精氨酸激酶(AK)课件

LOGO精氨酸激酶精氨酸激酶(AK)的表达及其纯化的表达及其纯化LOGO目录目录研究背景研究背景1实验材料实验材料2实验方法实验方法3结果及分析结果及分析4蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化v蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方需的和基础的工作。目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而础上建立的。目标蛋白质的分离决不是一件轻而易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十易举的事情，因为要把它与性质、大小和结构十分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有分相似的其他蛋白质分离开来存在许多困难。有些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑些目标蛋白质在组织细胞内的含量很低，这无疑将增加获取足量蛋白质的难度。将增加获取足量蛋白质的难度。目标蛋白质的分离纯化程序主要包括目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:材料的选择；材料的选择；组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；组织匀浆和破碎细胞获取粗提取液；蛋白质初步提纯；蛋白质初步提纯；选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白,直至完全直至完全 纯化；纯化；目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保目标蛋白的鉴定。用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离持它的生物活性。因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下纯化过程中要在较低温度下(0(04)4)操作，注意使操作，注意使用蛋白酶用蛋白酶(使蛋白质降解的酶使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。一、蛋白质是两性电解质一、蛋白质是两性电解质 根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋根据蛋白质的分子结构，很容易得出构成蛋白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的白质的两性解离的基础是氨基酸残基的侧链可解离的基团。基团。作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点作为两性电解质，每种蛋白质都有其等电点(pI)(pI)，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。，这与它所含的氨基酸种类和数量有关。所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都所有的蛋白质，不管它具有什么样的功能，都能在细胞内起一定的缓冲作用。能在细胞内起一定的缓冲作用。1.1.蛋白质的电泳分离蛋白质的电泳分离 凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用凝胶电泳是目前常用的一种生化方法。用于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝于蛋白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制胶是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行而成，其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性选择。以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和变性电泳。电泳和变性电泳。1 透析透析2 层析原理层析原理3 凝胶过滤凝胶过滤4 离子交换层析离子交换层析5 亲和层析亲和层析6 电泳电泳主要内容1 透透 析析按照分子大按照分子大小进行分离。小进行分离。分离取决于分离取决于透析袋截留透析袋截留的分子量。的分子量。透析液透析液浓缩的蛋白浓缩的蛋白混合样品混合样品 透析袋透析袋 开始透析开始透析处于平衡状态处于平衡状态 层析也称之色谱，基本原理是分析样品作层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为层析因固相介质不同又分为离子交换离子交换离子交换离子交换层析层析层析层析、分子筛层析分子筛层析分子筛层析分子筛层析和和吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析等各种层析。等各种层析。2 2 层析原理层析原理 将作为固相成分的将作为固相成分的不溶性基质，例如葡不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。用平衡液平衡。然后加样品，再然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。用适当的溶剂洗脱。样品中各种成分样品中各种成分通过柱子取决于与固通过柱子取决于与固相成分的相互作用，相成分的相互作用，最后以不同速率被洗最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个脱出来，达到将各个成分分离的目的。成分分离的目的。凝胶层析是按照蛋凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排过滤、分子筛层析或排阻层析。阻层析。单个凝胶珠本身象单个凝胶珠本身象“筛子筛子”。不同类型凝。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。胶的筛孔的大小不同。1.2 凝胶过滤层析凝胶过滤层析带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进入小分子进入葡聚糖珠内葡聚糖珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图凝胶过滤层析过程示意图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶凝胶珠珠蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白MrMrMrMr“选择性曲线选择性曲线选择性曲线选择性曲线”G-200G-100logMrKav如如果果被被分分离离的的样样品品中中各各个个成成分分受受溶溶液液pH的的影影响响，有有时时带带正正电电荷荷，有有时时带带负负电电荷荷，此此时时就就可可利利用用离离子子交交换换层层析析方方法法进进行行样样品的分离。品的分离。离离子子交交换换层层析析的的固固相相是是离离子子交交换换体体，包包括括离离子子交交换换树树脂脂、离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。离子交换纤维素、离子交换葡聚糖。带带有有SO3 或或COO基基团团，通通常常以以SO3Na 或或COOH形形式出现的叫做阳离子交换基式出现的叫做阳离子交换基；带带有有N（C2H5）基基团团通通常常以以N（C2H5）Cl出出现现的的叫叫做做阴离子交换基阴离子交换基。3 离子交换层析离子交换层析阳离子交换基阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂阴离子交换基阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素时时时时刻刻刻刻要要要要记记记记住住住住：蛋蛋白白质质是是由由氨氨基基酸酸聚聚合合形形成成的的聚聚合合物物，所所以以蛋蛋白白质质也也存存在在等等电电点点（pI），蛋蛋白白质质在在溶溶液液中中带带电电状状况况同氨基酸相同，取决于所处溶液的同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。值。当当pI pH时时，蛋蛋白质带净正电荷。白质带净正电荷。举一例子：举一例子：举一例子：举一例子：已知蛋白已知蛋白X等电点为等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答答案案：建建立立阴阴离离子子交交换换柱柱，比比如如Q-Sepharose。用用pH8.5的的缓缓冲冲液液平平衡衡柱柱子子，同同时时蛋蛋白白X溶溶解解于于pH8.5的的缓缓冲冲液液中中，在在此此pH值值下下蛋蛋白白X带带有有负负电电，将将含含有有蛋蛋白白X的的混混合合液液上上样样，然然后后用起始液冲洗，蛋白用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。阳阳离离子子交交换换层层析析过过程程离子交离子交换树脂换树脂蛋白质蛋白质高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗高离子高离子强度洗强度洗脱液洗脱液洗加加样样平平衡衡液液洗洗收集收集依依赖赖于于蛋蛋白白质质和和它它的的配配体体（ligand）之之间间的的相相互互作作用用来来分分离离的的。配配体体通通常常指指的的是是能能与与另另一一个个分分子子或或原原子子结结合合（一一般般是是非非共共价价结结合合）的的分分子子、基基团团、离离子子、或或原原子子。但但在在亲亲和和层层析析中中，配配体体是是通通过过共共价价键键先先与与基基质质结结合合，配配体体可可以以是是酶酶结结合合的的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。当当蛋蛋白白质质混混合合物物通通过过装装有有连连接接了了配配体体的的基基质质的的亲亲和和层层析析柱柱时时，只只有有靶靶蛋蛋白白可可以以特特异异地地与与基基质质结结合合，而而其其它它没没有有结结合合的的蛋蛋白白质质首首先先被被洗洗脱脱下下来来。特特异异结结合合在在基基质质上上的的靶靶蛋蛋白白最最后后可可以以用用含含有有高高浓浓度度自自由由配配体体的的溶溶剂剂洗洗下下。所所以以有有时时只只用用亲亲和和层析就可使蛋白质的纯化提高层析就可使蛋白质的纯化提高1000至至10000倍。倍。4 亲和层析亲和层析含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品混合蛋白样品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）亲和层析过程亲和层析过程his-tag所用层析凝胶的基质所用层析凝胶的基质上连接了一个上连接了一个NTA（=nitrilotriacetic acid 氮基三乙酸），可以与氮基三乙酸），可以与Ni离子离子结合，而结合，而Ni离子与融合蛋白的离子与融合蛋白的6Xhis氨基酸之间产生如图的氨基酸之间产生如图的吸引力，从而将带有吸引力，从而将带有his-tag组组氨酸标签的融合氨酸标签的融合 蛋白与其它蛋白与其它蛋白区分开来。蛋白区分开来。从图中可以看到，组氨酸残基从图中可以看到，组氨酸残基红色红色五元咪唑环是蛋白与五元咪唑环是蛋白与NiNi离离子作用的关键。子作用的关键。因此带暴露的因此带暴露的His-6的蛋白能的蛋白能结合于固化结合于固化NiNi树脂，用适当缓树脂，用适当缓冲溶液冲洗去其他蛋白后，再冲溶液冲洗去其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可用可溶的竞争性螯合剂洗脱可以回收靶蛋白以回收靶蛋白。电泳v 电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresisgel electrophoresis）。凝胶可以是）。凝胶可以是淀粉凝胶（淀粉凝胶（starch gelstarch gel）、琼脂糖凝胶（）、琼脂糖凝胶（agarose gelagarose gel）和聚）和聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gelpolyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的）。一般凝胶介质中的pHpH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。的多少有关。电泳技术分类垂直板电泳垂直板电泳毛细管电泳毛细管电泳水平板电泳水平板电泳电电泳泳支支持持物物滤纸滤纸凝胶凝胶薄膜薄膜圆盘电泳圆盘电泳SDSPAGE测定相定相对分子分子质量量十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油亲油（蛋白质疏水区）（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键研究背景研究背景 精氨酸激酶的简介精氨酸激酶的简介无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase,AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3），是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。AK在体内催化反应方程式如下：LOGO主要实验仪器主要实验仪器紫紫外外分分光光光光度度计计U4300，电电脑脑恒恒温温层层析析柜柜、ORION pH计计、紫紫外外检检测测仪仪、冷冷冻冻离离心心机机、超超声声破破壁壁仪仪、雪雪山山制制冰冰机机、超超纯纯水水机机、低低温温恒恒温温槽槽电电泳泳仪仪、电电子子天天平平、振振荡荡培培养养箱箱、单单人人单单面面净净化化工工作作台台、电电热热恒恒温温鼓鼓风风干干燥燥箱箱、高高压压灭灭菌菌锅锅实验内容实验内容1 活化菌种活化菌种 取取50 L50 L表达菌种接入表达菌种接入6 mL6 mL的的LBLB液体培养基（含有卡那青液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为霉素，其工作浓度为50 g/mL50 g/mL）中，于）中，于37 37 摇床振荡培摇床振荡培养养8-128-12小时。小时。2 扩大培养扩大培养 将试管中活化的将试管中活化的3 mL3 mL菌液接种到菌液接种到100 mL LB100 mL LB培养基，同培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度时加入卡那青霉素（终浓度50 g/mL50 g/mL）培养基于）培养基于3737恒温恒温培养箱中培养培养箱中培养2-3 2-3 小时。小时。3 IPTG诱导诱导AK的表达的表达 实验中在不同的培养时间（用实验中在不同的培养时间（用ODOD值表征菌体密度）加值表征菌体密度）加入入 IPTGIPTG诱导表达发现，当温度为诱导表达发现，当温度为22 22，OD=0.6-0.8OD=0.6-0.8时，时，IPTGIPTG终浓度为终浓度为0.5 mM0.5 mM时时AKAK的表达量达到最大。的表达量达到最大。4 蛋白质提取蛋白质提取（1 1）将上述各管于）将上述各管于4 4，5000 r/m5000 r/m离心离心1010分钟；分钟；（2 2）弃上清，使沉淀物质重悬，每）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g 1 g 沉淀加沉淀加5 mL5 mL裂解裂解液；液；（3 3）在冰上进行）在冰上进行1010分钟，间隔为分钟，间隔为2 2秒钟的超声波破壁秒钟的超声波破壁,直直到沉淀变得澄清为止；到沉淀变得澄清为止；（4 4）于）于4 4，12000 rpm12000 rpm，离心，离心1010分钟，取上清，得到分钟，取上清，得到AKAK的粗提液。的粗提液。5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白亲和层析法纯化融合蛋白预处理：预处理：(1)(1)用用2 M2 M盐酸胍盐酸胍10 mL10 mL与树脂打散混合洗涤；与树脂打散混合洗涤；(2)(2)用用Stripping BufferStripping Buffer洗洗2020分钟；蒸馏水洗分钟；蒸馏水洗3030分钟；分钟；(3)1.5 M(3)1.5 M盐酸胍洗盐酸胍洗3030分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗3030分钟；分钟；(4)(4)用用1 M NaOH1 M NaOH洗洗1 1小时；用小时；用Binding BufferBinding Buffer洗洗2020分钟；蒸馏分钟；蒸馏水洗水洗3030分钟；分钟；(5)(5)用用1.5 M NaCl1.5 M NaCl洗洗1 1小时；用小时；用Binding BufferBinding Buffer洗洗2020分钟；蒸分钟；蒸馏水洗馏水洗3030分钟；分钟；(6)Ni(6)Ni柱再生：柱再生：150 mL 0.1 M NiSO4150 mL 0.1 M NiSO4洗洗蒸馏水洗（穿流液蒸馏水洗（穿流液无色）无色）Binding BufferBinding Buffer平衡。平衡。平衡：平衡：6 6倍柱床体积倍柱床体积Binding BufferBinding Buffer（pH=8.0pH=8.0）平衡。）平衡。上样：插上样：插A280A280滤光片，调滤光片，调A A值（值（0 0）、）、T T值（值（100100）；打开采集）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液将粗提液45 mL45 mL上柱，流速约为上柱，流速约为1.6-1.8 mL/min1.6-1.8 mL/min。洗脱：上样完后，继续用洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer Binding Buffer（pH=8.0pH=8.0）淋洗。）淋洗。待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（20 mM20 mM、40 mM40 mM、80 mM80 mM、100 mM100 mM、150 mM150 mM）洗脱。在）洗脱。在280 nm280 nm处进行连处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。程度。6 AK的检测SDS-PAGE电泳：电泳：（1 1）安装双垂直板电泳槽；）安装双垂直板电泳槽；（2 2）配）配12%12%的分离胶的分离胶5 mL5 mL，浓缩胶，浓缩胶3 mL3 mL；（3 3）制样：取样品）制样：取样品20 L20 L与样品缓冲液与样品缓冲液10 L10 L混合，混合，100 100 加热加热5 5分钟；分钟；（4 4）上样：用微量注射器加样）上样：用微量注射器加样15-20 L15-20 L（5 5）电泳：在凝胶上加）电泳：在凝胶上加40 V/cm40 V/cm电压，待染料进入分离胶后电压，待染料进入分离胶后将电压提高到将电压提高到140 V/cm140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；继续电泳直到染料到达底部；（6 6）固定和染色：用考马斯亮蓝）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250R-250染色液浸泡，加热几染色液浸泡，加热几分钟；分钟；（7 7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-53-5次，直到胶板次，直到胶板呈现淡蓝色。呈现淡蓝色。酶活力及浓度测定酶活力及浓度测定 采用改进的方法测定精氨酸激酶的活性，这采用改进的方法测定精氨酸激酶的活性，这个反应体系含有个反应体系含有5.7 mM5.7 mM精氨酸，精氨酸，4.8 mM ATP,6.6 mM4.8 mM ATP,6.6 mM乙酸镁，复合酸碱指示剂乙酸镁，复合酸碱指示剂(麝香草酚蓝一甲基红麝香草酚蓝一甲基红)，20 20 mMTris-ClmMTris-Cl，pH 8.2pH 8.2。反应底物溶液。反应底物溶液25 25 预热预热1010分钟。分钟。测定活力是将测定活力是将1 ml1 ml反应液加入光径反应液加入光径1 cm1 cm容积为容积为3 ml3 ml的的塑料比色杯中，加入塑料比色杯中，加入10 L10 L酶酶AKAK启动反应，测定启动反应，测定575 575 nmnm处光吸收值在处光吸收值在6060秒之内的变化。秒之内的变化。LOGO 重组重组AKAK的表达与纯化结果的表达与纯化结果图图5 纯化的纯化的AK经分子排阻层析图谱经分子排阻层析图谱 LOGO6、重组、重组AK的最适温度和最适的最适温度和最适pH图图7 温度和温度和pH对重组对重组AK活力的影响活力的影响LOGO