普通PCR仪和荧光定量PCR仪的使用

二一二年十二月普通普通PCRPCR仪和荧光定量仪和荧光定量PCRPCR仪的使用仪的使用 Part I 中心PCR(polymerase chain reaction)仪 简介Part II PCR 原理Part III 普通PCR仪操作规程Part 荧光定量PCR原理Part 荧光定量PCR仪操作规程Part I 中心PCR仪简介荧光定量荧光定量PCR仪仪Rotor gene 3000普通普通PCR仪仪Gene AMP System 9700Part II PCR原理蛋白蛋白/酶酶DNAmRNA蛋白蛋白 中心法则中心法则 转录水平转录水平 翻译水平翻译水平 基因水平基因水平（Real time）RT-PCRWestern blotPCR核酸的功能是储存核酸的功能是储存和转移遗传信息，和转移遗传信息，指导和控制蛋白质的合成；指导和控制蛋白质的合成；而蛋白质的主要功能是而蛋白质的主要功能是进行新陈代谢活动和进行新陈代谢活动和作为细胞结构的组成成分。作为细胞结构的组成成分。PCR概念u 利用利用DNA聚合酶、一对引物和四种聚合酶、一对引物和四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸），对模板（三磷酸脱氧核苷酸），对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程，称为物的反应过程，称为PCR。Part II PCR原理Part II PCR原理PCRPCR反应五要素u引物（引物（primer）u酶酶（Taq DNA polymerase）u dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）uMg2+（magnesium）u模板模板（template）Part II PCR原理u1 1、变性：加热至、变性：加热至9595 C C左右，使模板左右，使模板DNADNA变性。变性。u2 2、退火：降低温度至适合的温度（、退火：降低温度至适合的温度（5555 C C左右，左右，引物与模板引物与模板 DNADNA的互补序列配对结合。的互补序列配对结合。u3 3、延伸：温度在、延伸：温度在7070 C C左右时，左右时，TaqTaq DNADNA聚合酶聚合酶从引物从引物3 3端催化复制链以端催化复制链以5 5 -3-3方向延伸。方向延伸。1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍Part II PCR原理Part II PCR原理PCRPCR原理原理PCRPCR的的理论方程理论方程：Y=x(1+Ev)n Y：扩增物数量；X：起始模板数量；Ev：扩增效率扩增效率；n：扩增循环数Part III 普通PCR仪操作规程n开机操作：开机操作：u打开打开PCR仪电源开关；仪电源开关；u向后平推向后平推PCR仪顶盖，放入仪顶盖，放入PCR薄壁管。薄壁管。u向前平推向前平推PCR仪顶盖，并均匀用力将反扣部分压下。仪顶盖，并均匀用力将反扣部分压下。n注意：注意：u9700PCR仪必须使用圆头的仪必须使用圆头的PCR薄壁管。薄壁管。nPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程Gene Amp PCR System 9700Version 3.05User:*RunCreatEditUtilUserF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopnPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程Select User Namecql lyf AcceptNewEditDeleteCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopnPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程User Name_Use ENTER key to select a character.AcceptBackspCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopabcdefghijklmnopqrstuvwxyznPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程Method size last usedExp000 qin0 9 03/01/06 Exp001 qin1 9 04/10/06StartViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopnPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程StartReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp 35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08nPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程Method size last usedExp000 qin0 9 03/01/06 Exp001 qin1 9 04/10/06EditViewUserSortCancelF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStopnPCRPCR仪软件操作指南：仪软件操作指南：Part III 普通PCR仪操作规程EditReturnF1F1F2F3F4F5147Enter2580369CEStop1Hld3Tmp 35Cycles2Holds94.03:0094.00:2055.00:2072.00:2072.07:004.08n关机操作：关机操作：u实验结束后点击实验结束后点击Exit至出现主界面，关闭至出现主界面，关闭PCR仪电源开关；仪电源开关；u均匀用力将反扣部分抬起，向后平推均匀用力将反扣部分抬起，向后平推PCR仪顶盖，取出仪顶盖，取出PCR薄壁薄壁管。管。u向前平推向前平推PCR仪顶盖。仪顶盖。Part III 普通PCR仪操作规程n 首先，传统的首先，传统的PCR 检测方法在测定检测方法在测定PCR 扩增产物前需打开反应管，扩增产物前需打开反应管，容易造成容易造成产物污染产物污染，成为，成为“假阳性假阳性”的主要来源。实时的主要来源。实时PCR 在扩增过程在扩增过程中动态检测，完全以中动态检测，完全以闭管方式闭管方式进行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染进行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染源。源。n 其次，传统其次，传统PCR 都是在都是在PCR 到达到达平台期后进行检测平台期后进行检测。PCR 经过指数经过指数期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现性期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现性很差。实时很差。实时PCR 方法则在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的方法则在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此具有重复性。细小误差尚未放大，因此具有重复性。Part IV 荧光定量PCR原理n定量定量PCR技术的产生技术的产生n1992年由年由Higuchi等人第一次报告：使用等人第一次报告：使用EB内插染料法内插染料法插至双链插至双链DNA，经改装的带有冷经改装的带有冷CCD的的PCR仪检测样仪检测样品的荧光强度品的荧光强度nPCR循环循环=双链双链DNA=染料染料=荧光荧光n后来用与双链后来用与双链DNA有更强结合力的有更强结合力的SYBR Green I取代取代EBPart IV 荧光定量PCR原理激激发发光光CtCt值值Part IV 荧光定量PCR原理使用使用Real Time PCRReal Time PCR扩增装置实时监测扩增装置实时监测PCRPCR扩增产物并进行分析的方法。扩增产物并进行分析的方法。Part IV 荧光定量PCR原理实时定量实时定量实时定量实时定量PCRPCRPCRPCR技术是技术是技术是技术是PCRPCRPCRPCR技术和荧光检测技术的结合技术和荧光检测技术的结合技术和荧光检测技术的结合技术和荧光检测技术的结合 通过荧光通过荧光染料或染料或荧光标记荧光标记的的特异特异性的探针，性的探针，对对PCR产物进行标记跟踪产物进行标记跟踪，实时，实时在线在线监控监控PCR反反应过程应过程，通过仪器通过仪器和和相应相应的的软件分析软件分析结果，结果，对待对待测测样品样品的的初始初始模板模板进行定量进行定量或或定性分析定性分析。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法标记方法标记方法内掺式染料内掺式染料SYBR Green ISYBR Green I序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons FRETFRET引物特异性探针引物特异性探针 AmplifluorAmplifluor(IntergenIntergen)Part IV 荧光定量PCR原理SYBR-Green ISYBR-Green I dsDNAdsDNAdsDNAdsDNA的内插染料是一种能插入到双链的内插染料是一种能插入到双链的内插染料是一种能插入到双链的内插染料是一种能插入到双链DNADNADNADNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与加与加与加与dsDNAdsDNAdsDNAdsDNA的数量成正比。如的数量成正比。如的数量成正比。如的数量成正比。如SYBR GreenSYBR GreenSYBR GreenSYBR Green染染染染料，当它没有结合上双链料，当它没有结合上双链料，当它没有结合上双链料，当它没有结合上双链DNADNADNADNA时，只发出相对时，只发出相对时，只发出相对时，只发出相对弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链弱的荧光；然而，当它一旦插入到双链DNADNADNADNA里里里里时，荧光信号将会强烈地增加，时，荧光信号将会强烈地增加，时，荧光信号将会强烈地增加，时，荧光信号将会强烈地增加，从而根据荧光从而根据荧光从而根据荧光从而根据荧光信号的增强来计算信号的增强来计算信号的增强来计算信号的增强来计算PCRPCR扩增产物的增加。扩增产物的增加。扩增产物的增加。扩增产物的增加。Part IV 荧光定量PCR原理5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I Part IV 荧光定量PCR原理5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I Part IV 荧光定量PCR原理双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）5端标记荧光分子（如：端标记荧光分子（如：FAM），），在在3端标记一个吸收或端标记一个吸收或淬灭荧光的分子（如：淬灭荧光的分子（如：TAMRA），），这样这样5端激发出的荧光会端激发出的荧光会被被3端的分子淬灭或吸收掉，所以开始时，仪器并不能检测到端的分子淬灭或吸收掉，所以开始时，仪器并不能检测到荧光。由于荧光。由于Taq聚合酶同时具有聚合酶同时具有5端外切酶的活性，在端外切酶的活性，在PCR反应反应的延伸阶段，的延伸阶段，Taq酶会把酶会把5端的荧光分子切下，使其与端的荧光分子切下，使其与3端吸收端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测到荧光信号。每一个循环，随着环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算光信号的增强来计算PCR产物扩增量的增加。产物扩增量的增加。Part IV 荧光定量PCR原理RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitationPart IV 荧光定量PCR原理Real Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。引物二聚体要求严格。Real Time PCRReal Time PCR用引物与普通用引物与普通PCRPCR引物设计要求不同引物设计要求不同=对引物设计要求严格对引物设计要求严格普通普通PCRPCR引物引物Real Time PCRReal Time PCR引物引物两条引物的两条引物的TmTm值尽量接近，应用专用软件计算值尽量接近，应用专用软件计算TmTm值值 TmTm值值40-60%(40-60%(最好最好45-55%)45-55%)GCGC含量含量PrimerPrimer长度长度80-150 80-150 bpbp(尽量限制在尽量限制在300 300 bpbp以内以内)扩增片段大小扩增片段大小17-25 base17-25 base使用使用BLASTBLAST检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性 特异性特异性 引物内部或两条引物之间避免引物内部或两条引物之间避免3 base3 base以上的互补序列以上的互补序列 引物引物3 3 末端避免末端避免2 base2 base以上的互补序列以上的互补序列 互补性互补性3 3 末端序列末端序列 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich(AT rich(特别是特别是3 3 端端)避免避免T/CT/C连续，连续，A/GA/G连续连续序列序列 3 3 末端避免末端避免GC richGC rich或或AT richAT rich 3 3 末端碱基最好为末端碱基最好为G G 或或C C 3 3 末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为T T尽量在尽量在ExonExon junction junction上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基因组DNADNA扩增扩增 RT-PCRRT-PCR用引物用引物Real Time PCRReal Time PCR引物设计原则引物设计原则线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）：）：0.8-1.20.8-1.235Cycles35Cycles内可得到好的定量结果。内可得到好的定量结果。如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增。内无非特异性产物扩增。No No T Template emplate C Controlontrol确认确认30Cycles30Cycles内无引物二聚体产生。内无引物二聚体产生。相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98反应性能确认反应性能确认1、开始运行仪器、开始运行仪器 打开打开PCR仪底座开关，再打开定量仪底座开关，再打开定量PCR仪检测仪检测器开关。实验前先让系统预热器开关。实验前先让系统预热30分钟，打开电脑，启分钟，打开电脑，启动动iQ5软件。软件。2、放置样品、放置样品 将将PCR反应体系加入到反应体系加入到0.2ml的薄壁管或的薄壁管或96孔板孔板中，盖上管盖。注意，必须带一次性塑料手套，不要中，盖上管盖。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。的加热孔中。Part V 荧光定量PCR仪操作规程3、设置程序，运行实验、设置程序，运行实验 定量定量PCR软件操作基本步骤为：软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（设置热循环程序文件（Protocol file）b.设置反应板文件（设置反应板文件（Plate Setup file）c.点击点击“Run”键键,运行程序运行程序 数据分析数据分析 Part V 荧光定量PCR仪操作规程4、结果分析、结果分析（1）PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct值等。值等。（2）如需进行表达量分析、等位基因分析等，）如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件在软件窗口选择相应分析功能。窗口选择相应分析功能。（3）点击右上方的）点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告键，还可输出结果报告单单5、关闭运行仪器、关闭运行仪器 实验结束后关闭实验结束后关闭iQ5软件、荧光定量检测器及扩软件、荧光定量检测器及扩增系统电源，关闭电脑，取出反应管。增系统电源，关闭电脑，取出反应管。Part V 荧光定量PCR仪操作规程SARS Control RNA 10SARS Control RNA 105 5-10-101 1扩增曲线扩增曲线 SARS Genomic RNA Sample 1SARS Genomic RNA Sample 1、扩增曲线、扩增曲线 SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA扩增曲线扩增曲线 标准曲线标准曲线 绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS样品中所含样品中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量