是属于琥珀酸氧化酶系统的酶。u 不需辅酶的存在不需辅酶的存在u SDHSDH存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结合上皮细胞、肝细胞含量最丰富，和线粒体膜牢固结合u 最适最适PH PH 7 7【显示方法显示方法】Pearson Pearson 二甲亚砜法二甲亚砜法【基本原理基本原理】琥珀酸盐琥珀酸盐+受氢体（四唑盐）受氢体（四唑盐）富马酸富马酸+还原的受氢体还原的受氢体 （无色）（无色）（蓝色沉淀）（蓝色沉淀）【作用液作用液】0.1M 琥珀酸钠琥珀酸钠,0.1M 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 PH 7.6 NBT(硝基蓝四唑硝基蓝四唑),二甲亚砜二甲亚砜(DMSO)【步骤步骤】1.新鲜组织低温冰冻切片新鲜组织低温冰冻切片 2.作用液作用液1535 分钟分钟 3.生理盐水洗生理盐水洗 4.Fca(氯化钙氯化钙Formalin)固定固定10分钟分钟 5.入入80%乙醇乙醇5分钟分钟 6.甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片甘油明胶封固或脱水、透明、中性树胶封片【结果结果】酶活性处为蓝紫色沉淀酶活性处为蓝紫色沉淀小鼠心肌冰冻切片小鼠心肌冰冻切片-琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 X4002.乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDH）u 需辅酶的脱氢酶需辅酶的脱氢酶u 广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系广泛分布的可溶性酶，为糖原分解的酶系u 最适最适PH 7.4 u 肝、骨骼肌的酶活性高于心肌肝、骨骼肌的酶活性高于心肌【基本原理基本原理】催化乳酸和丙酮酸的互变反应催化乳酸和丙酮酸的互变反应 乳酸盐乳酸盐+NAD 丙酮酸盐丙酮酸盐+（NADH+H+）LDH（辅酶辅酶）（还原型辅酶（还原型辅酶）（二）过氧化物酶二）过氧化物酶o 催化各种物质被过氧化氢（催化各种物质被过氧化氢（H2O2）所氧化所氧化o 见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等o 髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体髓过氧化物酶见于中性和嗜酸性白细胞及其前体细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要细胞中，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要o 免疫组化中常用辣根过氧化物酶（免疫组化中常用辣根过氧化物酶（HRP）作为大作为大分子示踪剂分子示踪剂【显示方法显示方法】二氨基联苯胺法示过氧化物酶二氨基联苯胺法示过氧化物酶【基本原理基本原理】过氧化物酶作用于底物（过氧化物酶作用于底物（3，3-二氨基联苯胺，二氨基联苯胺，DAB），），催化底物被催化底物被H2O2氧化，生成棕色的沉淀氧化，生成棕色的沉淀【作用液作用液】DAB，Tris-cl缓冲液，缓冲液，H2O2【结果结果】酶活性处呈棕色酶活性处呈棕色小鼠腹腔巨噬细胞小鼠腹腔巨噬细胞-过氧化物酶过氧化物酶 *400白血病涂片白血病涂片-过氧化物酶过氧化物酶 X400