色谱分析法概论课件

色谱法是一种重要的分离、分析技术混合试样分离单组分检测定性、定量分析色谱法是一种重要的分离、分析技术 混合试样分离单组分1色谱法的由来色谱法的创始人俄国植物学家茨维特(M.Tswett)色谱法的由来色谱法的创始人2色谱法的由来在茨维特的实中：装有CaCO3的玻璃管 色谱柱 CaCO3 固定相 纯石油醚 流动相 色谱法的由来在茨维特的实中：3色谱法的由来 在该实验中，碳酸钙在该实验中，碳酸钙上混合色素被分成不同色带上混合色素被分成不同色带的现象，像一束光线通过棱的现象，像一束光线通过棱镜时被分成不同色带的光谱镜时被分成不同色带的光谱现象一样，因此茨维特把这现象一样，因此茨维特把这种现象称为种现象称为色谱色谱，相应的分，相应的分离方法称为离方法称为色谱法色谱法（色层法（色层法，层析法），层析法）色谱法的由来 在该实验中，碳酸钙上混合色4高分离效能、高灵敏度、高选择性、分析速度快、应用范围广色谱法的特点:高分离效能、高灵敏度、高选择性、色谱法的特点:5色谱学的重要作用诺诺贝贝尔尔化化学学奖奖：1948年年，瑞瑞典典提提塞塞留留斯斯(Tiselius)，电，电泳泳和和吸吸附附分分析析；1952年年，英英国国马马丁丁(Martin)和辛格和辛格(Synge)，分配色谱。，分配色谱。应用的科学领域：生命科学、材料科学、环应用的科学领域：生命科学、材料科学、环 境境科科学等。（科学的科学）学等。（科学的科学）药学（药物分析）：各国药典收载了许多色药学（药物分析）：各国药典收载了许多色 谱谱分分析方法。中国药典二部，析方法。中国药典二部，700多，纯多，纯度度检检查查、定性鉴别或含量测定，一部，定性鉴别或含量测定，一部，600多多鉴鉴别别或或含含量测定。量测定。中药复方制剂质量测检和中药配伍中的应用中药复方制剂质量测检和中药配伍中的应用 色谱学的重要作用诺贝尔化学奖：1948年，瑞典提塞留斯(T6色谱法实质是分离色谱分离的基本条件：1.互不相溶的两相（流动相、固定相）；2.被分离组分在两相之间作相对运动色谱法实质是分离色谱分离的基本条件：7 色谱法实质分离分离依据：各组分在两相之间作用力不同(吸附能力分配系数离子交换能力大小排阻能力其他亲合作用)各组分差速异行分离 色谱法实质分离分离依据：8色谱法分类 按两相状态分 色谱法分类 按两相状态分 9色谱法分类 按分离过程机制分 吸附色谱法吸附色谱法利用吸附剂表面对不同利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差异组分物理吸附性能的差异分配色谱法分配色谱法组分在两相中分配系数组分在两相中分配系数不同不同 离子交换色谱法离子交换色谱法利用离子交换原利用离子交换原理理 排阻色谱法排阻色谱法利用多孔性物质对不利用多孔性物质对不同大小分子的排阻作用同大小分子的排阻作用 等等等等色谱法分类 按分离过程机制分10色谱法分类 按固定相的固定形式分色谱法分类 按固定相的固定形式分11色谱法分类 附：根据所使用的技术不同分 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)化学键合相色谱化学键合相色谱 衍生气相衍生气相(液相液相)色谱色谱 裂解色谱裂解色谱 顶空气相色谱顶空气相色谱 色谱制备色谱制备 色谱分析色谱分析 色谱法分类 12第二节 色谱过程 一、色谱过程实现色谱操作的基本条件是必须具备相对实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相运动的两相，固定相(stationary phase)(stationary phase)和流和流动相动相(mobile phase)(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次多次“分配分配”的过程。的过程。第二节 色谱过程 一、色谱过程13色谱过程组分的结构和性质微小差异组分的结构和性质微小差异 与固定与固定相作用差异相作用差异 随流动相移动的速度不随流动相移动的速度不等等 差速迁移差速迁移 色谱分离。色谱分离。色谱过程组分的结构和性质微小差异 与固定141.气相色谱分离过程 当当试试样样由由载载气气携携带带进进入入色色谱谱柱柱与与固固定定相相接接触触时时，被被固固定定相溶解或吸附相溶解或吸附;随随着着载载气气的的不不断断通通入入，被被溶溶解解或或吸吸附附的的组组分分又又从从固固定定相相中挥发或脱附中挥发或脱附;挥挥发发或或脱脱附附下下的的组组分分随随着着载载气气向向前前移移动动时时又又再再次次被被固固定定相溶解或吸附相溶解或吸附;随随着着载载气气的的流流动动，溶溶解解、挥挥发发，或或吸吸附附、脱脱附附的的过过程程反反复地进行。复地进行。1.气相色谱分离过程 当试样由载气携带进入色谱柱与固定15 当当试试样样由由载载气气携携带带进进入入色色谱谱柱柱与与固固定定相相接接触触时，被固定相溶解或吸附时，被固定相溶解或吸附;随随着着载载气气的的不不断断通通入入，被被溶溶解解或或吸吸附附的的组组分分又又从从固固定相中挥发或脱附定相中挥发或脱附;当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或16色谱分析法概论课件17色谱图 被分析试样从进样开始，经 色谱柱分离，到各组分全部流过检测器 在此期间所记录下来的响应信号随时间而变化的曲线（分布的图像），称为色谱流出曲线或色谱图。色谱图及常用术语色谱图色谱图及常用术语18色谱峰 在一定色谱条件下，组分通过检测器时，响应信号随时间而变化的曲线称为色谱峰。色谱过程按近理想条件和分配系数恒定时的流出曲线为对称的高斯分布曲线，对应的高斯分布函数为：色谱图及常用术语色谱峰色谱图及常用术语19基线 在色谱操作条件下仅有流动相通过检测器时，反映检测器噪声随时间变化的曲线。稳定的基线是一条直线。基线20峰高 从色谱峰顶点到基线的距离峰高 21区域宽度1.峰底宽度在色谱峰两边的转折点(也叫拐点即EF)所画的切线与基线相交的截距。两个拐点E和F之间的距离为EF=，分别位于处。区域宽度22区域宽度2.半峰宽 峰高一半处的宽度GH区域宽度233.标准偏差 两个拐点E和F之间的距离的 一半 4.峰面积 A 色谱峰与基线延长线所包围的面积，精确计算时 3.标准偏差 24保留值的定义1.保留时间 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间保留值的定义25保留值的定义2.死时间 不被固定相保留的组分，从进样开始到色谱峰最大值出现时所需的时间。(空气、甲烷或乙醚峰的保留时间）。实际上为流动相流经色谱柱所需要的时间：柱长（cm)流动相平均线速度(cm/s)保留值的定义柱长（cm)流动相平均26保留值的定义3.调整保留时间 组分的保留时间与死时间之差保留值的定义27 色谱保留值 表明色谱峰在色谱图中的位置（可用时间t、体积V、距离d表示）。它是由色谱分离过程中的热力学因素所决定的。色谱常用术语 色谱保留28保留值的定义 4.保留体积 从进样开始到色谱峰最大值出现时所需通过的流动相的体积 5.死体积 6.调整保留体积在LC中为实测值（mL/min)在GC中为校正到柱稳住压下的平均流速保留值的定义在LC中为实测值（mL/min)在GC中为校正到29相对保留值 某一组分与基准物质的调整保留值之比：相对保留值30总分离效能指标分离度分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。总分离效能指标31设正常峰，W1W2=4，则R=1.5时，99.7%面积(tR 3)被分开，tR=6 ，称 6 分离。R1,峰重叠，未分开峰重叠，未分开R=1,认为基本分开，认为基本分开，4分分离离R=1.5,两峰完全分离，两峰完全分离，6分分离离 设正常峰，W1W2=4，R1,峰重叠，未分开32三、分配系数与色谱分离(一)分配系数和容量因子 分配系数(distribution coefficient；K)是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。三、分配系数与色谱分离(一)分配系数和容量因子 分配系数仅33容量因子(capacity factor；k)：在一定温度和压力 下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。（摩尔数？）又称为质量分配系数或分配比。分配系数与色谱分离还与固定相和流动相的体积有关。容量因子与分配系数的关系容量因子(capacity factor；k)：在一定温度和34tR=t0(1+k)tR=t0(1+K )分配系数与色谱分离（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系v=L/tRu=L/t0tR=t0(1+k)分配系数与色谱分离（二）分配系数和容35（三）色谱分离的前提KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提。=t0(1+KA)=t0(1+KB)tR=t0(KAKB)tR0KAKBkAkB分配系数与色谱分离推导过程：（三）色谱分离的前提KAKB 或kAkB 是色谱分离的前36 色谱理论需要解决的问题：色色谱谱分分离离过过程程的的热热力力学学和和动动力力学学问问题题。影影响响分分离离及及柱柱效效的的因因素素与与提提高高柱柱效效的的途途径径，柱柱效效与分离度的评价指标及其关系。与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；两种色谱理论：塔板理论和速率理论；色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学37 塔板理论的假设：塔板理论的假设：(1)在在每每一一个个平平衡衡过过程程间间隔隔内内，平平衡衡可可以以迅迅速达到；速达到；(2)(2)将将载气看作成脉气看作成脉动（间歇）歇）过程；程；(3)(3)试样沿色沿色谱柱方向的柱方向的扩散可忽略；散可忽略；(4)(4)每次分配的分配系数相同。每次分配的分配系数相同。10-2-1塔板理论-柱分离效能指标柱分离效能指标 1.塔板理论（platetheory）半经验理论；半经验理论；将将色色谱谱分分离离过过程程比比拟拟作作蒸蒸馏馏过过程程，将将连连续续的的色色谱谱分分离离过过程程分分割割成成多多次次的的平平衡衡过过程程的的重重复复 （类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；塔板理论的假设：10-2-1 塔板理论-柱38 色谱柱长：色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为：n=L/H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!色谱柱长：L，保留时间包含死时间，在死时间内不参与分392.有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物用不同物质计算可得到不同的理算可得到不同的理论塔板数。塔板数。组分分在在tM时时间间内内不不参参与与柱柱内内分分配配。需需引引入入有有效效塔板数和有效塔板高度：塔板数和有效塔板高度：2.有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明柱403.塔板理论的特点和不足 (1)当当色色谱谱柱柱长长度度一一定定时时，塔塔板板数数 n 越越大大(塔塔板板高高度度 H 越越小小)，被被测测组组分分在在柱柱内内被被分分配配的的次次数数越越多多，柱柱效效能能则则越越高高，所所得色谱峰越窄。得色谱峰越窄。(2)(2)不不同同物物质在在同同一一色色谱柱柱上上的的分分配配系系数数不不同同，用用有有效效塔塔板板数数和和有有效效塔塔板板高高度度作作为衡衡量量柱柱效效能能的的指指标时，应指指明明测定定物物质。(3)(3)柱柱效效不不能能表表示示被被分分离离组分分的的实际分分离离效效果果，当当两两组分分的的分分配配系系数数K K相相同同时时，无无论论该该色色谱谱柱柱的的塔塔板板数数多多大大，都都无无法法分分离。离。(4)(4)塔塔板板理理论无无法法解解释同同一一色色谱柱柱在在不不同同的的载气气流流速速下下柱柱效效不不同同的的实验结果果，也也无无法法指指出出影影响响柱柱效效的的因因素素及及提提高高柱柱效效的途径。的途径。3.塔板理论的特点和不足 (1)当色谱柱长度4110-2-2速率理论-影响柱效的因素影响柱效的因素1.速率方程 H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度，：理论塔板高度，u：载气的线速度：载气的线速度(cm/s)减小减小A、B、C三项可提高柱效；三项可提高柱效；存在着最佳流速；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？10-2-2 速率理论-影响柱效的因素1.速率方程 42A涡流扩散项A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子：固定相的填充不均匀因子 固固定定相相颗颗粒粒越越小小dp，填填充充的的越越均均匀匀，A，H，柱柱效效n。表表现现在在涡涡流流扩扩散散所所引引起起的的色色谱谱峰峰变变宽宽现现象象减减轻轻，色色谱谱峰峰较窄。较窄。A涡流扩散项 A=2dp 固定相颗粒43B/u分子扩散项 B=2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，11。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，滞留时间，扩散，扩散;(4)扩散系数：扩散系数：Dg(M载气载气)-1/2；M载气载气，B值值。B/u 分子扩散项 B=2 Dg 44k为容量因子；为容量因子；Dg、DL为扩散系数。为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。阻力。C u 传质阻力项 传质阻力包括气相传质阻力传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力和液相传质阻力CL即：即：C=（Cg+CL）k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。C452.载气流速与柱效最佳流速载气流速高时：载气流速高时：传传质质阻阻力力项项是是影影响响柱柱效效的的主要因素，流速主要因素，流速，柱效，柱效。载气流速低时：载气流速低时：分分子子扩扩散散项项成成为为影影响响柱柱效效的主要因素，流速的主要因素，流速,柱效柱效 。H-u曲线与最佳流速：曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度以塔板高度H对应载气流速对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。为最佳流速。2.载气流速与柱效最佳流速载气流速高时：H-u曲线463.速率理论的要点 (1)(1)组组分分分分子子在在柱柱内内运运行行的的多多路路径径与与涡涡流流扩扩散散、浓浓度度梯梯度度所所造造成成的的分分子子扩扩散散及及传传质质阻阻力力使使气气液液两两相相间间的的分分配配平平衡衡不不能能瞬瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通通过过选选择择适适当当的的固固定定相相粒粒度度、载载气气种种类类、液液膜膜厚厚度度及及载载气流速可提高柱效。气流速可提高柱效。(3)(3)速速率率理理论论为为色色谱谱分分离离和和操操作作条条件件选选择择提提供供了了理理论论指指导导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各各种种因因素素相相互互制制约约，如如载载气气流流速速增增大大，分分子子扩扩散散项项的的影影响响减减小小，使使柱柱效效提提高高，但但同同时时传传质质阻阻力力项项的的影影响响增增大大，又又使使柱柱效效下下降降；柱柱温温升升高高，有有利利于于传传质质，但但又又加加剧剧了了分分子子扩扩散散的的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。3.速率理论的要点 (1)组分分子在柱内运行的多路径与涡4710-2-3分离度塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分分离离物物质对的的分分离离度度大大小小受受色色谱过程程中中两两种种因因素素的的综合影响：保留合影响：保留值之差之差色色谱过程的程的热力学因素；力学因素；区域区域宽度度色色谱过程的程的动力学因素。力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示：10-2-3 分离度 塔板理论和速率理论都难以48 色谱分离中的四种情况：柱效较高，柱效较高，K(分配系数分配系数)较大较大,完全分离；完全分离；K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，柱效较低，K较大较大,但分离的不好；但分离的不好；K小，柱效低，分离效果更差。小，柱效低，分离效果更差。色谱分离中的四种情况：柱效较高，K(分配系数)49分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；50令令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：保留值和塔板数，可导出下式：令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），51（1）分离度与柱效）分离度与柱效 分离度与柱效的平方根成正比，分离度与柱效的平方根成正比，r21一定时，增加柱效，可提高分离度，但一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。（2）分离度与）分离度与r21 增大增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的增加一倍，需要的n有效有效 减小减小10000倍。倍。增大增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。的最有效方法是选择合适的固定液。（1）分离度与柱效 52例题1：在在一一定定条条件件下下，两两个个组组分分的的调调整整保保留留时时间间分分别别为为85秒秒和和100秒秒，要要达达到到完完全全分分离离，即即R=1.5 。计计算算需需要要多多少少块块有有效效塔板。若填充柱的塔板高度为塔板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？，柱长是多少？解：解：r21=100/85=1.18 n有效有效 =16R2 r21 /(r21 1)2=161.52(1.18/0.18)2 =1547（块）（块）L有效有效 =n有效有效H有效有效 =15470.1=155 cm 即柱长为即柱长为1.55米时，米时，两组分可以得到完全分离。两组分可以得到完全分离。例题1：在一定条件下，两个组分的调整保留时间53例题2：在在一一定定条条件件下下，两两个个组组分分的的保保留留时时间间分分别别为为12.2s和和12.8s，计计算算分分离离度度。要要达达到到完完全全分分离离，即即R=1.5，所所需需要要的的柱长。柱长。解：解：分离度分离度：塔板数增加一倍，分离度增加多少？塔板数增加一倍，分离度增加多少？例题2：在一定条件下，两个组分的保留时间分别为54第三节 基本类型色谱方法分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法第三节 基本类型色谱方法分配色谱法55一、分配色谱法一、分配色谱法56分配色谱法分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。分配色谱法分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解57分配色谱法固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层 液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机 基团键合到载体上形成的固定相）。流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。分配色谱法固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层58分配色谱法洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解 度的相对大小而决定。正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。分配色谱法洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解 度的相59二、吸附色谱法分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。二、吸附色谱法分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附60吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。吸附系数与吸附剂的61吸附色谱法固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等吸附色谱法固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。62吸附色谱法流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。吸附色谱法流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂）63表17-1一些溶剂在硅胶上的o值溶剂溶剂强度（o）溶剂溶剂强度（o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70表 17-1 一些溶剂在硅胶上的o值溶剂溶剂强度溶剂溶剂强64吸附色谱法洗脱顺序 ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。吸附色谱法洗脱顺序 ka=KaSa/Vm65以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)。不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。分子中取代基的空间排列 以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。66三、离子交换色谱法分离原理 利用被分离组分离子交换能力的 差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式：交换再生+3RNR+OH-ClRNR+3ClOH交换再生+RSO H+Na+Na+33HRSO三、离子交换色谱法分离原理 利用被分离组分离子交换能力67四、空间排阻色谱法分离原理根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离。也称为分子排阻色谱法。四、空间排阻色谱法分离原理根据被分离组分分子的线团尺寸68空间排阻色谱法根据空间排阻（steric exclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数：Kp=Xs/Xm（0Kp1）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。空间排阻色谱法根据空间排阻（steric exclusio69空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质 主要性能参数平均孔径排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质 70空间排阻色谱法流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gel filtration chromatography；GFC)；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相(凝胶渗透色谱gel permeation chromatography；GPC)。空间排阻色谱法流动相 71空间排阻色谱法保留体积与渗透系数的关系VmV0分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。空间排阻色谱法保留体积与渗透系数的关系VmV0分72小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。小结色谱过程方程式：7310-3-1色谱定性分析1.利用纯物质定性的方法 利用保留值定性：通通过过对对比比试试样样中中具具有有与与纯纯物物质质相相同同保保留留值值的的色色谱谱峰峰，来来确确定定试试样样中中是是否否含含有有该该物物质质及及在在色色谱谱图图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将将纯纯物物质质加加入入到到试试样样中中，观观察察各各组组分分色谱峰的相对变化。色谱峰的相对变化。10-3-1 色谱定性分析1.利用纯物质定性的方法 742.利用文献保留值定性 利用相对保留值r21定性 相相对对保保留留值值r21仅仅与与柱柱温温和和固固定定液液性性质质有有关关。在在色色谱谱手手册册中中都都列列有有各各种种物物质质在在不不同同固固定定液液上上的的保保留留数数据据，可可以以用用来进行定性鉴定。来进行定性鉴定。2.利用文献保留值定性 利用相对保留值r21定性 753.保留指数 又又称称KovatsKovats指指数数()，是是一一种种重重现性性较好好的的定定性性参参数数。测定方法：定方法：将将正正构构烷烃作作为标准准，规定定其其保保留留指指数数为分分子子中中碳碳原原子子个数乘以个数乘以100100（如正己（如正己烷的保留指数的保留指数为600600）。）。其其它它物物质的的保保留留指指数数（I IX X）是是通通过过选选定定两两个个相相邻邻的的正正构构烷烷烃烃，其其分分别别具具有有Z Z和和Z Z1 1个个碳碳原原子子。被被测测物物质质X X的的调调整整保保留留时时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：3.保留指数 又称Kovats指数()，是一种重现性76保留指数计算方法保留指数计算方法774.与其他分析仪器联用的定性方法 小型化的台式色小型化的台式色质谱联用用仪（GC-MSGC-MS；LC-MSLC-MS）色色谱-红外光外光谱仪联用用仪；组分的分的结构构鉴定定SampleSampleSampleSample 58905890 1.0 1.0 DEG/MIDEG/MIN N HEWLETTHEWLETT PACKARDPACKARD HEWLETHEWLETT T PACKARPACKARD D 5972A5972A Mass Mass SelectivSelective e DetectoDetector r D D C C B B A A A A B B C C D D GasChromatograph(GC)GasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)MassSpectrometer(MS)SeparationSeparationIdentificationIdentification B B A A C C D D 4.与其他分析仪器联用的定性方法 小型化的台式色质谱联用7810-3-2色谱定量分析1.峰面积的测量（1）峰峰高高（h）乘乘半半峰峰宽宽（Y 1/2）法法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：A=1.064 hY1/2 （2）峰峰高高乘乘平平均均峰峰宽宽法法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：A=h（Y 0.15+Y 0.85）/2 （3）峰峰高高乘乘保保留留时时间间法法：在一定操作条件下，同系物的半峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积：A=hbtR （4）自动积分和微机处理法）自动积分和微机处理法10-3-2 色谱定量分析1.峰面积的测量 792.定量校正因子 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：m i=fi Ai绝对校正因子绝对校正因子：比例系数fi，单位面积对应的物质量：f i=m i /Ai 定量校正因子与检测器响应值成倒数关系：f i=1/Si相相对对校校正正因因子子f i：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f M）,用表示；当mi、mS用质量单位时,以（f W）,表示。2.定量校正因子 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即803.常用的几种定量方法（1）归一化法：特点及要求：特点及要求：归一化法简便、准确；归一化法简便、准确；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。3.常用的几种定量方法（1）归一化法：特点及要求：81（2）外标法外标法也称为标准曲线法。外标法也称为标准曲线法。特点及要求：特点及要求：外标法不使用校正因子，外标法不使用校正因子，准确性较高准确性较高，操作条件变化对结果准确操作条件变化对结果准确性影响较大。性影响较大。对进样量的准确性控制要对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的求较高，适用于大批量试样的快速分析。快速分析。（2）外标法外标法也称为标准曲线法。特点及要求：82