功能基因组学课件

第二讲第二讲 基因组序列诠释基因组序列诠释第二讲 基因组序列诠释1 1问题问题n n基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？n n基因组作为一个整体如何行使其功能？n n用什么方法寻找基因，研究基因地功能呢？问题基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？2 21.寻找基因寻找基因1.1 根据开放读码框预测基因A A 起始密码子起始密码子 ATG ATGn n第一个第一个ATGATG的确定的确定(依据依据KozakKozak规则规则););Kozak Kozak规则是基于已知数据的统计结果规则是基于已知数据的统计结果.所谓所谓KozakKozak规则，即第一个规则，即第一个ATGATG侧翼序列侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律的碱基分布所满足的统计规律.1.寻找基因1.1 根据开放读码框预测基因3 3Kozak规则:若将第一个若将第一个ATGATG中的碱基中的碱基A A，T T，G G分别分别标为标为1,21,2，3 3位，则位，则KozakKozak规则可描述如下：规则可描述如下：(1)(1)第第4 4位的偏好碱基为位的偏好碱基为G G；(2)ATG(2)ATG的的5 5端约端约15bp15bp范围的侧翼序列内不含碱范围的侧翼序列内不含碱基基T T；(3)(3)在在-3-3，-6-6和和-9-9位置，位置，G G是偏好碱基；是偏好碱基；(4)(4)除除-3-3，-6-6和和-9-9位，在整个侧翼序列区，位，在整个侧翼序列区，C C是是偏好碱基。偏好碱基。Kozak规则:4 4B B 信号肽分析信号肽分析 信号肽分析软件信号肽分析软件(SignalP(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP)http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP)把预测过程中证实含完整把预测过程中证实含完整mRNA 5mRNA 5端的序端的序列翻译为蛋白序列列翻译为蛋白序列;然后用然后用SignalPSignalP软件对前软件对前5050个氨基酸序列个氨基酸序列(从第一个从第一个ATGATG对应的甲硫氨酸对应的甲硫氨酸MetMet开始开始)进行进行评估，如果评估，如果SignalPSignalP分析给出正面结果，则测分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽试序列有可能为信号肽;B 信号肽分析5 5C C 终止密码子终止密码子 终止密码子终止密码子:TAA,TAG,TGA:TAA,TAG,TGA GC%=50%GC%=50%终止密码子每终止密码子每 64 bp 64 bp出现一次；出现一次；GC%50%GC%50%终止密码子每终止密码子每100100200 bp 200 bp 出现一次；出现一次；由于多数基因由于多数基因 ORF ORF 均多于均多于5050个密码子，因此最可个密码子，因此最可能的选择应该是能的选择应该是 ORF ORF 不少于不少于100 100 个密码子。个密码子。C 终止密码子6 6D 3端的确认 3端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。D 3端的确认7 7E 非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度少于100 个密码子，有的不到50个密码子甚至更少；E 非编码序列、内含子8 8F F 密码子偏爱性密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密同义密码码，其差别仅在密码子的第，其差别仅在密码子的第3 3位碱基不同。位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（异，如人类基因中，丙氨酸（AleAle）密码子多）密码子多为为GCA,GCCGCA,GCC或或GCT,GCT,而而GCGGCG很少使用。很少使用。F 密码子偏爱性9 9G 外显子内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征，外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如如:内含子的内含子的5 5端或称供体位（端或称供体位（donor donor sitesite）常见的顺序为）常见的顺序为 5 5AGAG GTTAAGT-3GTTAAGT-3；3 3端又称受体位（端又称受体位（acceptor site),acceptor site),多为多为5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，嘧啶核苷酸，T T或或C)C)；G 外显子内含子边界1010 H H 上游控制顺序上游控制顺序 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与它们可与DNADNA结合蛋白作用，控制基因表达。结合蛋白作用，控制基因表达。通过同源性比较来预测通过同源性比较来预测mRNAmRNA的的5 5端，最常用的端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project,Eukaryotic Promoter Database,(The TRADAT Project,Eukaryotic Promoter Database,EPD.http:/www.epd.unil.ch/)EPD.http:/www.epd.unil.ch/)。另外个别生物基因组的另外个别生物基因组的特有组成特有组成也可作为判别依也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有据，如脊椎动物基因组许多基因的上游都有CpGCpG岛。岛。H 上游控制顺序1111I 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件(ORF finder:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)判断ORF的可能范围。I 软件预测12121.2 同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。1.2 同源查询途径1313同源有如下几种情况：A DNA序列某些片段完全相同；B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；D 模拟多肽高级结构相似同源有如下几种情况：14141.3 试验分析 Northern Northern 杂交确定杂交确定DNADNA片段是表达序列片段是表达序列.注意事项：注意事项：a a 当某一基因的转录产物进行当某一基因的转录产物进行可变剪接可变剪接时，由时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带一的杂交带;如果该基因是某一如果该基因是某一基因家族基因家族的成员也会出现的成员也会出现多个信息；多个信息；b b 考虑考虑组织专一性组织专一性和和发育阶段发育阶段的问题；的问题；1.3 试验分析1515功能基因组学课件1616功能基因组学课件1717C 基因表达产物丰度的问题 如果风度较低，用拟Northern 杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析。拟Northern 杂交 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。C 基因表达产物丰度的问题1818n n动物园杂交 根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的DNA 顺序与来自另一亲缘物种的DNA片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有1个或多个基因，这种方法又称为动物园杂交。动物园杂交 根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性1919功能基因组学课件20202 获取基因全长获取基因全长cDNA序列序列A 构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库。2 获取基因全长cDNA序列A 构建cDNA文库，用目的基因2121cDNA文库构建(CLONTECH)cDNA文库构建(CLONTECH)2222cDNA文库构建cDNA文库构建2323B 根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。B 根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDN24245RACE(CLONTECH)5RACE25253RACE(CLONTECH)3RACE2626功能基因组学课件2727功能基因组学课件28283.确定确定DNA顺序中基因的位置顺序中基因的位置A 通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域；B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；3.确定DNA顺序中基因的位置A 通过对全长cDNA序列的测29294.实验确认基因功能实验确认基因功能4.1 4.1 基因剔除基因剔除(knock-out)(knock-out)最简便的基因失活的方法最简便的基因失活的方法.主要原理主要原理:在一段无关在一段无关DNA DNA 片段的两测连接与代换片段的两测连接与代换基因基因两测两测相同的顺序相同的顺序,将这一构建导入目的细将这一构建导入目的细胞胞,由于由于同源片段之间的重组同源片段之间的重组,可使可使无关片段无关片段取代靶基因取代靶基因,整合到染色体中整合到染色体中.为了便于筛选为了便于筛选,用于取代的外源用于取代的外源DNADNA中中含有报告基因含有报告基因.4.实验确认基因功能4.1 基因剔除(knock-out)3030tk 胸苷激酶标记基因 gangcyclovirneor 新霉素抗性基因G418tk 胸苷激酶标记基因 gangcyclovir31功能基因组学课件324.2 基因超时表达 通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促使基因超表达,致使受体表现出生长与发育的异常,来研究基因的功能.4.2 基因超时表达33 4.3反义RNA 反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA(sense RNA)或DNA 编码顺序结合,干扰mRNA 的转录,加工和转运,调控基因的表达.4.3反义RNA 反义RNA是由基因的负链34v构建反义RNA 表达载体:将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 转化目标生物 获得转基因个体或品系 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 判别目的基因的功能构建反义RNA 表达载体:35正义表达载体反义表达载体正义表达载体反义表达载体36v反义RNA 作用机理：A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。反义RNA 作用机理：374.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制.4.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通过双链38RNAi 作用机理A dsRNA核酸内切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 个核苷酸长的RNA链;B 这些小片段RNA(siRNA)作为另一个核糖核酸复合体RISC(RNA-induce silencing complex,RNA诱导沉默复合体)的指引物,结合到RISC上,使之识别并降解mRNA,从而导致与双链RNA同源的基因沉默;RNAi 作用机理A dsRNA核酸内切酶Dicer被激活,39功能基因组学课件40vRNAi设计方法及应用A Fraser 合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA微量注射和喂食干扰同源基因的表达B Chuang 等设计出嵌合体结构 连接强启动子大量表达双链mRNA干扰同源基因的表达RNAi设计方法及应用41HbF基因的RNAi载体构建HbF基因的RNAi载体构建42RNAi技术的优缺点vRNAi最根本的特点是特异性vRNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代;vRNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因,RNAi也会同时作用与它们.RNAi技术的优缺点RNAi最根本的特点是特异性434.5 酵母双杂交（酵母双杂交（yeast two-hybridization）v原理：其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。正常条件下：转录因子（包括两个功能区域）结合功能域同基因上游的区段结合 激活功能域激活RNA多聚酶 将基因转录为mRNA 4.5 酵母双杂交（yeast two-hybridizat44v酵母杂交系统中：融合表达载体1 融合表达载体2DNA结合功能域+目的片段激活功能域+多种未知cDNA 融合表达载体1同一细胞 融合表达载体2 形成聚合物，启动报告基因的表达表达载体共转化酵母杂交系统中：DNA结合功能域激活功能域+45功能基因组学课件464.6 其他方法v构建转座子突变库v噬菌体外显v内含子归槽突变v开放读框顺序标签4.6其他方法构建转座子突变库47本节课主要内容:v如何预测基因vRACE技术vRNAi技术v基因剔除法本节课主要内容:如何预测基因485.基因表达6.蛋白组学下节课本节内容结束谢谢本节内容结束谢谢!5.基因表达6.蛋白组学下节课本节内容结束谢谢!49