赖氨酸的生产工艺-课件

赖氨酸的生产工艺1、赖氨酸概述(2)l赖氨酸广泛存在于动物蛋白质中,赖氨酸的生产最早是用酸水解酪素,经分离谷氨酸后制得,其后又从血粉中提取(猪血粉中赖氨酸含量约9%9%10%10%),),但这种方法,工艺比较复杂,产量受到限制。1、赖氨酸概述(3)l1960年以来,日本用营养缺陷型的谷氨酸菌株直截了当发酵生产赖氨酸,其产量不断扩大。l1977年,日本东丽公司以合成的己内酰胺为原料,用酶法生产L-赖氨酸。1、赖氨酸概述(4)l目前,国际上赖氨酸产生菌种的生产水平一般为121214 14 g/Lg/L,对糖的转化率为45%45%。采纳淀粉水解糖(或纯糖)发酵,其产酸率、提取率较高;而采纳糖蜜发酵,其产酸率、提取率要低一些。1、赖氨酸概述(5)l采纳淀粉水解糖(或纯糖)发酵,其产酸率为9%9%11%11%,提取率为83%83%87%87%,原料消耗3 3、2 23 3、5t(5t(淀粉)/t()/t(赖氨酸);l而采纳糖蜜(含糖50%)发酵,其产酸率7%9%,提取率80%85%,原料消耗68t/t。我国广西赖氨酸厂,采纳甘蔗糖蜜发酵,菌种产酸率8、2%,提取率82、4%,接近国际先进水平。2 2、赖氨酸的性质(1)(1)l赖氨酸盐酸盐的化学式为C C6 6H H1414O O2 2N N2 2HClHCl,含氮量为1515、34%34%,相对分子质量182182、6565。l由于游离的赖氨酸易吸收空气中的二氧化碳,故制取结晶比较困难。一般商品都是赖氨酸盐酸盐的形式。2、赖氨酸的性质(2)l赖氨酸的化学名为2,6-2,6-二氨基己酸,具有不对称的-碳原子,故有两种光学活性的异构体(L/DL/D型)。2、赖氨酸的性质(3)l赖氨酸盐酸盐熔点为263,单斜晶系,比旋光度+21。l在 水 中 的 溶 解 度 为 0时 53、6g/100mL,25时为89g/100mL,50时为111、5 g/100 mL,70时为142、8 g/100 mL。l在酒精中的溶解度为0、1g/100mL。2、赖氨酸的性质(4)l赖氨酸含有-氨基及-氨基,只有在-氨基为游离状态时,才能被动物机体所利用,故具有游离-氨基的赖氨酸被称为有效赖氨酸。故在提取浓缩中,要特别注意防止有效赖氨酸受热破坏而影响其使用价值。3、赖氨酸生物合成途径l赖氨酸的生物合成途径与其他氨基酸不同,依微生物的种类而异。l细菌的赖氨酸生物合成途径需要经过二氨基庚二酸(DAPDAP)合成赖氨酸;3、赖氨酸生物合成途径(续)l酵母、霉菌的赖氨酸生物合成途径,需要经过-氨基己二酸合成赖氨酸。l同样是二氨基庚二酸合成赖氨酸途径,不同的细菌,赖氨酸的生物合成途径的调节机制有所不同。4赖氨酸的生产发酵l赖氨酸的发酵生产有直截了当(一步)发酵与两步发酵。l赖氨酸的直截了当发酵法可使用黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、诺卡杆菌等,碳源可为葡萄糖、醋酸、乙醇与石蜡。其转化率与产酸率也有所不同。直截了当发酵法工艺流程赖氨酸的两步发酵法l先使用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型菌株,因缺少二氨基庚二酸脱羧酶,不能生成赖氨酸,因此积累大量的二氨基庚二酸(DAPDAP)。l然后再选用含有二氨基庚二酸脱羧酶的产气杆菌或大肠杆菌,进行酶法脱羧而生成L-L-赖氨酸。4、1L-赖氨酸生产菌种及扩大培养直截了当发酵法生产赖氨酸工艺生产菌种:l中科院北京微生物研究所选育的北京棒杆菌AS1AS1、563563与钝齿棒杆菌PI-3-2(AECPI-3-2(AECr r、HseHse-);AECAEC赖氨酸类似物S-2-S-2-氨基乙基-L-L-半胱氨酸;Hse;Hse天冬氨酰半醛脱氢酶l黑龙江轻工研究所选育的241134241134及179179等。L-赖氨酸生产菌种(续)l这些菌种产酸水平一般为7 78g/L,8g/L,转化率25%25%35%35%,对我国赖氨酸的生产起了较大的作用。但产酸率与转化率均较低,与国外先进水平相比还有较大差距。种子扩大培养l赖氨酸发酵一般依照接种量及发酵罐规模采纳二级或三级种子培养。l培养条件:培养温度30-3230-32。通风比1:01:0、2m2m3 3/(m/(m3 3 min)min),搅拌转速200r/min200r/min。培养时间 8 811h11h。l依照发酵规模,必要时可采纳三级培养。4、2赖氨酸发酵工艺及控制要点l(1)发酵工艺流程赖氨酸发酵工艺及控制要点(2)l(2 2)发酵培养基组成 不同菌株,发酵培养基的组成不完全相同,赖氨酸发酵培养基的组成见有关文献。赖氨酸发酵工艺及控制要点(3)l(3 3)发酵工艺条件及影响因素 温度、pHpH值控制、种龄与接种量、供氧对赖氨酸发酵的影响、生物素对赖氨酸生物合成的影响、硫酸铵对赖氨酸发酵的影响。赖氨酸发酵工艺及控制要点(4)l温度:l幼龄菌对温度敏感,在发酵前期,提高温度,生长代谢加快,产酸期提早,但菌体的酶容易失活,菌体衰老,赖氨酸产量少。赖氨酸发酵,前期控制温度32 32,中后期30 30。赖氨酸发酵工艺及控制要点(5)pHpH值控制 赖氨酸发酵最适pH pH 值为6 6、5 57 7、0 0。控制范围在pH=6pH=6、5 57 7、5,5,在整个发酵过程中,应尽量保持 pHpH值平稳。赖氨酸发酵工艺及控制要点(6)l种龄与接种量一般在采纳二级种子扩大培养时,接种量较少,约2%,种龄一般为812h,当采纳三及种子扩大培养时,种量较大约10%,种龄一般为68h。总之,以对数生长期的种子为好。赖氨酸发酵工艺及控制要点(7)l供氧对赖氨酸发酵的影响 赖氨酸是天冬氨酸族氨基酸,它的最大生成量是在供氧充足,细菌呼吸充足条件下实现的。供氧不足,细菌呼吸受抑制,赖氨酸产量降低,供氧不足只是轻微影响赖氨酸生成。严重供氧不足时,产赖氨酸量特别少而积累乳酸。赖氨酸发酵工艺及控制要点(8)l生物素对赖氨酸生物合成的影响在以葡萄糖,丙酮酸为唯一碳源的情况下,添加过量生物素(200200500g/L500g/L),),赖氨酸积累量显著增加。因为生物素量增加,促进了草酰乙酸的合成,增加了天冬氨酸供给。生物素对赖氨酸生物合成的影响(续)l另一方面,过量生物素使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶起反馈抑制作用,抑制谷氨酸的大量合成,使代谢流转向合成天冬氨酸的方向进行。赖氨酸发酵工艺及控制要点(9)(9)l硫酸铵对赖氨酸发酵的影响硫酸铵对赖氨酸发酵影响特别大。当硫酸铵含量大时菌体生长迅速,使赖氨酸产量低。但在无其他铵离子情况下,用量为4 4、0%0%4 4、5%5%时赖氨酸产量最高。6 6、赖氨酸的提取与精制l赖氨酸的提炼过程包括:发酵液预处理 提取 精制6 6、1 1 赖氨酸发酵液的主要性质l赖氨酸发酵液由于所用的原料、培养基组成及浓度、菌种与发酵工艺不同,其组成也不同,一般由以下四部分组成:氨基酸、菌体、培养基残留物、(1 1)氨基酸l氨基酸 l代谢主产物赖氨酸,含量为78g/L;少量其他氨基酸,如缬氨酸,丙氨酸与甘氨酸,当发酵不正常时含有谷氨酸;少量有机酸,特别是发酵工艺控制不行时,含有乳酸。(2)菌体l菌体l一般含量在1520g(干重)/L。(3 3)培养基残留物l培养基残留物 l如残糖620g/L(随原料不同而异),无机离子(如NH4+、Ca2+、Mg2+、K+与一些阴离子,其中NH4+浓度较高)。(4)色素l色素 l发酵液中的这些杂质对赖氨酸的提取与精制影响特别大,特别是菌体与钙离子等,应尽量除去。6 6、2 2 发酵液的预处理l发酵液的预处理,包括除菌体与影响提取收率的杂质离子。去除菌体的方法有离心分离法与添加絮凝剂沉淀两种方法。离心分离法l采纳高速离心机分离除去,如菌体体积小时需反复分离,成本高。l添加絮凝剂沉淀法是先将发酵液调节到一定的pHpH值,加适宜絮凝剂如聚丙烯酰胺,使菌体絮凝而沉淀,加助滤剂过滤出去。发酵液的预处理(3)l钙离子一般通过添加草酸或硫酸,成钙盐沉淀而除去。经验证明,发酵液经过预处理后,提取收率明显提高。6、3赖氨酸的提取从发酵液中提取赖氨酸通常有四种方法:a a、沉淀法,利用赖氨酸生成难溶性盐而沉淀分离,或使赖氨酸结晶析出;b b、有机溶剂萃取法;c c、离子交换法;d d、电渗析法。赖氨酸的提取(2)l工业生产主要采纳离子交换法提取赖氨酸,该法回收率高,产品纯度高。l赖氨酸是碱性氨基酸,等电点(pI)为9、59。在pH=2、0左右能最大程度地被强酸性阳离子交换树脂吸附。pH=7、09、0被弱酸性阳离子交换树脂吸附。赖氨酸的提取(3)l强酸性阳离子交换树脂与弱酸性阳离子交换树脂对纯赖氨酸溶液与发酵液中赖氨酸的吸附量是不同的。赖氨酸的提取(4)l弱酸性阳离子交换树脂对纯赖氨酸的吸附能力大,但对发酵液中的赖氨酸吸附能力大为降低,这是因为发酵液中除赖氨酸外还有相当多杂质影响所致。因此,从发酵液中提取赖氨酸常选用强酸性阳离子交换树脂。赖氨酸的提取(5)l强酸性阳离子交换树脂的氢型对赖氨酸的吸附比铵型容易得多。然而铵型强酸性阳离子交换树脂能选择性地吸附赖氨酸与其他碱性氨基酸,不吸附中性与酸性氨基酸,故容易与其他氨基酸分离。赖氨酸的提取(6)l另外,选用铵型树脂,能够简化树脂的转型操作,如在用氨水洗脱赖氨酸的同时,树脂已转成铵型,不必再生。因此从发酵液中提取赖氨酸均选用铵型强酸性阳离子交换树脂。赖氨酸提取精制工艺流程6 6、4 4 离子交换法提取赖氨酸l离子交换法提取赖氨酸可用三柱串联的方式,以提高收率。l上柱吸附:上柱方式 、交换量 、上柱流速 l洗脱剂(氨水洗脱 、氨水+氯化铵洗脱 、氢氧化钠洗脱)上柱吸附上柱方式l上柱方式 上柱方式有正上柱与反上柱两种。假如发酵液含菌体等固形物较多,流速较快时,容易造成树脂层堵塞,这是采纳反上柱较好。上柱吸附交换量l交换量 正向上柱时,一般为每吨树脂可吸附90100kg赖氨酸盐酸盐,反向上柱可吸附7080kg赖氨酸盐酸盐。流出液pH=5时表明吸附达饱与。上柱吸附上柱流速l上柱流速 上柱流速应依照上柱液性质、树脂的性质、柱大小及上柱方式等具体情况决定。应在小柱中进行试验确定适合的上柱流速。一般正向上柱速度大些,能够10L/min10L/min的流速吸附;反上柱流速小些。洗涤l上柱后,需用水洗去停留在树脂的菌体、残糖等杂质,直至洗涤水清亮,同时使树脂疏松以利洗涤。洗脱剂l(1 1)氨水洗脱 优点是洗脱液经浓缩除氨后,含杂质较小,有利于后工序精制;缺点是树脂吸附的阳离子,如CaCa2+2+、MgMg2+2+等不易洗脱。洗脱剂(续)l残留在树脂中,随着操作次数的增加而积累,造成树脂吸附氨基酸能力下降。因此在树脂使用一段时间后需要用酸或食盐溶液进行再生处理。洗脱剂(2)l(2 2)氨水+氯化铵洗脱 特点是能够洗脱树脂吸附的CaCa2+2+等阳离子,提高树脂的交换容量,由于在碱性条件下赖氨酸先被洗脱,然后才有CaCa2+2+等离子被洗脱,采取分段收集可不能导致赖氨酸收集液中CaCa2+2+含量增加。氨水+氯化铵洗脱l通过调节氨水与氯化铵的物质的量之比为1:11:1,可直截了当使赖氨酸成单盐酸盐形式存在,不需在中与。洗脱剂(3)l(3 3)氢氧化钠洗脱 特点是没有氨味,容易操作,但在洗脱液中NaNa+含量较高,影响赖氨酸的提纯精制。洗脱剂(4)l洗脱剂的浓度对洗脱效果有影响。一般来讲,为了分离只能用适当浓度的洗脱剂。假如洗脱剂浓度太高,达不到洗脱目的。假如洗脱剂浓度太低,洗脱时间长,收集不集中,赖氨酸浓度低。洗脱剂(5)l使用氨水洗脱时,一般浓度为3、6%5、4%。假如用5的氨水洗脱,收集液赖氨酸平均浓度可达6%8%,洗脱高峰段,赖氨酸盐酸盐含量与达15%16%。洗脱剂(6)l洗脱操作及洗脱液收集,采纳单柱顺流洗脱,为了使洗脱集中,赖氨酸浓度高,应控制好洗脱液流速。一般比上柱流速慢些,多用6 6 L/minL/min的速度洗脱,可依照柱的大小而异。洗脱剂(7)(7)l用茚三酮检查流出液,当有赖氨酸流出时即可收集。一般为pH=9、512,前后流分赖氨酸浓度低而铵含量高,可合并于洗脱用氨水中,以提高收得率。一般收得率可达90%95%。6、5赖氨酸的精制l浓缩与除氨l赖氨酸盐酸盐的结晶与分离 l赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥浓缩与除氨l经过离子交换提取的赖氨酸洗脱液,体积较大,赖氨酸含量较低(约为6080g/L),还含有较多的氨(约为1015g/L),因此需要进行浓缩与除氨。为了收集蒸发出来的氨蒸气,可采纳单效蒸发。浓缩与除氨(2)l浓缩液浓缩至19 20B(赖氨酸盐酸盐含量约为340 360g/L)放出料液,用浓盐酸调节pH=4、9,再接着浓缩至22 23B。在碱性溶液中浓缩时,温度不宜过高,时间不宜过长,否则会生成DL-赖氨酸。波美度与密度换算赖氨酸盐酸盐的结晶与分离l赖氨酸盐酸盐浓缩液放入搅拌罐中,搅拌结晶16 20h,为了使晶体不太细,结晶过程应控制温度,最好在5左右结晶完毕停止搅拌,用离心机分离。赖氨酸盐酸盐的结晶与分离(续)l用少量水洗晶体表面附着的母液,母液经浓缩,结晶,再结晶,直至不能析出结晶时,将母液稀释,上离子交换柱吸附回收赖氨酸。所得的晶体为赖氨酸盐酸盐粗晶体。赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥l结晶析出的赖氨酸盐酸盐粗晶体含量约为78%84%,除含有一定水分(15%20%)外,还含有色素等杂质,制造食品级与医药级赖氨酸盐酸盐需要进一步精制纯化。感谢您的聆听！感谢您的聆听！