流式细胞仪培训-课件

流式细胞术原理和应用流式细胞术原理和应用张张 国国 平平生物医学研究院心血管研究中心生物医学研究院心血管研究中心生物医学研究院心血管研究中心生物医学研究院心血管研究中心2009-6-42009-6-4流式细胞术原理和应用张 国 平生物医学研究院心血管研究中心21主要内容主要内容 流式细胞仪概述流式细胞仪概述 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用 检测的一般步骤检测的一般步骤主要内容 流式细胞仪概述2 一、流式细胞仪概述一、流式细胞仪概述 一、流式细胞仪概述 3BD FACSVantageBD-Calibur Epics Altra流式细胞仪种类BD FACSVantageBD-Calibu4Epics Altra Beckman CoulterEpics Altra Beckman Coult5流式细胞仪的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒6 利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。胞或颗粒进行定量。u 检测表面标记物检测表面标记物u 检测胞浆标记物检测胞浆标记物u 检测胞核内标记物检测胞核内标记物u 检测可溶性蛋白检测可溶性蛋白流式细胞术流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性7流式细胞仪的基本结构前向散射侧向散射8流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可以揭示细胞内部结构信息特殊的显微镜特殊的显微镜流式细胞仪显微镜流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选9 高速测定细胞，大样本计数高速测定细胞，大样本计数 检测稀有细胞检测稀有细胞 多参数分析多参数分析 自动化自动化 细胞分选细胞分选流式细胞仪的主要特点流式细胞仪的主要特点 高速测定细胞，大样本计数流式细胞仪的主要特点10 二、流式细胞仪工作原理二、流式细胞仪工作原理 二、流式细胞仪工作原理 11流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。计算处理。流式细胞仪工作原理流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦12仪器基本组成仪器基本组成流路流路流动室流动室 鞘液鞘液SHEATH SHEATH 样本流样本流SAMPLE SAMPLE 单细胞悬液单细胞悬液5 5 10105 5-1-1 10106 6个个/ml/ml光路光路光源光源滤片滤片光电倍增管光电倍增管PMT HVPMT HV电路电路放大电路放大电路HVHV及及GAIN GAIN 增益增益A/DA/D转换转换统计统计 计算机计算机仪器基本组成流路13流路流路Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流动室流动室流路Injector Fluorescencesignals14流式细胞仪光路图流式细胞仪光路图Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1(FITC)575BP FL2(PE)620BP FL3(ECD)675BP FL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流动室流动室流式细胞仪光路图Air-cooled Argon Ion L15激光配置激光配置488nm氩离子激光器氩离子激光器633nm氦氖激光器氦氖激光器大功率水冷紫外激光器大功率水冷紫外激光器激光配置488nm氩离子激光器16光路光路光路光路-滤片特性滤片特性滤片特性滤片特性l长通滤片长通滤片 允许长于设定波长的光通过允许长于设定波长的光通过l 短通滤片短通滤片 允许短于设定波长的光通过允许短于设定波长的光通过l 带通滤片带通滤片 允许一定带宽的波长通过允许一定带宽的波长通过l当以当以 4545o o 角角放置滤片时放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光同时也可以阻断并折射该波长以下的光 ，这种方式的，这种方式的滤片称为二向色性滤片滤片称为二向色性滤片(dichroic filter)dichroic filter)630 nm BandPass FilterWhite Light Source光路-滤片特性长通滤片 允许长于设定波长的光通过617光信号收集光信号收集 光信号分离，导向，各探测通道光信号分离，导向，各探测通道PMTPMT接收并转化为电信号。接收并转化为电信号。二色镜二色镜 1 2 3带通滤波片带通滤波片光电倍增管光电倍增管激光束激光束细胞细胞收集透镜收集透镜前前向向散散射射光光侧向散射光，侧向散射光，荧光荧光光信号收集 光信号分离，导向，各探测通道PMT18数据处理数据处理FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲处理，模数转换光信号光信号电信号电信号记录数据，显示结果记录数据，显示结果（面积，峰高，宽度）（面积，峰高，宽度）数据处理FSC SSC FL1 19颗粒度颗粒度细胞大小细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号非荧光信号颗粒度细胞大小流式细胞仪产生的信号非荧光信号20FL1 FITC,GFP(PMT2)FL2 PE(PMT3)FL3 ECD,PI(PMT4)FL4 PC5,APC(PMT5)荧光信号荧光信号FL1 FITC,GFP(PMT2)荧光信号21u细胞表面的抗原细胞表面的抗原(或细胞膜受体或细胞膜受体)与相关与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。体复合物。u通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。到细胞群的不同抗原位点表达情况。原原理理细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有22488nm488nm空冷激光空冷激光 ：FITC FITC、PEPE、ECDECD、PC5PC5、PIPI、7AAD7AAD、PerCP PerCP、EGFP EGFP、EYFP EYFP、AO AO、TO TO、Fluo3Fluo3633nm633nm空冷激光：空冷激光：APC APC、APC-CY7 APC-CY7、CY5 CY5 90-490-4水冷激光：水冷激光：UVUV（333-364nm333-364nm）HOECHST 33342 HOECHST 33342、DAPI DAPI 488nm空冷激光：633nm空冷激光：90-4水冷激光：23 三、流式细胞仪应用三、流式细胞仪应用 三、流式细胞仪应用 24流式细胞仪应用流式细胞仪应用 淋巴细胞免疫功能测定淋巴细胞免疫功能测定 干细胞研究干细胞研究 细胞增殖与凋亡检测细胞增殖与凋亡检测 细胞周期及倍体分析细胞周期及倍体分析 细胞活性分析细胞活性分析 细胞分选细胞分选 流式细胞仪应用 淋巴细胞免疫功能测定25淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群活化的活化的T淋巴细胞淋巴细胞抗原特异性免疫细胞抗原特异性免疫细胞调控性调控性T细胞细胞树突状细胞树突状细胞先天免疫细胞先天免疫细胞细胞免疫功能测定细胞免疫功能测定淋巴细胞亚群细胞免疫功能测定26 细胞群细胞群 CD CD抗原抗原 T T细胞细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B B细胞细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK NK细胞细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞内皮细胞 CD105 CD106 CD109 CD105 CD106 CD109 细胞因子受体细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126CDCD抗原及其相关细胞群抗原及其相关细胞群 细胞群 CD抗原27淋巴细胞亚群数量检查项目和意义淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病自身免疫病降低降低增高增高降低降低降低降低AIDS降低降低严重降严重降低低增高增高降低降低SARS降低降低降低降低降低降低降低降低降低降低慢性活动性肝慢性活动性肝炎、肝硬化炎、肝硬化降低降低正常或正常或增高增高降低降低降低降低肿瘤肿瘤降低降低降低降低增高增高降低降低降低降低淋巴细胞亚群数量检查项目和意义疾病CD3CD4CD8CD4/28用用荧光光标记抗体抗体抗体特异性地抗体特异性地结合合细胞上胞上对应的抗原的抗原表达表达该抗原的抗原的细胞被胞被标记上上荧光；光；抗原表达多的抗原表达多的细胞胞荧光光强度度强阳性阳性细胞百分胞百分比或比或浓度度靶蛋白靶蛋白浓度度用荧光标记抗体抗体特异性地结合细胞上对应的抗原表达该抗原的细29淋巴细胞淋巴细胞CDCD抗原的流式细胞检测抗原的流式细胞检测淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测30造血系统干细胞造血系统干细胞肿瘤干细胞肿瘤干细胞间充质干细胞间充质干细胞神经干细胞神经干细胞脂肪干细胞脂肪干细胞干细胞研究干细胞研究造血系统干细胞干细胞研究31热门研究热门研究(肿瘤肿瘤)干细胞干细胞l肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的存在l目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤目前研究的肿瘤干细胞来源于前列腺、乳腺等肿瘤l肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测肿瘤干细胞数量稀少，常规方法很难检测l目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在目前研究发现，肿瘤干细胞和正常细胞在HOECHEST 33342染料摄取方面有重大差别染料摄取方面有重大差别l故流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具故流式细胞仪是分析和检测肿瘤干细胞的重要工具热门研究(肿瘤)干细胞肿瘤组织无限制的增殖在于肿瘤干细胞的32干干细胞能表达胞能表达ABCG2ABCG2泵蛋白，在泵蛋白，在HOECHST 33342HOECHST 33342染染色色时能将能将该染料染料泵出，因此分析不能被出，因此分析不能被该染料染染料染色的色的细胞群胞群时可以可以发现一群不能染色的一群不能染色的细胞既是胞既是干干细胞，因此能胞，因此能够在众多在众多肿瘤瘤细胞中区分出胞中区分出肿瘤瘤干干细胞。胞。肿瘤干细胞中的研究应用肿瘤干细胞中的研究应用-Hoechst 33342 side population 干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST 333433HoechstHoechst+Vera.Side Population CellsHoechstHoechst+Vera.Side Popul34细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死鉴别凋亡与坏死:Annexin/PI2.测定凋亡率测定凋亡率:Annexin、Apo 27、TUNEL3.研究凋亡触发机制：研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及及FasL bcl-2/bax4.多参数多参数分析凋亡是趋势分析凋亡是趋势细胞凋亡研究1.鉴别凋亡与坏死:Annexin/PI35流式细胞仪培训-课件36G1S phaseG2MG112 1DNA含量含量 DNA 含量含量细胞周期时相细胞周期时相G0/1G2/MS细胞数细胞数细胞周期分析细胞周期分析G1S phaseG2MG112 1DNA37PIEthidium BromideAcridine OrangeDAPI(UV excitable)Hoechst 33342(viable,UV excitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的常用的DNA 染料染料PI不能主动进入细胞，需要固定打孔为脂溶性，主动进入细胞常用38DNA含量及细胞周期分析含量及细胞周期分析 细胞周期分析细胞周期分析:在细胞周期在细胞周期(G0(G0，G1G1，S S，G2 G2，M)M)的各个时期，的各个时期，DNADNA的含量随各时相呈现出周期性的变的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记化。通过核酸染料标记DNADNA，并由流式细胞仪进行分，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%G0/G1%，S%S%及及G2/M%G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLINCYCLIN）、）、Ki67Ki67、核增殖抗原（、核增殖抗原（PCNAPCNA）等，对细胞周期进行精）等，对细胞周期进行精确的分期：确的分期：G0G0、G1G1、S S、G2G2、M.M.DNA含量及细胞周期分析 细胞周期分析:在细胞周期(G039G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M40流式细胞仪分选流式细胞仪分选u电荷式分选是当前的主流分选模式电荷式分选是当前的主流分选模式u高速分选是保证结果的基本条件高速分选是保证结果的基本条件u高纯度和高活性是分选的基本要求高纯度和高活性是分选的基本要求u可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外）的波长；真正的紫外）u提供多种分选流动室提供多种分选流动室u光路稳定，紫外激光功率大光路稳定，紫外激光功率大u流式分选和磁珠分选的差别和联系流式分选和磁珠分选的差别和联系流式细胞仪分选电荷式分选是当前的主流分选模式41488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector电荷式细胞分选电荷式细胞分选488 nm laser+-Charged PlatesSi42细胞分选的主要技术指标细胞分选的主要技术指标 分选速度：分选速度：25000个细胞个细胞/秒秒 分选纯度：分选纯度：98%分选后细胞存活率：分选后细胞存活率：97%细胞分选的主要技术指标 分选速度：25000个细胞/秒43Before SortingAfter SortingBefore SortingAfter Sorting44 三、流式细胞仪检测的三、流式细胞仪检测的一般步骤一般步骤 三、流式细胞仪检测的一般步骤 45设置检测方案（PROTOCOL)染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体）同型对照管调电压电压不变，补偿管调补偿电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果检测的一般步骤检测的一般步骤设置检测方案（PROTOCOL)检测的一般步骤46电压调节利用同型对照：设置背景电压调节利用同型对照：设置背景l电压电压 voltsl增益增益 Gain设定阴性和阳性信号定阴性和阳性信号强度的度的临界点界点电压调节利用同型对照：设置背景电压 volts设定阴性和阳47荧光补偿 Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence.FITC520BPPE575BP荧光补偿 Need to do when we mea484 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC54 Color Single Laser(488nm)F49补补 偿偿PEFITCPE+cellsFITC+cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+cells,=PE signal -%FITC signalFor Pure PE+cells,=FITC signal-%PE signalAfter compensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell=the Y-mean of -/-cellsX-mean of the PE cell=the X-mean of-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVER compensation补 偿PEFITCPE+cellsFITC+cell50流式细胞仪培训-课件51淋巴细胞单核细胞中性粒细胞如如何何看看流流式式图图淋巴细胞单核细胞中性粒细胞如何看流式图52流式细胞仪培训-课件53流式细胞仪培训-课件54PIPIAnnexinAnnexinV V细胞凋亡检测细胞凋亡检测PIAnnexin-VPIAnnexinV细胞凋亡检测PIAnnexin-V55G0/G1SG2/MG0/G1SG2/M56Thank you57