酶工程动植物细胞培养产酶培训课件

酶工程工程动植物植物细胞培胞培养养产酶动物细胞动物细胞n获得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术获得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等等n培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等植物细胞植物细胞n获得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织的方法获得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织的方法n培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等,在在次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。2酶工程动植物细胞培养产酶第一节第一节 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶n植物是各种色素、药物、香精和酶等天植物是各种色素、药物、香精和酶等天然产物的主要来源：然产物的主要来源：目前已知的天然化合物超过目前已知的天然化合物超过30 00030 000种种,其中其中80%80%以上来自于植物以上来自于植物;从植物中得到的最普遍又必不可缺从植物中得到的最普遍又必不可缺的药物有的药物有17 17 类类,我国普遍使用的中草药及其制剂我国普遍使用的中草药及其制剂80 80%以上来源于植物以上来源于植物,美国每年使用的植物来源的药物美国每年使用的植物来源的药物超过超过30 30 亿美元亿美元;全世界每年使用的植物来源的芳香全世界每年使用的植物来源的芳香化合物的价值超过化合物的价值超过15 15 亿美元。亿美元。3酶工程动植物细胞培养产酶研发历史u1902 1902 年年,哈勃兰德哈勃兰德(Haberlandt)(Haberlandt)首次提出分离植首次提出分离植物单细胞并将其培养成植株的设想物单细胞并将其培养成植株的设想,100,100 年来年来,随着随着培养基的研制和培养技术的发展培养基的研制和培养技术的发展,已经从已经从200 200 多种植多种植物中分离出细胞物中分离出细胞,不仅可以通过细胞的再分化生成完不仅可以通过细胞的再分化生成完整的植株整的植株,而且可以通过细胞培养而且可以通过细胞培养,获得获得400 400 多种人多种人们所需的各种物质。们所需的各种物质。4酶工程动植物细胞培养产酶u2020世纪世纪8080年代以后，植物细胞培养技术迅速发展年代以后，植物细胞培养技术迅速发展,已成为已成为生物工程研究开发的新热点。生物工程研究开发的新热点。5酶工程动植物细胞培养产酶主要内容主要内容n1.植物细胞的特点植物细胞的特点n2.植物细胞植物细胞培养培养的特点的特点n3.植物细胞培养的工艺条件及其控制植物细胞培养的工艺条件及其控制 植物细胞培养的工艺流程植物细胞培养的工艺流程 植物细胞培养的培养基植物细胞培养的培养基n4.植物细胞培养产酶的工艺过程植物细胞培养产酶的工艺过程6酶工程动植物细胞培养产酶一、植物细胞的特点一、植物细胞的特点7酶工程动植物细胞培养产酶植物细胞结构8酶工程动植物细胞培养产酶动物细胞模式图9酶工程动植物细胞培养产酶 植物、动物、微生物细胞的特性比较植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色色素素、药药物物、香精、酶等香精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫疫苗苗、激激素素、单单克克隆隆抗抗体体、多肽药、酶等多肽药、酶等10酶工程动植物细胞培养产酶三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。11酶工程动植物细胞培养产酶二、二、植物细胞植物细胞培养培养的特点的特点n植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体融合或D N A 重组等技术而获得优良的植物细胞。然后,在人工控制条件的植物细胞反应器中进行植物细胞培养,从而获得各种所需的产物。12酶工程动植物细胞培养产酶植物细胞培养生产各种天然产物植物细胞培养生产各种天然产物,与从植物中提与从植物中提取分离这些物质相比取分离这些物质相比,具有如下显著特点。具有如下显著特点。1.1.提高产率提高产率2.2.缩短周期缩短周期 植物细胞生长的倍增时间一般为植物细胞生长的倍增时间一般为121260h,60h,一般生产周期一般生产周期15153030天。天。3.3.易于管理易于管理,减轻劳动强度减轻劳动强度 不受地理环境和气候条件等的影响。不受地理环境和气候条件等的影响。4.4.提高产品质量提高产品质量 主要产物的产率较高主要产物的产率较高,杂质较少；杂质较少；减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀；减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀；产物易于分离纯化。产物易于分离纯化。5.5.其他其他 对剪切力敏感、生产周期长等缺点；对剪切力敏感、生产周期长等缺点；许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。13酶工程动植物细胞培养产酶三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制（一）（一）植物细胞培养的工艺流程植物细胞培养的工艺流程一般为：一般为：外植体外植体-细胞的获取细胞的获取-细胞培养细胞培养-分离纯化分离纯化-产物产物 14酶工程动植物细胞培养产酶1.外植体的选择与处理外植体外植体：指从植株取出：指从植株取出,经过预处理后经过预处理后,用于植物组织和细用于植物组织和细胞培养的植物组织胞培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等子等)片段或小块。片段或小块。选择选择：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植株株,如果植物细胞是用于生产次级代谢物如果植物细胞是用于生产次级代谢物,则需从产生该则需从产生该次级代谢物的组织部位中切取一部分组织次级代谢物的组织部位中切取一部分组织,经过清洗经过清洗,除除去表面的灰尘污物。去表面的灰尘污物。操作操作：将上述外植体切成：将上述外植体切成0.50.51c m 1c m 左右的片段或小块左右的片段或小块,用用70%70%75%75%乙醇溶液或者乙醇溶液或者5%5%次氯酸钠、次氯酸钠、10%10%漂白粉、漂白粉、0.1%0.1%升汞溶液等进行消毒处理升汞溶液等进行消毒处理,再用无菌水充分漂洗再用无菌水充分漂洗,以除去残留的消毒剂。以除去残留的消毒剂。15酶工程动植物细胞培养产酶2.植物细胞的获取n直接分离法,n愈伤组织诱导法n原生质体再生法16酶工程动植物细胞培养产酶直接分离法直接分离法:植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为机械法机械法和和酶解酶解法法两种两种。1）机械捣碎法分离植物细胞机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎是先将叶片等外植体轻轻捣碎,然然后通过过滤和离心分离细胞。后通过过滤和离心分离细胞。优点优点:获得的植物细胞没有经过酶的作用获得的植物细胞没有经过酶的作用,不会受到伤害不会受到伤害;不需要经过质壁分离不需要经过质壁分离,有利于进行生理和生化研究。有利于进行生理和生化研究。缺陷：缺陷：由于受到机械的作用由于受到机械的作用,细胞结构会受到一定的伤害细胞结构会受到一定的伤害,获得完整的细胞团或细胞数量少获得完整的细胞团或细胞数量少,其使用不普遍。其使用不普遍。2）酶解法分离细胞酶解法分离细胞是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体,分分离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层,而且还而且还能软化细胞壁。能软化细胞壁。所以所以用酶解法分离细胞的时候用酶解法分离细胞的时候,必须对细胞必须对细胞给予渗透压保护给予渗透压保护,如甘露醇等如甘露醇等。17酶工程动植物细胞培养产酶愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法n愈伤组织愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。胞团。n通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程基本过程:将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入0.7%0.7%0.8%0.8%的琼脂的琼脂,制成半固体的愈伤组织诱导培养制成半固体的愈伤组织诱导培养基。灭菌、冷却后基。灭菌、冷却后,将上述外植体植入诱导培养基中将上述外植体植入诱导培养基中,于于2525左右培养一段时间左右培养一段时间,即从外植体的切口部位长出小细即从外植体的切口部位长出小细胞团胞团,此细胞团称之为愈伤组织。一般培养此细胞团称之为愈伤组织。一般培养1 13 3 周后周后,将将愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养,以获得更多的愈伤组织。以获得更多的愈伤组织。18酶工程动植物细胞培养产酶原生质体再生法原生质体再生法原生质体再生法原生质体再生法:原生质体原生质体(protoplast)是除去细胞壁后得到的微球体。是除去细胞壁后得到的微球体。植物原生质体的植物原生质体的获得：获得：可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得。器官中获得。分离方法：分离方法：机械分离法和酶解法两种机械分离法和酶解法两种,一般都采用一般都采用酶解法酶解法。酶解法：酶解法：植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。为使细胞壁降解释放原生质体为使细胞壁降解释放原生质体,必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解的酶制剂质水解的酶制剂,最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。u在原生质体制备过程中在原生质体制备过程中,为了防止原生质体被破坏为了防止原生质体被破坏,一般要采用用高渗一般要采用用高渗溶液溶液,以利于完整原生质体的释放。配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定以利于完整原生质体的释放。配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。剂。常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。u原生质体分离后原生质体分离后,经过计数和适当稀释经过计数和适当稀释,在一定条件下进行原生质体培在一定条件下进行原生质体培养养,使细胞壁再生使细胞壁再生,而形成单细胞悬浮液。而形成单细胞悬浮液。u细胞壁再生后得到的植物单细胞细胞壁再生后得到的植物单细胞,经过单细胞培养经过单细胞培养,长成细胞团长成细胞团,再经再经过继代培养过继代培养,形成由原生质体形成的细胞系。形成由原生质体形成的细胞系。19酶工程动植物细胞培养产酶3.细胞悬浮培养细胞悬浮培养 将上述获得的植物细胞在无菌条件下将上述获得的植物细胞在无菌条件下,转入新的液体培养转入新的液体培养基基,在人工控制条件的生物反应器中在人工控制条件的生物反应器中,进行细胞悬浮培养进行细胞悬浮培养,获得所需的产物。获得所需的产物。4.分离纯化分离纯化 细胞培养完成后细胞培养完成后,分离收集细胞或者培养液分离收集细胞或者培养液,再采用各种再采用各种生化技术生化技术,从细胞或者培养液中将各种物质分离从细胞或者培养液中将各种物质分离,得到所得到所需的产物。需的产物。20酶工程动植物细胞培养产酶水稻的外植体（幼水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织胚）和愈伤组织外植体外植体愈伤组织愈伤组织21酶工程动植物细胞培养产酶（二）植物细胞培养的培养基（二）植物细胞培养的培养基1.培养基特点培养基特点n(1)植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐:P、S、N、K、N a、Ca、M g 等大量元素（等大量元素（102 3103 m g/L）；）；M n、Zn、Co、M o、C u、B、I 等微量元素（等微量元素（10-2 30 m g/L）。）。n(2)植物细胞需要多种维生素和植物生长激素植物细胞需要多种维生素和植物生长激素:如硫胺素、吡哆素、烟如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。酸、肌醇、生长素、分裂素等。培养液中维生素的浓度一般为培养液中维生素的浓度一般为0.1100 m g/L(表表2-9);而植物生长激而植物生长激素的浓度一般为素的浓度一般为0.1 10 m g/L,(3)植物细胞要求的氮源一般为无机植物细胞要求的氮源一般为无机氮源氮源:即可以同化硝酸盐和铵盐。即可以同化硝酸盐和铵盐。n(4)植物细胞一般植物细胞一般以蔗糖为碳源以蔗糖为碳源:蔗糖的浓度一般为蔗糖的浓度一般为2%5%。22酶工程动植物细胞培养产酶2.几种常用的植物细胞培养基几种常用的植物细胞培养基 MS MS 培养基（培养基（LS和和RM培养基培养基）B5 B5 培养基培养基 White White 培养基培养基 KM-8 P KM-8 P 培养基培养基n应用最广的是应用最广的是MS培养基和培养基和LS培养基培养基 MS培养基是培养基是1962年由年由Murashinge和和Skoog为烟草细胞为烟草细胞培养而设计的培养基。培养而设计的培养基。LS、RM培养基是在其基础上培养基是在其基础上演变而来的。演变而来的。23酶工程动植物细胞培养产酶3.植物细胞培养基的配制植物细胞培养基的配制n将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生素溶将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生素溶液和植物激素溶液等几个大类液和植物激素溶液等几个大类,先配制成先配制成10 10 倍或者倍或者100 100 倍浓度的母液倍浓度的母液,放在冰箱保存备用。在使用时放在冰箱保存备用。在使用时,吸取一定体积的各类母液吸取一定体积的各类母液,按照比例混合、稀释按照比例混合、稀释,制制备所需的培养基。备所需的培养基。24酶工程动植物细胞培养产酶(三三)温度的控制温度的控制n植物细胞培养的温度一般控制在室温范围植物细胞培养的温度一般控制在室温范围(25左右左右)。温度高些温度高些,对植物细胞的生长有利对植物细胞的生长有利,温度低些温度低些,则对次级则对次级代谢物的积累有利。但是通常不能低于代谢物的积累有利。但是通常不能低于20,也不要高也不要高于于35。n有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同,要在不同的阶段控制不同的温度。要在不同的阶段控制不同的温度。25酶工程动植物细胞培养产酶(四四)pH 值的控制值的控制 植物细胞的植物细胞的p H p H 值一般控制在微酸性范围值一般控制在微酸性范围,即即pH 5.0pH 5.06.06.0。培养基配制时。培养基配制时,pH,pH 值一般控制值一般控制在在5.5 5.5 5.8 5.8 范围范围,在植物细胞培养过程中在植物细胞培养过程中,一般一般p H p H 值变化不大。值变化不大。26酶工程动植物细胞培养产酶(六)光照的控制n大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定波长的光的照射要求一定波长的光的照射,并对光照强度和光并对光照强度和光照时间有一定的要求照时间有一定的要求,而有些植物次级代谢物而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。的生物合成却受到光的抑制。n在植物细胞培养过程中在植物细胞培养过程中,应当根据植物细胞的应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同特性以及目标次级代谢物的种类不同,进行光进行光照的调节控制照的调节控制28酶工程动植物细胞培养产酶(七七)前体的添加前体的添加n前体前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量量,在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。有效的措施。29酶工程动植物细胞培养产酶(八八)刺激剂的应用刺激剂的应用n刺激剂刺激剂(elecitor)(elecitor)可以促使植物细胞中的物质代可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行,从而强从而强化次级代谢物的生物合成化次级代谢物的生物合成,提高某些次级代谢物提高某些次级代谢物的产率。所以在植物细胞培养过程中添加适当的的产率。所以在植物细胞培养过程中添加适当的刺激剂可以显著提高某些次级代谢物的产量。刺激剂可以显著提高某些次级代谢物的产量。n常用的刺激剂：常用的刺激剂：微生物细胞壁碎片微生物细胞壁碎片和和果胶酶果胶酶、纤维素酶纤维素酶等微生物等微生物胞外酶。胞外酶。30酶工程动植物细胞培养产酶四、植物细胞培养产酶的工艺过程四、植物细胞培养产酶的工艺过程 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SODSOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用去除外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升升汞消毒汞消毒10min10min，然后无菌水漂洗，然后无菌水漂洗3 3次。次。在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小块，植入的小块，植入含有含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的半固体的半固体MSMS培养基中，在培养基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下光照条件下培养培养18d18d，诱导得到愈伤组织，每，诱导得到愈伤组织，每1818天继代一次。天继代一次。31酶工程动植物细胞培养产酶(2)(2)大蒜悬浮细胞培养大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体将上述在半固体MSMS培养基上培养培养基上培养18d18d的愈的愈伤组织，在无菌条件下转入含有伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）（苄基腺嘌呤）的液体的液体MSMS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，培养基中，加入灭菌的玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d，使，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的液体的液体MSMS培养基中，培养基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d。32酶工程动植物细胞培养产酶(3)(3)酶的分离纯化酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(S O D)：是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶,具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。S O D 可以从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。33酶工程动植物细胞培养产酶第二节第二节 动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶n动物细胞培养是在动物细胞培养是在 2020世纪世纪5050年代年代,伊尔勒伊尔勒(Earle)(Earle)等人等人开始进行病毒疫苗细胞培养的基础上开始进行病毒疫苗细胞培养的基础上,于于 2020世纪世纪6060年代迅年代迅速发展起来的技术。速发展起来的技术。n19671967年年 开发的适合动物细胞贴壁培养的微载体技术开发的适合动物细胞贴壁培养的微载体技术,19751975年年 发明的杂交瘤技术发明的杂交瘤技术,有力地推动了动物细胞培养有力地推动了动物细胞培养技术的发展。技术的发展。n已经在疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等已经在疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质的生产中广泛应用人体组织、器官等功能性蛋白质的生产中广泛应用,工业工业化生产达到化生产达到20 000 L20 000 L甚至更大的规模甚至更大的规模,已经成为生物工程已经成为生物工程研究开发的重要领域。研究开发的重要领域。34酶工程动植物细胞培养产酶1.1.动物细胞的特性动物细胞的特性n(1)(1)在于没有细胞壁在于没有细胞壁n(2)(2)动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍,稍小稍小于植物细胞的体积。于植物细胞的体积。n(3)(3)大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在存在,在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。n(4)(4)动物细胞的营养要求较复杂动物细胞的营养要求较复杂,必须供给各种氨必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进基中一般需要加进5%5%10%10%的血清。的血清。35酶工程动植物细胞培养产酶 2.2.动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点主要用于各种功能蛋白质的生产。主要用于各种功能蛋白质的生产。细胞生长速度慢。（需添加抗生素）细胞生长速度慢。（需添加抗生素）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵。反应过程成本高，产品价格贵。大多数细胞具有锚地依赖性，宜贴壁培养；部分细大多数细胞具有锚地依赖性，宜贴壁培养；部分细胞可采用悬浮培养。胞可采用悬浮培养。动物细胞培养基成分较复杂动物细胞培养基成分较复杂,一般要添加血清或其一般要添加血清或其代用品代用品,产物的分离纯化过程较繁杂产物的分离纯化过程较繁杂,成本较高。成本较高。原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代。代。36酶工程动植物细胞培养产酶3.3.培养方法培养方法(1)(1)悬浮培养悬浮培养来自血液、淋巴组织的细胞,肿瘤细胞和杂交瘤细胞(2)(2)贴壁培养贴壁培养存在于淋巴组织以外的组织、器官中的细胞（成纤维细胞、上皮细胞等）；采用滚瓶培养系统滚瓶培养系统、微载体系统微载体系统。(3)(3)固定化细胞培养固定化细胞培养（锚地依赖性和非锚地依赖性细胞；吸附法和包埋法）37酶工程动植物细胞培养产酶4.4.培养基的组成与配置培养基的组成与配置 动物细胞培养基的组分较为复杂动物细胞培养基的组分较为复杂,包括包括氨基酸氨基酸、维生素维生素、无机盐无机盐、葡萄糖葡萄糖、激素激素、生长因子生长因子等。等。首先配制各类母液首先配制各类母液,如如100100倍浓度氨基酸倍浓度氨基酸母液、母液、10001000倍浓度维生素母液、倍浓度维生素母液、100100倍浓度倍浓度葡萄糖母液葡萄糖母液(溶解于平衡盐溶液溶解于平衡盐溶液)等等;在使用在使用前前,分别吸取一定体积的母液分别吸取一定体积的母液,混匀得到混混匀得到混合母液合母液,膜过滤除菌后膜过滤除菌后,冷冻备用冷冻备用;使用时使用时,取取一定体积的混合母液一定体积的混合母液,用无菌的平衡盐溶液用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。稀释至所需浓度。38酶工程动植物细胞培养产酶 5.5.培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制（1 1）温度：一般控制在）温度：一般控制在36.536.5，波动范围，波动范围0.250.25.（2 2）pHpH值：一般控制在值：一般控制在pH7.0-7.6pH7.0-7.6的微碱性范围内的微碱性范围内（最优（最优pH7.4pH7.4）。）。调节调节pH pH 值值,通常采用通常采用COCO2 2 和和NaHCONaHCO3 3 溶液；维持溶液；维持pH pH 值的稳定值的稳定,通常在培养液中加入缓冲系统；常用酚红监控通常在培养液中加入缓冲系统；常用酚红监控p H p H 值值（蓝红色为蓝红色为pH7.6,pH7.6,红色为红色为pH7.4,pH7.4,橙色为橙色为pH7.0,pH7.0,黄色为黄色为pH6.5pH6.5）。）。（3 3）渗透压）渗透压:应与细胞内渗透压相同。应与细胞内渗透压相同。（4 4）溶解氧：根据情况随时调节）溶解氧：根据情况随时调节。39酶工程动植物细胞培养产酶6.6.动物细胞培养产酶的工艺过程动物细胞培养产酶的工艺过程 通过动物细胞培养获得的酶主要有胶原通过动物细胞培养获得的酶主要有胶原酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶等。现以人黑酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶等。现以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例例,说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制。控制。40酶工程动植物细胞培养产酶工艺过程：工艺过程：1.1.人黑色素瘤细胞培养基（人黑色素瘤细胞培养基（Eagle Eagle 培养基）培养基）2.2.人黑色素瘤细胞培养人黑色素瘤细胞培养u(1)(1)将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理,分散分散,用用p H 7.p H 7.4 4 的磷酸缓冲液洗涤的磷酸缓冲液洗涤,计数计数,稀释成细胞悬浮液。稀释成细胞悬浮液。u(2)(2)在消毒好的反应器中装进一定量的培养液在消毒好的反应器中装进一定量的培养液,将上述细胞悬浮液接将上述细胞悬浮液接种至反应器中种至反应器中,接种浓度为接种浓度为(1(13)103 3)103 个细胞个细胞/ml,/ml,于于37 37 的的CO2 CO2 培养箱中培养箱中,通入含通入含5%CO5%CO2 2 的无菌空气的无菌空气,培养至长成单层致密细胞。培养至长成单层致密细胞。(3)(3)倾去培养液倾去培养液,用用pH7.4 pH7.4 的磷酸缓冲液洗涤细胞的磷酸缓冲液洗涤细胞2 23 3 次。次。u(4)(4)换入一定量的无血清换入一定量的无血清Eagle Eagle 培养液培养液,继续培养。继续培养。u(5)(5)每隔每隔3 34 4 天天,取出培养液进行取出培养液进行tPA tPA 的分离纯化。的分离纯化。u(6)(6)然后再向反应器中加入新鲜的无血清然后再向反应器中加入新鲜的无血清Eagle Eagle 培养液培养液,继续培养继续培养,以获得大量以获得大量tPAtPA。3.3.组织纤溶酶原活化剂的分离纯化组织纤溶酶原活化剂的分离纯化41酶工程动植物细胞培养产酶组织纤溶酶原活化剂组织纤溶酶原活化剂(tissue plas minogen(tissue plas minogen activator,tPA)activator,tPA)n是一种是一种丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶,它可以催化纤溶酶原水解它可以催化纤溶酶原水解,生成纤溶生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解,对血栓性疾病有对血栓性疾病有显著疗效。显著疗效。n纤溶酶原激活剂根据其结构和特性的不同纤溶酶原激活剂根据其结构和特性的不同,可以分为可以分为组织纤组织纤溶酶原激活剂溶酶原激活剂(tissue plas minogen activator,tP A)和和尿激尿激酶纤溶酶原激活剂酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogenactivator,uP A)两种。现在国内外应用的都是组织纤溶酶原激活剂。两种。现在国内外应用的都是组织纤溶酶原激活剂。n1983 年年,彭尼卡彭尼卡(Pennica)采用采用克隆技术克隆技术将人的将人的tPA 基因转基因转入大肠杆菌细胞并得到表达。随后在多种微生物和动物细入大肠杆菌细胞并得到表达。随后在多种微生物和动物细胞中表达成功胞中表达成功,现已成为销售量最大的基因工程药物之一。现已成为销售量最大的基因工程药物之一。42酶工程动植物细胞培养产酶