RNA转录后的加工1课件

第三讲第三讲 真核生物真核生物RNARNA转录转录后的加工修饰后的加工修饰主要内容：主要内容：一、和一、和RNARNA加工修饰有关的概念：加工修饰有关的概念：二、真核生物二、真核生物RNA修饰加工的过程：修饰加工的过程：三、原核生物与真核生物三、原核生物与真核生物mRNAmRNA的特征的特征比较：比较：四、四、RNARNA合成与合成与DNADNA合成异同点：合成异同点：一、和一、和RNARNA加工修饰有关的概念：加工修饰有关的概念：真核真核真核真核生物中都存在割裂基因生物中都存在割裂基因生物中都存在割裂基因生物中都存在割裂基因(Interruptedgenes)(Interruptedgenes)：即基因是由内含子和外显子相间排列的。即基因是由内含子和外显子相间排列的。即基因是由内含子和外显子相间排列的。即基因是由内含子和外显子相间排列的。在在在在低等真核生物低等真核生物低等真核生物低等真核生物的基因中割裂基因仅占很小的一部的基因中割裂基因仅占很小的一部的基因中割裂基因仅占很小的一部的基因中割裂基因仅占很小的一部分，但是在分，但是在分，但是在分，但是在高等真核生物高等真核生物高等真核生物高等真核生物基因组中绝大部分都是割基因组中绝大部分都是割基因组中绝大部分都是割基因组中绝大部分都是割裂基因。裂基因。裂基因。裂基因。内含子的数目和长度不同使基因间长度差别很大。内含子的数目和长度不同使基因间长度差别很大。内含子的数目和长度不同使基因间长度差别很大。内含子的数目和长度不同使基因间长度差别很大。在一个典型的哺乳动物基因中约有在一个典型的哺乳动物基因中约有在一个典型的哺乳动物基因中约有在一个典型的哺乳动物基因中约有7878个外显子，个外显子，个外显子，个外显子，分布在分布在分布在分布在16kb16kb 左右的范围内。左右的范围内。左右的范围内。左右的范围内。外显子较短外显子较短外显子较短外显子较短(100200bp)(100200bp)，内含子较长，内含子较长，内含子较长，内含子较长(1kb)(1kb)。剪接剪接(RNAsplicing)：内含子的去除和外显子内含子的去除和外显子的连接过程就称为的连接过程就称为剪接或剪接或称为称为RNA剪接剪接。不不均均一核一核RNA(heterogeneousnuclear,hnRNA)：mRNA 的的初始初始转录产物比成熟的转录产物比成熟的mRNA平均平均长度长，非长度长，非常常不不稳定稳定，序列序列的的复复杂杂程度程度也也非非常常高，称为不高，称为不均均一核一核RNA。二、真核生物二、真核生物RNA修饰加工的主要方式：修饰加工的主要方式：pre-RNAcappingcappingtailingtailingsplicingsplicingmethylationmethylationeditingediting生物学意义生物学意义;matureRNApreventpre-RNAfromdigestedbyRNase(interruptedRNA)astemplate(proteintranslation)linterruptedgenemoveintrons(stopcodon)（一）、一）、pre-RNAcappingCap-0m7GpppXpYp-(共有共有)Cap-1m7GpppXmpYp-Cap-2m7GpppXmpYmp-帽子定义帽子定义帽子定义帽子定义：mRNA 5mRNA 5mRNA 5mRNA 5 端的第一个核苷酸总是端的第一个核苷酸总是端的第一个核苷酸总是端的第一个核苷酸总是7-7-7-7-甲甲甲甲基鸟苷三磷酸基鸟苷三磷酸基鸟苷三磷酸基鸟苷三磷酸（m7Gpppm7Gpppm7Gpppm7Gppp）。）。）。）。mRNA5mRNA5mRNA5mRNA5 端的这种结构端的这种结构端的这种结构端的这种结构称为帽子（称为帽子（称为帽子（称为帽子（capcapcapcap）m7Gppp鸟甘酸转移酶After30Nttranscripted,pre-RNAcappingstart5pppXpY-(30Nt)-3(pre-RNA)pippXpY-mRNA capping proceeding mRNA capping proceeding GTPRNAguanylyltransferaseRNAG-7-methyltransferaseppippXpYp-Gpm7GpppXpYp-(withCap-0)Nt-phosphohydrolaseSAMSAHSAMm7GpppXmpYp-m7GpppXmpYmp-SAM;S-Adenosyl-Lmethionine（腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）SAH;S-Adenosyl-Lhomocysteine（腺苷高半胱氨酸）腺苷高半胱氨酸）2-O-methyltransferase2-O-methyltransferaseGpppXpYp-m7SAH(withCap-1)SAMSAH(withCap-2)在在在在有些真核生有些真核生有些真核生有些真核生物中，当前二物中，当前二物中，当前二物中，当前二位是位是位是位是腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤，且且且且22羟基被甲羟基被甲羟基被甲羟基被甲基化后，其第基化后，其第基化后，其第基化后，其第二位氨基酸的二位氨基酸的二位氨基酸的二位氨基酸的第六位的氨基第六位的氨基第六位的氨基第六位的氨基也可以被甲基也可以被甲基也可以被甲基也可以被甲基化；化；化；化；帽子结构功能：帽子结构功能：帽子结构功能：帽子结构功能：能被能被能被能被核糖体小亚基识别核糖体小亚基识别核糖体小亚基识别核糖体小亚基识别，促使，促使，促使，促使mRNAmRNAmRNAmRNA和核糖体和核糖体和核糖体和核糖体的结合，的结合，的结合，的结合，提高翻译效率提高翻译效率提高翻译效率提高翻译效率；m7Gpppm7Gpppm7Gpppm7Gppp结构能有效地封闭结构能有效地封闭结构能有效地封闭结构能有效地封闭mRNA 5mRNA 5mRNA 5mRNA 5末端，以末端，以末端，以末端，以保护保护保护保护mRNAmRNAmRNAmRNA免受免受免受免受5555核酸外切酶的降解，核酸外切酶的降解，核酸外切酶的降解，核酸外切酶的降解，增强增强增强增强mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的稳定稳定稳定稳定。（二）、二）、pre-RNAtailing1 1 1 1、识别信号：、识别信号：、识别信号：、识别信号：在在在在poly(A)poly(A)添添添添加加加加位点位点位点位点的的的的上上上上游游游游11-3011-30个核个核个核个核苷酸苷酸苷酸苷酸区域区域区域区域内存在一内存在一内存在一内存在一段段段段AAUAAAAAUAAA 序列序列序列序列。是。是。是。是poly(A)poly(A)添添添添加信号加信号加信号加信号。Rabbit-globinmRNA5-CUUUGAAUAAA-poly(A)3-20Rabbit-globinmRNA5-UGGCUAAUAAA-poly(A)3-20Man-globinmRNA5-CUUUGAAUAAA-poly(A)3-20Man-globinmRNA5-UGCCUAAUAAA-poly(A)3-202 2、mRNA mRNA 3 3端端的加尾时间：的加尾时间：转录过程中暴露转录过程中暴露转录过程中暴露转录过程中暴露出出出出AAUAAAAAUAAA信号信号信号信号后，后，后，后，核酸酶核酸酶核酸酶核酸酶在该信在该信在该信在该信号下游约号下游约号下游约号下游约11113030个个个个碱基处进行切割碱基处进行切割碱基处进行切割碱基处进行切割。polyApolyA的长度一的长度一的长度一的长度一般是般是般是般是5050200200个碱个碱个碱个碱基左右。基左右。基左右。基左右。3、添加过程：、添加过程：CPSF(cleavageandpoly(A)specificfactor)：识识识识别别别别AAUAAAAAUAAAAAUAAAAAUAAA序序序序列并列并列并列并指指指指导导导导其他因子活性的发生。其他因子活性的发生。其他因子活性的发生。其他因子活性的发生。CSF(cleavagestimulationfactor)：结合到结合到结合到结合到切割识别位点切割识别位点切割识别位点切割识别位点下下下下游游游游的富含的富含的富含的富含G-UG-UG-UG-U 的序列上，并且导致的序列上，并且导致的序列上，并且导致的序列上，并且导致CPSFCPSFCPSFCPSF与与与与AAUAAA AAUAAA AAUAAA AAUAAA 强强强强烈结合烈结合烈结合烈结合。PAP(poly(A)polymerase)：在：在ployA添加位点添加添加位点添加A；内切酶：内切酶：内切酶：内切酶：(由由由由CFICFICFICFI和和和和CFIICFIICFIICFII构成构成构成构成)，功能是对，功能是对，功能是对，功能是对RNARNARNARNA进行切割。进行切割。进行切割。进行切割。核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶核酸内切酶5m7G-AAUAAA-GUGUGU-3PAPCSFCSFCPSF切割复合体切割复合体：PABP(poly(A)BindingProtein)PABP(poly(A)BindingProtein)：Promotionpoly(A)elongation只有只有只有只有RABPRABP结合到寡聚结合到寡聚结合到寡聚结合到寡聚A A上，上，上，上，PAPPAP才能将才能将才能将才能将PolyAPolyA尾巴延尾巴延尾巴延尾巴延伸到伸到伸到伸到200200个碱基的长度。个碱基的长度。个碱基的长度。个碱基的长度。切割复合体的组切割复合体的组切割复合体的组切割复合体的组装装装装内切酶进行切割内切酶进行切割内切酶进行切割内切酶进行切割polyApolyA聚合酶合聚合酶合聚合酶合聚合酶合成短的多聚成短的多聚成短的多聚成短的多聚A A在在在在PABPPABP结合到短结合到短结合到短结合到短的多聚的多聚的多聚的多聚A A后，聚合后，聚合后，聚合后，聚合酶继续添加酶继续添加酶继续添加酶继续添加A A4、mRNApoly(A)尾尾功能：功能：A、防止防止mRNA降解，大大提高了降解，大大提高了mRNA在在细胞质中的稳定性。细胞质中的稳定性。B、是、是mRNA穿越核膜由细胞核进入细胞质穿越核膜由细胞核进入细胞质的必需形式。的必需形式。C、与翻译有关：切除与翻译有关：切除poly(A)尾会影响翻译尾会影响翻译起始。起始。（三）、（三）、RNAinternalmethylationm5Cm6AHNHHNHOOHNHHN CH3H3C常见常见tRNA中的修饰核苷酸中的修饰核苷酸CmnmCmnm5 5U(5-U(5-羧甲基氨甲基尿苷羧甲基氨甲基尿苷羧甲基氨甲基尿苷羧甲基氨甲基尿苷)mCmmCm5 5UU（5-5-甲氧基羰甲基尿苷）甲氧基羰甲基尿苷）甲氧基羰甲基尿苷）甲氧基羰甲基尿苷）XmXm5 5s s2 2UU（5-5-甲基甲基甲基甲基-2-2硫代尿苷）硫代尿苷）硫代尿苷）硫代尿苷）KK2 2CC（2-2-赖氨酸胞苷）赖氨酸胞苷）赖氨酸胞苷）赖氨酸胞苷）ComCom5 5UU（5(2)-5(2)-羟羧甲基尿苷）羟羧甲基尿苷）羟羧甲基尿苷）羟羧甲基尿苷）II（InosineInosine次黄嘌呤）次黄嘌呤）次黄嘌呤）次黄嘌呤）mm7 7G(7-G(7-甲基鸟苷甲基鸟苷甲基鸟苷甲基鸟苷)mm5 5CC（5-5-甲基胞苷）甲基胞苷）甲基胞苷）甲基胞苷）mm6 6AA（6-6-甲基腺苷）甲基腺苷）甲基腺苷）甲基腺苷）s s2 2CC（2-2-硫代胞苷）硫代胞苷）硫代胞苷）硫代胞苷）(假尿苷）假尿苷）假尿苷）假尿苷）Um(2-O-Um(2-O-甲基尿苷甲基尿苷甲基尿苷甲基尿苷)XoXo5 5U(5-U(5-羟基尿苷羟基尿苷羟基尿苷羟基尿苷)（四）、（四）、RNARNA的剪接的剪接（1 1）、底物：）、底物：）、底物：）、底物：核内核内RNA(nRNA/hnRNA)lRNApolI18s,5.8s,28srRNA(nucleolus：核核仁仁)RNApolIImRNA(nucleoplasm)RNApolIIItRNA,5srRNA,U6-SnRNA(nucleolus&nucleoplasm)lpre-mRNAX7kb;Max.20kb;4-10 xmatureRNAX8Introns1、剪接的分子基础：、剪接的分子基础：（2 2 2 2）核小核小核小核小RNARNARNARNA（SnRNASnRNA）SnRNASnRNA250250NtNt;RichU(namedSnRNAU1U6RichU(namedSnRNAU1U6)l(Pre-RNA+nucloe-protein)250kdcomplex完成完成splicing剪接体剪接体(3)、剪接体剪接体核糖核蛋白体：核糖核蛋白体：（4）、）、Intron-外显子外显子外显子外显子-内含子内含子内含子内含子交界交界交界交界区域区域区域区域 高度保守高度保守高度保守高度保守，成为剪接过程重要的识别序列，成为剪接过程重要的识别序列人类许多重要疾病的病因人类许多重要疾病的病因junctionseq.mut.异常剪接异常剪接病症病症例；地中海贫血症例；地中海贫血症Junctionseq.mut.ofGlobingene干扰干扰mRNA成熟成熟-IntronsbeclassifiedintoI,II,IIIby外显子外显子外显子外显子-内含子内含子内含子内含子交界交界交界交界区域区域区域区域具有具有IntronIorIIorIII的的基因分布不同基因分布不同(nuclear,mt,ct)IntronI,II,III的保守序列不同，的保守序列不同，剪接机制不同剪接机制不同剪接机制不同剪接机制不同三类内含子的区别：三类内含子的区别：groupIofintron(nuclear&mitochondrial)groupIIofintron(mitochondrial)groupIIIofintron(nuclear&chloroplast)2、RNAsplicingmodels1）、）、splicingmodelsofgroupIofintron(nuclear&mitochondrial)A A A A、四膜虫四膜虫四膜虫四膜虫35S 35S 35S 35S rRNArRNArRNArRNA的结构：的结构：的结构：的结构：四膜虫四膜虫四膜虫四膜虫的的的的三三三三种种种种rRNArRNA转录转录转录转录物在一物在一物在一物在一条条条条35S35S的产物中，经加工可以生的产物中，经加工可以生的产物中，经加工可以生的产物中，经加工可以生成成成成 5.8S5.8S5.8S5.8S、17S 17S 17S 17S 和和和和 26S 26S 26S 26S rRNArRNArRNArRNA。大大大大的的的的(26S)(26S)rRNArRNA位位位位于于于于3 3 端端端端。在。在。在。在有些有些有些有些四膜虫四膜虫四膜虫四膜虫种类中，种类中，种类中，种类中，26S26SrRNArRNA基因只有基因只有基因只有基因只有一一一一个个个个很短很短很短很短的的的的内含子内含子内含子内含子。GroupIofroupIofintronintron 首先是在四膜虫首先是在四膜虫首先是在四膜虫首先是在四膜虫35S35SrRNArRNA前体研究中前体研究中前体研究中前体研究中发现的：发现的：发现的：发现的：（1 1）、）、）、）、I I类内含子的结构特点：类内含子的结构特点：类内含子的结构特点：类内含子的结构特点：26s414 Nt intronB、Junctionsequence特征：特征：高度保守，转酯反应的攻击位点高度保守，转酯反应的攻击位点5-exon-U-intron-G-exon-3donorreceptorC、I类内含子内部形成的二级结构：类内含子内部形成的二级结构：所有的所有的所有的所有的I I类类类类内含子内含子内含子内含子均含有均含有均含有均含有9 9个个个个发卡结构的发卡结构的发卡结构的发卡结构的(P1-P9)(P1-P9)特征性特征性特征性特征性二二二二级级级级结构结构结构结构。突突突突变变变变分分分分析析析析证明证明证明证明P3P3、P4P4、P6P6和和和和P7P7属属属属于核心结构；于核心结构；于核心结构；于核心结构；其中其中其中其中P4P4和和和和P7P7是是是是最为最为最为最为保守保守保守保守的序列。的序列。的序列。的序列。P1P1包括包括包括包括左左左左侧侧侧侧外外外外显显显显子子子子的的的的3 3 端端端端，内含子内与此外内含子内与此外内含子内与此外内含子内与此外显显显显子子子子配配配配对对对对的的的的序序序序列列列列称称称称为为为为内部内部内部内部向向向向导导导导序列序列序列序列(Internalguidesequence(Internalguidesequence，IGSIGS）P7P7和和和和P9P9之间之间之间之间有一有一有一有一段段段段非非非非常短常短常短常短的的的的序列序列序列序列，可与内含子可与内含子可与内含子可与内含子3 3 端端端端的的的的GG前前前前面面面面的碱基的碱基的碱基的碱基序列序列序列序列配配配配对对对对。突变分析证明，碱基配对对于突变分析证明，碱基配对对于I I类内含子产生核类内含子产生核心结构，形成核酶的心结构，形成核酶的活性中心活性中心，进行，进行自我剪接自我剪接极极其重要。其重要。vI类内含子二级结构的作用：类内含子二级结构的作用：例如：例如：当把当把突突变变体体引引入入内含子共内含子共有有序列序列中，该中，该突突变变会影响会影响碱碱基基配配对，进对，进而而阻止阻止剪接的剪接的进行进行。但。但通通过过恢复恢复碱碱基基配配对对的的补偿补偿性性突突变变可以可以使使突突变变体体恢复恢复正常正常，能够进行自我剪接。，能够进行自我剪接。I类内含子通过类内含子通过转酯反应转酯反应转酯反应转酯反应进行进行自我剪接自我剪接自我剪接自我剪接2）、）、I类内含子的自我剪接过程：类内含子的自我剪接过程：414 414 NtNt intronintron需要一需要一需要一需要一价价价价阳离阳离阳离阳离子子子子、二二二二价价价价阳离阳离阳离阳离子子子子；游离游离游离游离的鸟苷的鸟苷的鸟苷的鸟苷酸：酸：酸：酸：GTPGTP、GDPGDP、GMPGMP均均均均可可可可；反应反应反应反应不不不不需需需需要要要要外部外部外部外部能能能能量量量量的的的的供给。供给。供给。供给。B B、剪接发生的条件：剪接发生的条件：剪接发生的条件：剪接发生的条件：linearrDNAof35srRNAseq.35srDNAA A、四膜虫四膜虫四膜虫四膜虫35S35SrRNArRNA的结构：的结构：的结构：的结构：26s第二次转酯反应由新产生的外显子第二次转酯反应由新产生的外显子第二次转酯反应由新产生的外显子第二次转酯反应由新产生的外显子3 3 3 3-OH-OH-OH-OH攻击下游攻击下游攻击下游攻击下游邻近内含子邻近内含子邻近内含子邻近内含子3 3 3 3端端端端“G G G GO-P-NO-P-NO-P-NO-P-N”，并与外显子相，并与外显子相，并与外显子相，并与外显子相连，同时释放线状内含子。连，同时释放线状内含子。连，同时释放线状内含子。连，同时释放线状内含子。内含子内含子内含子内含子的自我剪接的自我剪接的自我剪接的自我剪接包括包括包括包括三三三三次次次次转转转转酯酯酯酯反应：反应：反应：反应：第第第第一一一一次次次次转转转转酯酯酯酯反应由反应由反应由反应由游离的游离的游离的游离的G G G G（GTPGTP、GDPGDP、GMPGMP均均均均可）可）可）可）发动发动发动发动，GG的的的的3 3 -OH-OH 攻击攻击攻击攻击外显子外显子外显子外显子的的的的3 3 末末末末端端端端“U U U U-O-O-PPN N”，并与之相连并与之相连并与之相连并与之相连，产生，产生，产生，产生G-G-内含子内含子内含子内含子和和和和外外外外显显显显子子子子的的的的3 3 -OH-OH末末末末端端端端。C、I类内含子的剪接过程类内含子的剪接过程：游离的线状内含子发生第三次转酯反应而形成环状。游离的线状内含子发生第三次转酯反应而形成环状。游离的线状内含子发生第三次转酯反应而形成环状。游离的线状内含子发生第三次转酯反应而形成环状。自自自自拼拼拼拼接的接的接的接的转转转转酯酯酯酯反应中化学反应中化学反应中化学反应中化学键之间键之间键之间键之间交换交换交换交换直直直直接接接接进行进行进行进行。vI类内含子的剪接是自我催化的结果类内含子的剪接是自我催化的结果I I类类类类内含子之内含子之内含子之内含子之所所所所以以以以有催化活性是因为有催化活性是因为有催化活性是因为有催化活性是因为它它它它能产生一种特能产生一种特能产生一种特能产生一种特殊殊殊殊的的的的二二二二级级级级结构结构结构结构或或或或三三三三级级级级结构，而结构，而结构，而结构，而这这这这些结构些结构些结构些结构形形形形式式式式能产生能产生能产生能产生与与与与传统传统传统传统的蛋白质酶一样的的蛋白质酶一样的的蛋白质酶一样的的蛋白质酶一样的活性活性活性活性中心中心中心中心：鸟鸟鸟鸟嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤结结结结合合合合位位位位点点点点和和和和底物结底物结底物结底物结合位点。合位点。合位点。合位点。第一次转酯反应：第一次转酯反应：第一次转酯反应：第一次转酯反应：GG占据占据占据占据G G G G结合位点结合位点结合位点结合位点，外显子的，外显子的，外显子的，外显子的33末末末末端占据酶的端占据酶的端占据酶的端占据酶的底物结合位点底物结合位点底物结合位点底物结合位点。GG的自由羟基攻击内含子的自由羟基攻击内含子的自由羟基攻击内含子的自由羟基攻击内含子的的的的55端。端。端。端。第二次转酯反应：内含子的第第二次转酯反应：内含子的第第二次转酯反应：内含子的第第二次转酯反应：内含子的第414414位点上的位点上的位点上的位点上的GG占据占据占据占据G G G G结合位点结合位点结合位点结合位点，外显子的，外显子的，外显子的，外显子的33端占据酶的端占据酶的端占据酶的端占据酶的底物结合位点底物结合位点底物结合位点底物结合位点。外外外外显子显子显子显子的的的的33碱基碱基碱基碱基的自由羟基攻击内含子的自由羟基攻击内含子的自由羟基攻击内含子的自由羟基攻击内含子33末端末端末端末端GG的的的的33羟羟羟羟基基基基，发生转酯反应，将两个外显子连接起来，同时，发生转酯反应，将两个外显子连接起来，同时，发生转酯反应，将两个外显子连接起来，同时，发生转酯反应，将两个外显子连接起来，同时生成内含子。生成内含子。生成内含子。生成内含子。第三次转酯反应：生成的内含子第三次转酯反应：生成的内含子第三次转酯反应：生成的内含子第三次转酯反应：生成的内含子33端端端端414414位上的位上的位上的位上的GG占占占占据酶的据酶的据酶的据酶的G G G G结合位点结合位点结合位点结合位点，内含子的，内含子的，内含子的，内含子的55端占据端占据端占据端占据底物结合位点底物结合位点底物结合位点底物结合位点，发生第三次转酯反应：发生第三次转酯反应：发生第三次转酯反应：发生第三次转酯反应：414414位的位的位的位的GG攻击内含子近攻击内含子近攻击内含子近攻击内含子近55端的端的端的端的碱基（碱基（碱基（碱基（A16A16或或或或U20U20）的）的）的）的55磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团，发生转酯反应，发生转酯反应，发生转酯反应，发生转酯反应，内内内内含子环化含子环化含子环化含子环化，同时生成一段短的，同时生成一段短的，同时生成一段短的，同时生成一段短的GG核酸核酸核酸核酸。环环状状分子分子G414-A16（G414-U20)在在体外可体外可被被水解水解，变变成成线状线状，这这一过一过程程叫做叫做逆逆环环化化(Reversecyclization)。G414-A16产生的产生的线状线状分子再次发生环化（分子再次发生环化（G414G414攻击攻击U20U20）。）。因此，因此，最终都形成最终都形成G414-U20环环状状分子分子。被被被被剪剪剪剪除除除除的的的的内含子可内含子可内含子可内含子可利利利利用其用其用其用其3333端端端端的的的的位位位位点点点点与与与与55的相应位点的相应位点的相应位点的相应位点发生发生发生发生反应而反应而反应而反应而环环环环化化化化 G414-U20在体外发生在体外发生逆环化逆环化，水解开环水解开环（在在G414-U20之间解开之间解开）而而产生一种产生一种线线性性分子，称为分子，称为L-19 RNAL-19 RNA。L-19 L-19 分子具有酶活分子具有酶活性性，能催化，能催化短短的的寡寡核核苷苷酸酸的的延伸延伸，因此将因此将该种类型的酶称为该种类型的酶称为核酶核酶。L19 as polymerase of poly(C)L19 as polymerase of poly(C)3-G-OHGGGAGGpCCCCC-OHGGGAGGpCCCCC-OH3-G-OH3-GC-OHGGGAGGpCCCCCC-OH3-GGGGAGGC-OH3G-OHGGGAGGHO-CCCCpHO-CCCCCCp总结：总结：2 2、Intron的剪接经过的剪接经过4次转酯反应次转酯反应1、2th414Nt3ed16+399Nt4rd4+395Nt(L19)1 1、GMP（GDP,GTP)通过转酯通过转酯（trans-esterification）方式方式进入进入Intron3 3 3 3、剪接过程不需其他的任何酶类与能量剪接过程不需其他的任何酶类与能量这是因为：这是因为：剪接活性由剪接活性由35s RNA35s RNA自身催化（自身催化（auto-catalysis)auto-catalysis)完成；完成；一处的磷酸酯键转化为另一处新的磷酸酯键一处的磷酸酯键转化为另一处新的磷酸酯键一处的磷酸酯键转化为另一处新的磷酸酯键一处的磷酸酯键转化为另一处新的磷酸酯键（转酯反应），（转酯反应），反应不需以分解高能前体物（反应不需以分解高能前体物（NTPNTP）为代价，形成新的磷酸酯为代价，形成新的磷酸酯键。其破坏的磷酸酯键与形成的磷酸酯键总是相等键。其破坏的磷酸酯键与形成的磷酸酯键总是相等。L19发现的生物学意义发现的生物学意义:1、发展了具有催化功能的大分子种类发展了具有催化功能的大分子种类发展了具有催化功能的大分子种类发展了具有催化功能的大分子种类 Pepzyme（肽酶）肽酶）Chemzyme Ribozyme (3 400 Nt)EnzymeUAAUAA Pepzyme 侧链基团的多样性侧链基团的多样性 分子构型的分子构型的稳定性稳定性稳定性稳定性 进化中取代进化中取代Ribozyme 2 2 2 2、分子进化理论的发展分子进化理论的发展分子进化理论的发展分子进化理论的发展 RNA RNA 是原始生命中最早具有催化功能（切割，连接）的酶是原始生命中最早具有催化功能（切割，连接）的酶活性物质活性物质？！？！B、RNA是原始生命中最早具有是原始生命中最早具有遗传信息载体功能的物质遗传信息载体功能的物质，可，可自我复制。但自我复制。但DNA分子分子分子分子结构的稳定结构的稳定结构的稳定结构的稳定以及双链分子在复制，转以及双链分子在复制，转录中的录中的优势优势优势优势 进化中取代进化中取代RNA的遗传信息载体功能。的遗传信息载体功能。A A、酶活：酶活：酶活：酶活：3）、）、GroupIIsplicingmodelA、JunctionsequenceB.S：BranchSiteof7Ntupstreamof3-junctionseq.5-exon-GUGCG-B.S-PyAU-exon-3供点供点受点受点-PyPuPyPyUAAPy-(Py嘧啶；Pu嘌呤）100%在在BranchSiteBranchSite的两侧的两侧的两侧的两侧存在一些短的序列，存在一些短的序列，这些区域可以与该内含子上游特定序列之间发生互补，这些区域可以与该内含子上游特定序列之间发生互补，形成形成茎环结构茎环结构茎环结构茎环结构(但但B.SB.S中的中的中的中的A A不包含在不包含在不包含在不包含在 互补序列内互补序列内互补序列内互补序列内,从而被排从而被排除成除成芽状突起芽状突起芽状突起芽状突起）5-GUGCG-PyPuPyPyUA APy-PyAU3IntronIRIR5GAU3AB、内含子的结构：内含子的结构：C、Splicingmechanism（两次转酯反应）：两次转酯反应）：IntronIRIRA5GAU3Exon1Exon2GAintronPyAU两个外显子连接在一起两个外显子连接在一起转酯攻击位点转酯攻击位点intronOHAU2A3G游离的内含子形游离的内含子形成成成成套索结构套索结构套索结构套索结构B.SB.SB.SB.S中的中的中的中的A A上上上上 的的的的2 2 -OH-OH发发发发动动动动第第第第一一一一次次次次转转转转酯酯酯酯反应反应反应反应553外显子的外显子的外显子的外显子的3333末端末端末端末端OHOHOHOH攻击内含子攻击内含子攻击内含子攻击内含子3333末端的末端的末端的末端的U U U U，发生第二次转酯反应。发生第二次转酯反应。发生第二次转酯反应。发生第二次转酯反应。5-E1-AAUAGGUGA-I1-UACAGGUUG-E2-E2-CUCAGGUACA-I2-UCAGGUUG-E3-E3-CCAGUAA-I3-UACAGGAA-E4-E4-AUGGUAA-14-AAAGGU-E5-E5-GAGGUAUAU-I5-CCAGCAA-E6-E6-GCAGGUAUGG-I6-GCAGCUU-E7-3Intron与与Exon的连接处的连接处存在部分同源的存在部分同源的consensusseq.卵清蛋白（卵清蛋白（Ovalbumin）mRNA(6Intron,7Exon)4）、）、GroupIIIsplicingmodelA、Junctionsequence5-exon-GU-intron-AG-exon-3供点供点100%94%受点受点7Ntbranchsiteinupstreamof3junctionseq.pyNpyUpuAApyB.SB.S序列：序列：序列：序列：B.SB.SB、III型内含子的剪接机理型内含子的剪接机理由剪接体实现由剪接体实现v 剪接的分子基础：剪接的分子基础：剪接的分子基础：剪接的分子基础：剪接剪接剪接剪接体体体体由由由由蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质和和和和小小小小RNARNA组成。在组成。在组成。在组成。在自自自自然状然状然状然状态态态态下下下下，它，它，它，它们们们们以以以以核核核核糖糖糖糖核核核核蛋白颗粒蛋白颗粒蛋白颗粒蛋白颗粒(snRNPsnRNP)的的的的形式形式形式形式存在存在存在存在。细胞细胞细胞细胞核中的小分子核中的小分子核中的小分子核中的小分子RNARNA称为核小称为核小称为核小称为核小RNA(SmallnuclearRNA(SmallnuclearRNAsRNAs，snRNAsnRNA）。）。）。）。snRNAsnRNA 参参参参与剪接与剪接与剪接与剪接过程，过程，过程，过程，并与其并与其并与其并与其它它它它蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质一一一一起起起起构成构成构成构成一个大的一个大的一个大的一个大的颗粒复合体颗粒复合体颗粒复合体颗粒复合体，称为，称为，称为，称为剪接体剪接体剪接体剪接体(SplicesomeSplicesome)。；。；。；。；位于胞质中的称为胞质小位于胞质中的称为胞质小位于胞质中的称为胞质小位于胞质中的称为胞质小RNA(CytoplasmicRNA(CytoplasmicRNARNA，scRNAscRNA):):细胞质小细胞质小细胞质小细胞质小RNARNA参与参与参与参与蛋白质的合成蛋白质的合成蛋白质的合成蛋白质的合成和和和和运输运输运输运输。在核仁中也存在着一类小的在核仁中也存在着一类小的在核仁中也存在着一类小的在核仁中也存在着一类小的RNARNA，称为，称为，称为，称为snoRNAssnoRNAs，它们在，它们在，它们在，它们在rRNArRNA 的加工中起作用的加工中起作用的加工中起作用的加工中起作用。参参与剪接与剪接反应反应的的snRNPs包括包括U1，U2，U4，U5和和U6。人人人人的的的的U1U1snRNAsnRNA含有含有含有含有8 8种蛋白质种蛋白质种蛋白质种蛋白质，U1U1snRNAsnRNA折叠成独特的折叠成独特的折叠成独特的折叠成独特的二二二二级结构。级结构。级结构。级结构。其其其其U1U1snRNAsnRNA其其其其5 5 末端末端末端末端的的的的1111个核个核个核个核苷酸苷酸苷酸苷酸呈呈呈呈单单单单链链链链状状状状态态态态，含，含，含，含有一个有一个有一个有一个可与可与可与可与内含子内含子内含子内含子5 5 剪接剪接剪接剪接点保守点保守点保守点保守序列序列序列序列互补互补互补互补的一的一的一的一段段段段序序序序列列列列。互补对于内含子的正。互补对于内含子的正。互补对于内含子的正。互补对于内含子的正确剪接很重要。确剪接很重要。确剪接很重要。确剪接很重要。C、III型内含子剪接的过程：型内含子剪接的过程：第第第第一一一一步步步步是由是由是由是由B.SB.S序列序列序列序列中中中中保守保守保守保守A A的的的的22OHOH对对对对外显子外显子外显子外显子3 3 3 3 剪接剪接剪接剪接点的发点的发点的发点的发动动动动亲亲亲亲核核核核攻击攻击攻击攻击。两次转酯反应：两次转酯反应：第二步是由第一步中释第二步是由第一步中释第二步是由第一步中释第二步是由第一步中释放的外显子的自由放的外显子的自由放的外显子的自由放的外显子的自由3-OH3-OH攻击内含子攻击内含子攻击内含子攻击内含子33剪接点。内剪接点。内剪接点。内剪接点。内含子形成套索结构。含子形成套索结构。含子形成套索结构。含子形成套索结构。Branch Site ALariat of intron 5）、）、剪接的调控（剪接的调控（groupIII）对受点序列的选择对受点序列的选择CAG=UAGAAGGAG剪接类型；剪接类型；组成型剪接组成型剪接组成型剪接组成型剪接（constitutivesplicing）cuttingeachintroninonebyone选择性剪接选择性剪接选择性剪接选择性剪接(alternativesplicing)createisoformprotein5%geneinmammal个体发育，细胞分化个体发育，细胞分化对供点或受点的选择对供点或受点的选择剪接的准确与否剪接的准确与否选择性剪接选择性剪接选择性剪接选择性剪接：一个初始转录本按多种方式进行剪接，一个初始转录本按多种方式进行剪接，一个初始转录本按多种方式进行剪接，一个初始转录本按多种方式进行剪接，有些有些有些有些外显子外显子外显子外显子在在在在成熟成熟成熟成熟 mRNAmRNAmRNAmRNA中中中中可以出现或缺失，从而一种基因的转录本可以产生可以出现或缺失，从而一种基因的转录本可以产生可以出现或缺失，从而一种基因的转录本可以产生可以出现或缺失，从而一种基因的转录本可以产生多种成熟的多种成熟的多种成熟的多种成熟的 mRNAmRNAmRNAmRNA。Alternative splicing 具有非常重要的生物具有非常重要的生物学意义。选择性剪接研究最清楚的是果蝇的学意义。选择性剪接研究最清楚的是果蝇的性性别决定系统别决定系统。果果蝇蝇的的性性别别决定决定涉涉及及了了一一系系列列基因的基因的相相互互作用作用，并并且且是是可可变变剪接剪接产生产生了了雌雄果蝇。雌雄果蝇。l果蝇性别的发育与果蝇性别的发育与X性染色体性染色体和常染色体的比例相关和常染色体的比例相关XX/AA=1发育成雌性果蝇发育成雌性果蝇X/AA=0.5发育成雄性果蝇发育成雄性果蝇这种调控关系在胚胎发这种调控关系在胚胎发育早期就已确定，并保育早期就已确定，并保留记忆于体细胞中留记忆于体细胞中 l3个关键基因参与果蝇的性别决定个关键基因参与果蝇的性别决定sxl(性致死基因性致死基因)tra(转化基因转化基因)dsx(两性基因两性基因)性别分化的分子基础：性别分化的分子基础：SxlSxl 基因中的基因中的基因中的基因中的外显子外显子外显子外显子3 3 中含有一个中含有一个中含有一个中含有一个终终终终止止止止密密密密码码码码子子子子，在，在，在，在雄雄雄雄蝇蝇蝇蝇中的中的中的中的mRNAmRNA产物中含有外显子产物中含有外显子产物中含有外显子产物中含有外显子3 3，但，但，但，但雌蝇雌蝇雌蝇雌蝇中中中中无无无无此此此此外外外外显子，因显子，因显子，因显子，因此此此此只只只只有有有有雌蝇雌蝇雌蝇雌蝇产生产生产生产生SxlSxl蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质。是是是是X X X X染色体与常染色体与常染色体与常染色体与常染色体的比例决定了染色体的比例决定了染色体的比例决定了染色体的比例决定了sxlsxlsxlsxl 基因的基因的基因的基因的mRNAmRNAmRNAmRNA的剪接方式。的剪接方式。的剪接方式。的剪接方式。vSxl基因的选择型剪接：基因的选择型剪接：12345678Sxl Sex lethal（8 exon）stop codonFemale alternative splicingMale normal splicing1245678AAAA1 2456 783AAAA Active protein Inactive proteinTra基因含有基因含有4个外显子，其中外显子个外显子，其中外显子2含有一个含有一个终止密码子；终止密码子；v Tra基因的剪接：基因的剪接：在雌性果蝇中，在雌性果蝇中，在雌性果蝇中，在雌性果蝇中，SxlSxl蛋白是一种剪接因子，蛋白是一种剪接因子，蛋白是一种剪接因子，蛋白是一种剪接因子，SxlSxl蛋白的蛋白的蛋白的蛋白的存在阻止了存在阻止了存在阻止了存在阻止了TraTra基因基因基因基因外显子外显子外显子外显子2 2的正常剪接，从而忽略了的正常剪接，从而忽略了的正常剪接，从而忽略了的正常剪接，从而忽略了一个完整的外显子一个完整的外显子一个完整的外显子一个完整的外显子2 2。产生有活性的。产生有活性的。产生有活性的。产生有活性的TRATRA蛋白；蛋白；蛋白；蛋白；而在雄性果蝇中，由于不存在而在雄性果蝇中，由于不存在而在雄性果蝇中，由于不存在而在雄性果蝇中，由于不存在SxlSxl蛋白质，蛋白质，蛋白质，蛋白质，TraTra基因仍基因仍基因仍基因仍然按照正常的方式进行剪接。产生没有活性的然按照正常的方式进行剪接。产生没有活性的然按照正常的方式进行剪接。产生没有活性的然按照正常的方式进行剪接。产生没有活性的TRATRA蛋蛋蛋蛋白；白；白；白；1234Tra Transformer(4 exon)1 234AAAA13 4AAAAStop codonFemale alternative splicingMale normal splicing Active protein Inactive protein 所以所以所以所以tratra基因仅在基因仅在基因仅在基因仅在雌雌雌雌性果蝇性果蝇性果蝇性果蝇中产生中产生中产生中产生蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质，在雄性蛋白中，在雄性蛋白中，在雄性蛋白中，在雄性蛋白中没有活性蛋白产生。没有活性蛋白产生。没有活性蛋白产生。没有活性蛋白产生。此此此此蛋白也蛋白也蛋白也蛋白也是一个是一个是一个是一个剪接剪接剪接剪接调调调调节节节节物。物。物。物。DsxDsxDsxDsx基因的初级转录本共有基因的初级转录本共有基因的初级转录本共有基因的初级转录本共有6 6 6 6个外显子；个外显子；个外显子；个外显子；雌雌雌雌性果蝇在性果蝇在性果蝇在性果蝇在TraTra 蛋白的作用下，蛋白的作用下，蛋白的作用下，蛋白的作用下，1 1 1 1、2 2 2 2、3 3 3 3、4 4 4 4号外显号外显号外显号外显子剪接成成熟的转录本；子剪接成成熟的转录本；子剪接成成熟的转录本；子剪接成成熟的转录本；vdsx基因的剪接：基因的剪接：雄性果蝇由于没有雄性果蝇由于没有雄性果蝇由于没有雄性果蝇由于没有TraTra 蛋白，蛋白，蛋白，蛋白，1 1、2 2、3 3、5 5、6 6号外显号外显号外显号外显子剪接成成熟的转录本；子剪接成成熟的转录本；子剪接成成熟的转录本；子剪接成成熟的转录本；选择性剪接的结果是每种性别中都产生了不同的选择性剪接的结果是每种性别中都产生了不同的选择性剪接的结果是每种性别中都产生了不同的选择性剪接的结果是每种性别中都产生了不同的DSXDSX蛋白：雄性产物阻止了雌性性别分化，而雌性产物抑蛋白：雄性产物阻止了雌性性别分化，而雌性产物抑蛋白：雄性产物阻止了雌性性别分化，而雌性产物抑蛋白：雄性产物阻止了雌性性别分化，而雌性产物抑制了雄性专一性基因的表达。制了雄性专一性基因的表达。制了雄性专一性基因的表达。制了雄性专一性基因的表达。dsx doublesex(6 exon)Female alternative splicingMale splicing1234561 2 3AAAA5613 4AAAA2 DSX-pFemale develop dsx-p Male develop总结：果蝇中特定基因的选择性剪接总结：果蝇中特定基因的选择性剪接决定了其性别分化决定了其性别分化两种染色体比例决定了雌性两种染色体比例决定了雌性两种染色体比例决定了雌性两种染色体比例决定了雌性中中中中SxlSxl基因的剪接弃掉基因的剪接弃掉基因的剪接弃掉基因的剪接弃掉外显子外显子外显子外显子3 3，产生有活性蛋白，产生有活性蛋白，产生有活性蛋白，产生有活性蛋白SxlSxl蛋白的存在使蛋白的存在使蛋白的存在使蛋白的存在使TraTra基因基因基因基因按照弃掉外显子按照弃掉外显子按照弃掉外显子按照弃掉外显子2 2的剪接的剪接的剪接的剪接方式进行。方式进行。方式进行。方式进行。产生有活性蛋产生有活性蛋产生有活性蛋产生有活性蛋白。白。白。白。TraTra蛋白的存在使雌性果蛋白的存在使雌性果蛋白的存在使雌性果蛋白的存在使雌性果蝇的蝇的蝇的蝇的DsxDsx基因按照将前基因按照将前基因按照将前基因按照将前4 4个外显子连接在一起的个外显子连接在一起的个外显子连接在一起的个外显子连接在一起的剪接方式进行。剪接方式进行。剪接方式进行。剪接方式进行。TraTra蛋白蛋白蛋白蛋白可以抑制雄性基因的表可以抑制雄性基因的表可以抑制雄性基因的表可以抑制雄性基因的表达，从而向雌性方向分达，从而向雌性方向分达，从而向雌性方向分达，从而向雌性方向分化。化。化。化。发生选择性剪接的特定条件发生选择性剪接的特定条件发生选择性剪接的特定条件发生选择性剪接的特定条件lDNAmutationordeletion供体供体,受体位置和数目的改变受体位置和数目的改变一条基因中有两个以上的转录起点一条基因中有两个以上的转录起点或两个以上加尾信号或两个以上加尾信号l特化细胞内的特化细胞内的alternativesplicing调控机调控机制制isoformproteinlRNP中中SnRNA或或protein异常异常剪接方式的改变剪接方式的改变6)、反式剪接反式剪接（trans-splicing）以一条以一条pre-RNA 为底物为底物 以两条不同来源的以两条不同来源的pre-RNA 为为底物底物 在在spliceosome中完成中完成 在在spliceosome中完成中完成 组成型剪接组成型剪接 在成熟在成熟RNA的的leading sequence处或选择性剪接处或选择性剪接 拼接一外来的拼接一外来的35Nt的的spliced lead (对供点或受点的识别差异对供点或受点的识别差异)(SL,剪接引导序列剪接引导序列剪接引导序列剪接引导序列)或或 mini-exon cis-splicingtans-splicing lariat intron Y-intron A、反式剪接的发现与证实反式剪接的发现与证实锥虫锥虫锥虫锥虫可变表面糖蛋白（可变表面糖蛋白（可变表面糖蛋白（可变表面糖蛋白（VGSVGS）基因基因基因基因中发现中发现中发现中发现（VandePloeg1982）锥虫中几乎所有锥虫中几乎所有mRNA的的5-end均有相同的均有相同的35Ntseq.(mini-exon)maturemRNA35Nt外来外来RNAVGS5锥虫锥虫genome中发现中发现包含有包含有35Ntseq.在内的在内的135Nt的重复序列的重复序列（约（约200个拷贝）个拷贝）病毒病毒线虫线虫植物植物(mt,ct)人体人体5-tgaactAANNCNNNNNNNNCAGTTTAGTTTCTGTACTNNATTGgtgta-3P35Ntmini-exonconsensusintron均有发现均有发现High conservativeSplicingSplicing ModelModel：-GroupIIIpre-mRNA-GroupIIIpre-mRNA中中中中AUGAUG上游上游上游上游（leadseq.leadseq.）30-70Nt30-70Nt存在通用方式剪接的存在通用方式剪接的存在通用方式剪接的存在通用方式剪接的受点（受点（受点（受点（3AG3AG）pre-mRNApre-mRNA的的的的AUGAUG上游序列中的一个上游序列中的一个上游序列中的一个上游序列中的一个A2-OHA2-OH对对对对SLSL序序序序列内含子中供点的列内含子中供点的列内含子中供点的列内含子中供点的GG发动攻击，发生发动攻击，发生发动攻击，发生发动攻击，发生转酯反应转酯反应转酯反应转酯反应，与，与，与，与 SLSL中供点的中供点的中供点的中供点的GG以以以以2,52,5磷酸酯键连接，并生成游离的前导磷酸酯键连接，并生成游离的前导磷酸酯键连接，并生成游离的前导磷酸酯键连接，并生成游离的前导序列。序列。序列。序列。游离的前导序列游离的前导序列游离的前导序列游离的前导序列33OHOH攻击受点（攻击受点（攻击受点（攻击受点（3AG3AG）形成形成形成形成Y-Y-intronintron 和成熟的和成熟的和成熟的和成熟的mRNAmRNA。锥虫的反式剪接方式锥虫的反式剪接方式A AA AA A7）、酵母）、酵母tRNA的剪接与成熟的剪接与成熟在在在在400400个左右的个左右的个左右的个左右的酵母酵母酵母酵母tRNAtRNA基因中，有基因中，有基因中，有基因中，有4040个割裂基因，个割裂基因，个割裂基因，个割裂基因，均均均均只只只只含含含含有有有有一个内含子一个内含子一个内含子一个内含子，位位位位于于于于反反反反密密密密码码码码子子子子环环环环3 3 端端端端，长度在，长度在，长度在，长度在14-16bp14-16bp 之之之之间。间。间。间。A、酵母酵母tRNA的结构特点：的结构特点：在所有的酵母在所有的酵母在所有的酵母在所有的酵母tRNAtRNAtRNAtRNA内含子中，内含子中，内含子中，内含子中，并没并没并没并没有有有有发现发现发现发现可可可可被被被被剪接剪接剪接剪接酶识酶识酶识酶识别的别的别的别的保保保保守守守守序列序列序列序列。所有所有所有所有酵母酵母酵母酵母tRNAtRNA的的的的内含子中都含有一内含子中都含有一内含子中都含有一内含子中都含有一段段段段与与与与反反反反密密密密码码码码子子子子环环环环互补互补互补互补的的的的序序序序列列列列。酵母酵母酵母酵母苯丙氨酰苯丙氨酰苯丙氨酰苯丙氨酰tRNAtRNA前前前前体体体体中的一个内含子中的一个内含子中的一个内含子中的一个内含子可可可可以以以以与与与与反反反反密密密密码码码码环环环环配配配配对对对对，从从从从而而而而改变了反改变了反改变了反改变了反密密密密码臂码臂码臂码臂的结构。的结构。的结构。的结构。此此此此RNARNA前前前前体体体体内