酶工程9核酶课件

第九章第九章 核核 酶酶1 从人类认识到酶的存在开始到从人类认识到酶的存在开始到20世纪世纪80年年代初，人们一直认为酶的化学本质是蛋白质，代初，人们一直认为酶的化学本质是蛋白质，这一概念根深蒂固，近似乎成为定论。这一概念根深蒂固，近似乎成为定论。然而美国科罗拉多大学博尔分校的然而美国科罗拉多大学博尔分校的Thomas Cech和耶鲁大学的和耶鲁大学的Sidney Altman各自独立发现各自独立发现具有生物催化功能的具有生物催化功能的RNA却从根本上改变了人却从根本上改变了人们的这一认识观念。们的这一认识观念。21981年年Cech等发现四膜虫的核等发现四膜虫的核糖体前体糖体前体RNA可以在没有蛋白可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。内含子，完成加工过程。3具体事件具体事件:1981年年Thomas Cech等在研究等在研究rRNA前体加工成熟时就发现四膜虫的前体加工成熟时就发现四膜虫的26rRNA前体中含有插入序列（前体中含有插入序列（IVS），在），在rRNA前前体成熟过程中，体成熟过程中，IVS通过剪接反应被除去，通过剪接反应被除去，并证实这一剪接反应不需要任何蛋白质的并证实这一剪接反应不需要任何蛋白质的参与，是四膜虫的基因内区自行拼接的。参与，是四膜虫的基因内区自行拼接的。4 1981年年,耶鲁大学的耶鲁大学的Sidney Altman等等在从事在从事RNaseP的研究中也发现了这一现的研究中也发现了这一现象，象，RNaseP是细菌和高等生物细胞里都是细菌和高等生物细胞里都有的一种有的一种tRNA加工酶，它能在特定的位加工酶，它能在特定的位点上切开点上切开tRNA前体。前体。5 1983年，就在年，就在Thomas Cech等发现等发现RNA能自行拼接后的两年后，能自行拼接后的两年后，Sidney Altman等就证明：在较高的等就证明：在较高的Mg2+浓度下，浓度下，RNaseP中的中的RNA（M1RNA）就单独具有）就单独具有催化催化tRNA前体成熟的功能，而其蛋白质前体成熟的功能，而其蛋白质组分却不具备此种催化功能。组分却不具备此种催化功能。6根据当时催化剂不仅能加快反应根据当时催化剂不仅能加快反应速率，而且在反应前后催化剂本身不速率，而且在反应前后催化剂本身不发生改变的准确定义，在发生改变的准确定义，在Thomas Cech等发现四膜虫等发现四膜虫26SrRNA前体前体IVS的自身拼接后，的自身拼接后，科学家们还排斥它作科学家们还排斥它作为生物催化剂的资格，认为那是一种为生物催化剂的资格，认为那是一种自体催化反应，拼接后的成熟自体催化反应，拼接后的成熟rRNA与前体不同，尚不能被看成是严格意与前体不同，尚不能被看成是严格意义上的催化剂。义上的催化剂。7 Sidney Altman等的发现就从实验等的发现就从实验上消除了这一异议，上消除了这一异议，原因是原因是RNaseP所所催化的反应是一种异体分子间的反应，催化的反应是一种异体分子间的反应，而该反应正是在而该反应正是在RNA的催化下完成的。的催化下完成的。8 此后，此后，1984年年R.Lewin在在Science发发表的题为表的题为“First True RNA Catalyst Found”的报道标志着的报道标志着RNA催化剂的正式催化剂的正式诞生。诞生。R.Lewin,First True RNA Catalyst Found,Science,1984,20:266-2679 Thomas Cech等把这类具有催化裂解活性的RNA分子取名为Ribozyme，在我国1994年科学出版社出版的英汉分子生物学与生物工程词汇将Ribozyme译为核酶核酶，这是最普遍的译法，也可被叫做核糖拟酶。10结果结果:这些具有催化活性的这些具有催化活性的RNA的发现的发现改变了传统上改变了传统上“酶是蛋白质酶是蛋白质”的观念，的观念，从此对具有催化活性的从此对具有催化活性的RNA，即核酶，即核酶(ribozyme)的结构、催化机制以及应的结构、催化机制以及应用的研究日益深入。用的研究日益深入。11 核酸分子在总体的催化潜核酸分子在总体的催化潜力上和蛋白质相差甚远，但由力上和蛋白质相差甚远，但由于可以遗传和变异而被自然界于可以遗传和变异而被自然界保留下来催化一些特殊的反应。保留下来催化一些特殊的反应。12 核酶由于具有许多优点而受核酶由于具有许多优点而受到重视，例如用于治疗的核酶注到重视，例如用于治疗的核酶注射入体内不会产生免疫原性，对射入体内不会产生免疫原性，对具有切割活力的核酶可以更加自具有切割活力的核酶可以更加自由的设计其切割由的设计其切割RNARNA的位点。的位点。13 分子进化工程的诞生，使核分子进化工程的诞生，使核酶的研究迅速发展，人工进化出酶的研究迅速发展，人工进化出自然界中不存在的多种功能的核自然界中不存在的多种功能的核酶（包括单链酶（包括单链DNA酶），这些研酶），这些研究成果在理论和实际应用中都有究成果在理论和实际应用中都有着巨大的意义。着巨大的意义。14传统观念酶的化学本质是蛋白质只有蛋白质才能有催化功能核酶15RNARNA只有蛋白质才能只有蛋白质才能有催化功能有催化功能 酶蛋白质酶蛋白质？生物催化功能生物催化功能上世纪上世纪上世纪上世纪80808080年代初年代初年代初年代初CechCechCechCech和和和和AltmanAltmanAltmanAltman各自各自各自各自独立地发现独立地发现独立地发现独立地发现核酶核酶16核酶RNADNA多糖氨基酸酯进一步的研究发现，这是一种多功能的生物催化剂可以作用于核酶的作用底物17核酶按其大小不同，大致可以分为两类，核酶按其大小不同，大致可以分为两类，大分子核酶，如大分子核酶，如RNaseP、I组内含子和组内含子和II组组 内含子；其分子大小为几百到几千个核苷内含子；其分子大小为几百到几千个核苷 酸；酸；小分子核酶，如锤头型核酶、发卡型核酶、小分子核酶，如锤头型核酶、发卡型核酶、丁型肝炎病毒核酶等，其大小一般为丁型肝炎病毒核酶等，其大小一般为35155 个核苷酸。个核苷酸。18根据核酶的催化反应不同，可以将核酶分成两根据核酶的催化反应不同，可以将核酶分成两大类大类:剪切型核酶，这类核酶催化的是自身或者异剪切型核酶，这类核酶催化的是自身或者异 体体RNA的切割，相当于核酸内切酶，主要包的切割，相当于核酸内切酶，主要包 括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒括锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒 (HDV)核酶以及有蛋白质参与协助完成催化核酶以及有蛋白质参与协助完成催化 的的RNaseP；剪接型核酶，这类核酶主要包括剪接型核酶，这类核酶主要包括I组内含子和组内含子和 II组内含子，实现组内含子，实现mRNA前体自我拼接，具前体自我拼接，具 有核酸内切酶和连接酶两种活性。有核酸内切酶和连接酶两种活性。191.核酶的催化类型核酶的催化类型 已经发现了几十种核酶，按反应类别已经发现了几十种核酶，按反应类别可分为可分为催化分子内反应催化分子内反应和和催化分子间反应催化分子间反应等两大类，而催化分子内反应的核酶又可等两大类，而催化分子内反应的核酶又可分为分为自我剪接型核酶自我剪接型核酶和和自我剪切型核酶自我剪切型核酶。201.1 I型内含子的自我剪接型内含子的自我剪接 Cech等在研究工作中发现，转录产物等在研究工作中发现，转录产物(RNA前体前体)很不稳定，在没有任何蛋白质很不稳定，在没有任何蛋白质或酶存在的情况下，可自动切除或酶存在的情况下，可自动切除413nt的的内含子片段内含子片段(IVS)，并产生成熟的，并产生成熟的rRNA分分子。子。nt:nucleotide21 例如，例如，L-19 IVS 就具有多种蛋白酶的就具有多种蛋白酶的催化功能，催化功能，rRNA前体的自我剪接机制中前体的自我剪接机制中的一系列反应都是由的一系列反应都是由IVS的特殊结构引起的特殊结构引起的。的。22L-19 IVS(395nt)和和394nt RNA的形成的形成23四膜虫四膜虫r-RNA前体自我剪接反应前体自我剪接反应24特点产生特殊的二级和三级结构需要鸟苷251.2 异体催化剪切型异体催化剪切型 RNase P是一个常见的酶，是一个常见的酶，1978年年Altman等证明了该酶是由等证明了该酶是由RNA和蛋白质和蛋白质两部分组成，具有来自前两部分组成，具有来自前tRNA的的5端引端引导序列，能有效地切割小导序列，能有效地切割小RNA底物。底物。26RNase P的组成的组成27 原则上，只要具有原则上，只要具有CCA的反义的反义RNA并能结并能结合到靶合到靶RNA，任何，任何RNA都可以作为都可以作为RNase P的的底物。底物。RNase P是一种是一种5端内切酶，负责端内切酶，负责tRNA前体前体5端的成熟，对切点左侧寡聚核苷酸顺序端的成熟，对切点左侧寡聚核苷酸顺序和长度无严格要求，产物带和长度无严格要求，产物带3-OH及及5-磷酸末磷酸末端。端。28RNase P对对tRNA前体的剪切前体的剪切291.3 自体催化剪切型自体催化剪切型 自我剪切与自我剪接不同，自我剪接自我剪切与自我剪接不同，自我剪接包括了剪切和连接等两个步骤，已知能进包括了剪切和连接等两个步骤，已知能进行自我剪切的行自我剪切的RNA分子有多个，如丁型肝分子有多个，如丁型肝炎病毒炎病毒RNA、链孢霉线粒体、链孢霉线粒体RNA等。等。30几种自我剪切的几种自我剪切的RNARNA结构，其中箭头指出处为自我剪切结构，其中箭头指出处为自我剪切部位。部位。31一、天然核酶一、天然核酶32 目前为止，在自然界中发现目前为止，在自然界中发现的核酶根据其催化的反应可以分的核酶根据其催化的反应可以分成两大类：成两大类：剪切型核酶剪切型核酶 核酶核酶 剪接型核酶剪接型核酶33核酶剪切型核酶剪接型核酶异体催化剪切型或异体催化剪切型或分子间催化剪切型分子间催化剪切型核酶核酶自身催化剪切型或自身催化剪切型或分子内催化剪切型分子内催化剪切型核酶核酶核酶的分类似乎最有应用前景，因为人们似乎最有应用前景，因为人们似乎最有应用前景，因为人们似乎最有应用前景，因为人们对它的剪切机制和分子结构要对它的剪切机制和分子结构要对它的剪切机制和分子结构要对它的剪切机制和分子结构要求已经有所了解，可以针对病求已经有所了解，可以针对病求已经有所了解，可以针对病求已经有所了解，可以针对病毒核酸、不良基因或恶性基因毒核酸、不良基因或恶性基因毒核酸、不良基因或恶性基因毒核酸、不良基因或恶性基因进行人工设计、合成相应的各进行人工设计、合成相应的各进行人工设计、合成相应的各进行人工设计、合成相应的各种种种种RNARNARNARNA或或或或DNADNADNADNA片段作为核酸酶基片段作为核酸酶基片段作为核酸酶基片段作为核酸酶基因，定向地剪切病毒核酸或不因，定向地剪切病毒核酸或不因，定向地剪切病毒核酸或不因，定向地剪切病毒核酸或不良基因以及它们的转录中间产良基因以及它们的转录中间产良基因以及它们的转录中间产良基因以及它们的转录中间产物，抑制它们的表达，进行疾物，抑制它们的表达，进行疾物，抑制它们的表达，进行疾物，抑制它们的表达，进行疾病治疗病治疗病治疗病治疗341、剪切型核酶、剪切型核酶催化自身或者异体催化自身或者异体RNA的切的切割，相当于核酸内切酶。割，相当于核酸内切酶。主要包括主要包括锤头型核酶，发夹锤头型核酶，发夹型核酶，丁型肝炎病毒型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，核酶，以及有蛋白质参与协助完成催化以及有蛋白质参与协助完成催化的的RNaseP35核酶的结构核酶的结构锤头状模型锤头状模型发夹模型发夹模型自身剪切的核酸自身剪切的核酸酶的二级结构酶的二级结构362、剪接型核酶、剪接型核酶实现实现mRNA前体自我拼接，前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活具有核酸内切酶和连接酶两种活性。性。主要包括主要包括组组I内含子内含子和和组组II内内含子含子37一一 锤头型核酶锤头型核酶38 R.Symons等在比较了一些植等在比较了一些植物类病毒、抗病毒和卫星病毒物类病毒、抗病毒和卫星病毒RNA自身剪切规律后提出锤头结自身剪切规律后提出锤头结构（构（hammerhead structure）状）状二级结构模型。二级结构模型。39由由1313个保守核苷酸残基和三个螺旋结构域构成个保守核苷酸残基和三个螺旋结构域构成的。的。（后来（后来KoizumiKoizumi等证明只需要等证明只需要1111个特定保守个特定保守核苷酸）。核苷酸）。40锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图a中中N,N代表任意核苷酸；代表任意核苷酸；X 可以是可以是A、U或者或者C,但不能是但不能是G；I、II和和 III是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。b 是锤头型核酶与底物是锤头型核酶与底物RNA分子结合的立体结构模型，在磷酸骨架上结分子结合的立体结构模型，在磷酸骨架上结合有镁离子合有镁离子 41 Symons等认为，只要具备锤等认为，只要具备锤头状二级结构和头状二级结构和13个保守核苷酸，个保守核苷酸，剪切反应就会在锤头结构的右上剪切反应就会在锤头结构的右上方方GUX序列的序列的3端自动发生。无端自动发生。无论是天然的还是人工合成的锤头论是天然的还是人工合成的锤头结构都由两部分构成：催化结构结构都由两部分构成：催化结构域（域（R）和底物结合结构域（）和底物结合结构域（S）。）。42 William B.Lott等提出了锤头等提出了锤头型核酶催化反应的两种可能的化型核酶催化反应的两种可能的化学机制：学机制：“单金属氢氧化物离子模型单金属氢氧化物离子模型”“双金属离子模型双金属离子模型”。43锤头型核酶的两种可能的催化机制以及锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制核酶的催化机制(a)单金属氢氧化物离子模型，单金属氢氧化物离子模型，(b)双金属离子模型，双金属离子模型，(c)HDV 核酶中胞嘧啶核酶中胞嘧啶充当一般碱进行催化的反应机理充当一般碱进行催化的反应机理 44 二二 发夹型核酶发夹型核酶45发夹型核酶的二级结构模型发夹型核酶的二级结构模型5050个碱基的核酶和个碱基的核酶和1414个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4 4个个螺旋和螺旋和5 5个突环。螺旋个突环。螺旋3 3和和4 4在核酶内部形成，螺旋在核酶内部形成，螺旋1(61(6碱基对碱基对)和和2(42(4碱基碱基对对)由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序是是(G/C/U)NGUC(G/C/U)NGUC，其中，其中N N代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1 1和和2 2之之间的底物间的底物RNARNA链上，切割反应发生在链上，切割反应发生在N N和和G G之间。之间。46三三 蛋白质蛋白质-RNA复合酶复合酶(RNaseP)47 蛋白质蛋白质-RNA复合酶主要催化复合酶主要催化tRNA前体成熟过程。前体成熟过程。例如例如S.Altman和和N.Pace两个两个研究组合作发现的大肠杆菌研究组合作发现的大肠杆菌tRNA5成熟酶。成熟酶。48蛋白质蛋白质-RNA复合酶由蛋白质和复合酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成两个组分构成蛋白质的分子量为蛋白质的分子量为20kDa，M1RNA含有含有377个核苷酸。个核苷酸。M1RNA单独具有全酶活性，单独具有全酶活性，蛋白质只是维护蛋白质只是维护M1RNA的构的构象。象。49实验证明来自不同原核细胞实验证明来自不同原核细胞RNaseP中的中的M1RNA具有相似的三维具有相似的三维结构。结构。与前面几种剪切型核酶不同的是，与前面几种剪切型核酶不同的是，RNaseP催化得到的产物的催化得到的产物的3端是羟基，端是羟基，5端是磷酸。端是磷酸。50四四 组组I内含子和组内含子和组II内含子内含子51组组I内含子内含子(group I intron)和组和组II内内含子含子(group II intron)这类核酶比较复杂，通常包这类核酶比较复杂，通常包括括200个以上核苷酸，主要催化个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。前体的拼接反应。52像蛋白质酶一样，内含子形像蛋白质酶一样，内含子形成高级结构的折叠结果使关键残成高级结构的折叠结果使关键残基形成活性部位，在辅助因子的基形成活性部位，在辅助因子的参与下实现自身剪接。参与下实现自身剪接。53组组I I内含子能够自身剪接的是内含子能够自身剪接的是与它们保守的二级和三级结构有与它们保守的二级和三级结构有关。关。54Group Iintron55除了剪接之外，组除了剪接之外，组内含子还内含子还可催化各种分子间反应，包括剪可催化各种分子间反应，包括剪切切RNA和和DNA、RNA聚合、核苷聚合、核苷酰转移、模板酰转移、模板RNA连接、氨酰基连接、氨酰基酯解等。酯解等。56在体外，组在体外，组内含子的剪接内含子的剪接是经过两个转酯化反应来实现的，是经过两个转酯化反应来实现的，无蛋白质参与。无蛋白质参与。57组组和组和组内含子的主要差别内含子的主要差别是第一步反应的化学机制。是第一步反应的化学机制。58在组在组内含子中，外部的鸟苷内含子中，外部的鸟苷的的3-羟基作为进攻基团，而在组羟基作为进攻基团，而在组内含子中是内部腺苷的内含子中是内部腺苷的2-羟基起羟基起作用作用.59Group II intron60这个反应的结果形成一个带突环这个反应的结果形成一个带突环的内含子的内含子-3外显子分子，其中第外显子分子，其中第一个核苷酸经由一个核苷酸经由2，5-磷酸二酯磷酸二酯键与内含子的键与内含子的A相连。在第二步反相连。在第二步反应中，应中，5外显子的外显子的3-羟基进攻内羟基进攻内含子含子-3外显子连接点，结果是两外显子连接点，结果是两个外显子相连，并释放出带有突个外显子相连，并释放出带有突环的内含子。环的内含子。61脱氧核酶脱氧核酶 人们一般认为人们一般认为DNA是一种很不活泼是一种很不活泼的分子，在生物体内通常以双链形式存在，的分子，在生物体内通常以双链形式存在，仅适合编码和携带遗传信息。仅适合编码和携带遗传信息。62 单链单链DNA是否可以象是否可以象RNA通过自身通过自身卷曲形成不同的三维结构而行使特定的功卷曲形成不同的三维结构而行使特定的功能呢？能呢？答案是肯定的答案是肯定的.63 在一些特殊条件下，以单链形式存在在一些特殊条件下，以单链形式存在的的DNA分子在理论上应该可能出现与人工分子在理论上应该可能出现与人工合成的脱氧核酶相似的结构。合成的脱氧核酶相似的结构。但遗憾的是迄今为止尚未发现天然存但遗憾的是迄今为止尚未发现天然存在的脱氧核酶。在的脱氧核酶。64 目前报道的脱氧核酶都是通过体目前报道的脱氧核酶都是通过体外选择、筛选得到的。外选择、筛选得到的。65 1994年，年，Breaker等利用体外选择技等利用体外选择技术首次发现了切割术首次发现了切割RNA 的的DNA分子，并分子，并将其命名为脱氧核酶，之后也被人称为催将其命名为脱氧核酶，之后也被人称为催化化DNA。66 此后，脱氧核酶由于其具有结构稳定此后，脱氧核酶由于其具有结构稳定(生理条件下生理条件下DNA比比RNA稳定稳定106倍，倍，DNA的磷酸二酯键比蛋白质的肽键抗水解能力的磷酸二酯键比蛋白质的肽键抗水解能力要高要高100倍倍)、成本低廉、易于合成和修饰、成本低廉、易于合成和修饰等特点，很快成为了人们研究的关注点。等特点，很快成为了人们研究的关注点。67 通常脱氧核酶的分子较小，与蛋白质通常脱氧核酶的分子较小，与蛋白质酶相比分子的多样性也较差。已有的研究酶相比分子的多样性也较差。已有的研究已经表明，脱氧核酶都是单链已经表明，脱氧核酶都是单链DNA分子通分子通过自身卷曲、折叠形成的三维结构，在某过自身卷曲、折叠形成的三维结构，在某些特殊的辅助因子作用下与底物结合并发些特殊的辅助因子作用下与底物结合并发挥催化功能。挥催化功能。68 到目前为止，人们通过体外选择的方到目前为止，人们通过体外选择的方法已相继获得具有切割法已相继获得具有切割RNA或或DNA的的水水解酶功能、连接酶功能、多核苷酸激酶和解酶功能、连接酶功能、多核苷酸激酶和过氧化物酶功能以及催化卟啉环金属螯合过氧化物酶功能以及催化卟啉环金属螯合的脱氧核酶。的脱氧核酶。6910-23结构脱氧核酶结构脱氧核酶 目前筛选到的最多的核酶，因为切割目前筛选到的最多的核酶，因为切割RNA分子而可以应用于基因治疗中，阻断分子而可以应用于基因治疗中，阻断体内有害体内有害mRNA的表达。的表达。70具有代表性和实用价值的是具有代表性和实用价值的是Joyce等发现等发现的切割的切割RNA的的10-23脱氧核酶脱氧核酶催化中心底物结合结构域71 10-23脱氧核酶相当于一种序列特异性限制脱氧核酶相当于一种序列特异性限制性内切核酸酶，可以分成两个结构域：催化结性内切核酸酶，可以分成两个结构域：催化结构域和底物结合结构域。构域和底物结合结构域。催化结构域也称活性中心催化结构域也称活性中心，是由，是由15个核苷个核苷酸组成，第八个碱基可以是酸组成，第八个碱基可以是T、C或或A，其中以，其中以T的活性最高，其余序列则高度保守。的活性最高，其余序列则高度保守。活性中心两端各为活性中心两端各为7-8个脱氧核苷酸组成的个脱氧核苷酸组成的臂构成了臂构成了底物结合结构域底物结合结构域，可通过碱基互补与，可通过碱基互补与底物底物RNA特异性结合，其序列可以根据靶特异性结合，其序列可以根据靶RNA的改变而灵活变动。的改变而灵活变动。72 10-23脱氧核酶分子小，催化效率和脱氧核酶分子小，催化效率和底物专一性高，靶序列可以多样化设计，底物专一性高，靶序列可以多样化设计，因此除了医疗外，还有许多其它的应用价因此除了医疗外，还有许多其它的应用价值。值。73 另一种切割另一种切割RNA分子的脱氧核酶与分子的脱氧核酶与1023脱氧核酶的作用机制不同，脱氧核酶的作用机制不同，Terry L.Sheppard等筛选到一个具有等筛选到一个具有N-糖苷酶活性糖苷酶活性的脱氧核酶，这个酶可以水解的脱氧核酶，这个酶可以水解(反应速率反应速率提高提高106倍倍)特定位置上脱氧鸟苷的特定位置上脱氧鸟苷的N-糖苷糖苷键，实现去嘌呤作用，在这个位置上剪切键，实现去嘌呤作用，在这个位置上剪切DNA分子。分子。74 8-17结构脱氧核酶结构脱氧核酶 8-17结构脱氧核酶的结构。这种结构类似类似锤头结构脱氧核酶的结构。这种结构类似类似锤头核酶且具有核酶且具有RNA切割活性的脱氧核酶的活性中心为切割活性的脱氧核酶的活性中心为8-17型，包含一个常为型，包含一个常为3个碱基对的茎个碱基对的茎-环结构和一个环结构和一个45nt的非配对区。茎至少应为的非配对区。茎至少应为2个个G-C对，茎环对，茎环5-AGC-3高度保守，非配对区一般为高度保守，非配对区一般为5-WCGR-3或或5-WCGAA-3(W=A或或T，=A或或G)，切割位点是，切割位点是5-A G-3，A不与脱氧核苷酸配对，不与脱氧核苷酸配对，G则必须与脱氧核则必须与脱氧核苷酸配对苷酸配对 75手枪型结构脱氧核酶手枪型结构脱氧核酶 手枪型结构脱氧核酶包括了手枪型结构脱氧核酶包括了I型和型和II型等两型等两种二级结构呈手枪状并具有自切割功能种二级结构呈手枪状并具有自切割功能DNA分分子。子。76“二分二分”型结构脱氧核酶型结构脱氧核酶 “二分二分”型结构脱氧核酶是一类比较特型结构脱氧核酶是一类比较特殊的脱氧核酶，其活性中心为殊的脱氧核酶，其活性中心为20nt，底物，底物结合区为结合区为58nt，具有，具有RNA切割活性，识切割活性，识别底物别底物RNA位点为位点为A ANNN（N为任何为任何一种核苷酸，不同组合切割活性有一定差一种核苷酸，不同组合切割活性有一定差异）。异）。77“二分二分”型结构脱氧核酶的通用结构型结构脱氧核酶的通用结构78环状结构脱氧核酶环状结构脱氧核酶 以以-内酰胺酶内酰胺酶mRNA为靶位点，设计并合为靶位点，设计并合成成10-23结构脱氧核酶，将其克隆到噬菌体结构脱氧核酶，将其克隆到噬菌体M13mp18质粒中，通过噬菌体表达系统产生含质粒中，通过噬菌体表达系统产生含有脱氧核酶片段的单链环状有脱氧核酶片段的单链环状DNA分子。分子。79DzM13环状脱氧核酶的结构环状脱氧核酶的结构80 在在10-23结构脱氧核酶分子引入环状结构脱氧核酶分子引入环状结构后，不仅提高了其稳定性和在生物体结构后，不仅提高了其稳定性和在生物体内的遗传性，而且在一定的条件下具有特内的遗传性，而且在一定的条件下具有特异性切割异性切割RNA-DNA嵌合底物的功能。嵌合底物的功能。81核酶核酶(脱氧核酶脱氧核酶)的应用的应用82 基因治疗的概念出现在二十几年前，基因治疗的概念出现在二十几年前，现在已经在临床上得到了实际应用。基因现在已经在临床上得到了实际应用。基因治疗最早的临床研究是治疗最早的临床研究是1990年年Blaese 等进等进行的对腺苷脱氨酶行的对腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症的治疗，缺乏症的治疗，随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病随后在对遗传病、病毒侵染、肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展的治疗中得到广泛的应用。中国也是开展基因治疗比较早的国家，基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等年薛京伦等开展了血友病开展了血友病B基因治疗的临床实验，并基因治疗的临床实验，并取得比较理想的效果。取得比较理想的效果。83基因治疗的主要策略可以分为基因治疗的主要策略可以分为:(1)向体内导入外源基因取代体内向体内导入外源基因取代体内 的有缺陷的基因发挥作用；的有缺陷的基因发挥作用；(2)对致病基因进行抑制。对致病基因进行抑制。84 其中其中:第二种方法是用反义核第二种方法是用反义核酸或核酶通过干涉致病基因的转酸或核酶通过干涉致病基因的转录或翻译而清除其表达产物。录或翻译而清除其表达产物。85 对医疗应用来说最主要的还是对医疗应用来说最主要的还是那些具有切割特定那些具有切割特定RNA顺序，从顺序，从而可以在体内抑制某些有害基因而可以在体内抑制某些有害基因的核酶的核酶 86利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理 87 组组I I内含子核酶可以用来修复体内的有害突内含子核酶可以用来修复体内的有害突变基因，为修复型基因治疗开辟了一个很有发变基因，为修复型基因治疗开辟了一个很有发展前景的途径。展前景的途径。88药用核酶应用情况药用核酶应用情况公司公司核酶的作用对象核酶的作用对象研究阶段研究阶段AlzaAnti-ras ribozymes临床前期临床前期American CyanamidB细胞白血病细胞白血病-淋巴瘤淋巴瘤临床前期临床前期Columbia University人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒I一一,二期临床二期临床Gene Shears人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒I一一,二期临床二期临床乙肝病毒乙肝病毒,丙肝病毒丙肝病毒临床前期临床前期Innovir乙肝病毒乙肝病毒,丙肝病毒丙肝病毒临床前期临床前期Osaka University丙肝病毒丙肝病毒临床前期临床前期Ribozyme Pharmaceuticals Inc.人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒I一一,二期临床二期临床血管生成因子血管生成因子临床前期临床前期Tokyo University丙肝病毒丙肝病毒临床前期临床前期University of Pittsburgh神经胶质瘤神经胶质瘤临床前期临床前期City of Hope人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒I一一,二期临床二期临床89脱氧核脱氧核酶酶抑制有害基因表达的研究情况抑制有害基因表达的研究情况作用目标作用目标实验用细胞实验用细胞臂型臂型修饰修饰运输载体运输载体效果效果人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒E63T3细胞系细胞系8/83-3 翻转翻转DOTAP抑制了抑制了60%的的E6 RNA癌基因癌基因c-mycSMC7/7-9/93-3 翻转翻转DOTAP抑制抑制80%细胞的增殖细胞的增殖酪氨酸激酶癌基酪氨酸激酶癌基因因BCR-ABLBV1738/8-15/152 氧甲基帽氧甲基帽Lipofectin出现细胞凋亡出现细胞凋亡BCR-ABL-萤光萤光素酶素酶HeLa(transient)8/8-15/152 氧甲基帽氧甲基帽Lipofectin抑制了抑制了99%萤光素酶萤光素酶表达表达BCR-ABLK56212/6硫代磷酸基硫代磷酸基2-碱碱基帽基帽Cytofectin抑制抑制40%蛋白表达，蛋白表达，50%细胞增殖细胞增殖BCR-ABLCD34+CML-骨髓细胞骨髓细胞12/6硫代磷酸基硫代磷酸基2-碱碱基帽基帽Cytofectin抑制抑制53-80%蛋白表达蛋白表达 人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒IHeLa 7/7无无Lipofectin50%抑制抑制CCR5HeLa 7/7无无Lipofectin50%融合融合人免疫缺陷病毒人免疫缺陷病毒I envU877/7无无Lipofectamine抑制抑制77-81%病毒组装病毒组装亨廷顿氏遗传病亨廷顿氏遗传病基因基因huntingtinHEK-293 8/83-3 翻转翻转Lipofectamine减少了减少了85%Huntingtin 蛋白蛋白NGFI-ASMC9/93-3 翻转翻转SuperFect 增殖下降为增殖下降为75%90 除了在治疗人类疾病方面的除了在治疗人类疾病方面的潜在应用，核酶潜在应用，核酶(脱氧核酶脱氧核酶)在防在防治动、植物病毒侵害以及基因组治动、植物病毒侵害以及基因组研究等分子生物学实验中也有一研究等分子生物学实验中也有一定的应用。定的应用。91 例如田波等设计了针对马铃例如田波等设计了针对马铃薯薯PSTVd(potato spindle tuber viroid)病毒负链病毒负链RNA的核酶，用的核酶，用载体载体pROK2携带核酶基因转移进携带核酶基因转移进入马铃薯中，转基因的马铃薯表入马铃薯中，转基因的马铃薯表现了对现了对PSTVd明显的抵抗能力明显的抵抗能力 92核酶核酶的缺陷的缺陷切割效率比较低切割效率比较低稳定性较低稳定性较低难以引入体内难以引入体内需进行深需进行深入的研究入的研究核酶的应用前景核酶的应用前景十分诱人十分诱人核酶核酶93化学催化剂生物催化剂(酶)酶模拟酶酶核酶脱氧核酶酶其他生物催化剂?一切皆有可能94讨论题通过哪些途径有可能得到高效率的催化剂?95