细菌药敏试验课件(同名1630)

第四章第四章 抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验黄露萍黄露萍抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验n n测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。药敏试验的意义药敏试验的意义n n预测抗菌治疗的效果；n n指导抗菌药物的临床应用；n n发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；n n监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。药敏试验药敏试验n nMIC：在与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是1824小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。n n对倍稀释的优点：n n操作容易操作容易n n敏感株的敏感株的MICMIC呈正态分布呈正态分布n n区分异常区分异常(R)R)与敏感与敏感(S)S)的菌群的菌群药敏试验折点的建立药敏试验折点的建立 1.MIC的分布的分布2.药代动力学和药效学药代动力学和药效学 定MIC的折点3.临床疗效和细菌清除率临床疗效和细菌清除率4.抑菌圈直径的分布定抑菌圈折点定抑菌圈折点n n统计学的统计学的线性回归线性回归n n计算计算错误率错误率：尽可能减少极重要误差：尽可能减少极重要误差(假敏感率假敏感率)MIC的分布的分布药代动力学和药效学药代动力学和药效学n n药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄n n药效学：药物对机体的作用n n时间依赖型（时间依赖型（TMICTMIC：-内酰胺类，大环内酯类内酰胺类，大环内酯类n n浓度依赖型（浓度依赖型（AUC/MICAUC/MIC比率：比率：AGS,FQAGS,FQn n这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案MIC与抑菌圈直径的线性关系与抑菌圈直径的线性关系耐药 中介 敏感RISLog2.MICD 1 d2 抑菌圈直径（mm)v抑菌圈直径与抑菌圈直径与MIC的关系的关系不同国家的不同国家的判定折点判定折点可能不同可能不同n n原因：n n用药剂量不同，服药的间隔不同用药剂量不同，服药的间隔不同n n评价敏感时较保守评价敏感时较保守n n更强调检测出耐药株（即特定的耐药群）更强调检测出耐药株（即特定的耐药群）n n技术因素：接种、培养基技术因素：接种、培养基在我国主要遵循在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（临床实验室标准化委员会（Clinical and Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSILaboratory Standards Institute,CLSI）制定的抗菌药）制定的抗菌药物选择原则。物选择原则。CLSI的简单介绍的简单介绍n nNCCLS NCCLS（The National Committee for clinical The National Committee for clinical laboratory Standardslaboratory Standards）n n美国临床实验室标准委员会美国临床实验室标准委员会n n已经被我国卫生部指定为部颁标准已经被我国卫生部指定为部颁标准n n每年有新版每年有新版n nCLSI CLSI （Clinical and Laboratory Standards InstituteClinical and Laboratory Standards Institute）n n美国临床实验室标准化研究所美国临床实验室标准化研究所n n 20122012年年CLSICLSI临床微生物检验标准及操作规范临床微生物检验标准及操作规范M100-SM100-S2020TablesTables：抗菌：抗菌药药物敏感性物敏感性试验试验的的实实施施标标准准M2-A10M2-A10：纸纸片片扩扩散法敏感性散法敏感性试验试验的的实实施施标标准准M07-A8M07-A8：需氧菌稀：需氧菌稀释释法敏感性法敏感性试验试验方法方法M11-A7:M11-A7:厌厌氧菌敏感性氧菌敏感性试验试验方法方法M47-A8:M47-A8:血培养的原血培养的原则则和步和步骤骤M35-A2:M35-A2:细细菌及酵母菌及酵母样样真菌的真菌的鉴鉴定方法定方法简简本本*M100 M100 每年更新一次每年更新一次每年更新一次每年更新一次*M2,M7*M2,M7 每三年更新一次每三年更新一次每三年更新一次每三年更新一次3判断折点特殊的耐药监测 标准菌株质控范围药物分组敏感性分类敏感性分类(CLSI的的定义定义)n n敏感（Susceptible）n n用常规用量治疗有效用常规用量治疗有效n n常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5MIC 5倍以上。倍以上。n n耐药（Resistance）n n用常规用量治疗不能抑制细菌的生长用常规用量治疗不能抑制细菌的生长n nMICMIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度高于药物在血、体液中可能达到的浓度敏感性分类（敏感性分类（2）n n中介(Intermediate)n nMIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株n n药物生理浓集部位有效药物生理浓集部位有效(尿尿-FQ)-FQ)n n加大用药剂量可能有效加大用药剂量可能有效n n缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误药敏试验的方法学药敏试验的方法学n n半定量纸片扩散法(抑菌圈直径)n nMIC法：n n稀释法稀释法(肉汤、琼脂肉汤、琼脂)n n自动化仪法自动化仪法n n抗生素连续梯度法抗生素连续梯度法(Etest)Etest)n n流式细胞仪流式细胞仪n n 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。n n抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的度，并与该药对测试菌的MICMIC呈负相关关系。呈负相关关系。纸片扩散法（纸片扩散法（Kirby-Bauer法）法）操作方法操作方法操作方法操作方法 ：1.1.将在约将在约5656恒温的无菌恒温的无菌M-HM-H琼脂倾注直径为琼脂倾注直径为90mm90mm的平板，其的平板，其厚度厚度4mm4mm。2.2.无菌挑取孵育无菌挑取孵育161624h24h的血平板上的血平板上4 4 5 5个菌落。个菌落。3.3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland McFarland No 0.5 No 0.5管。管。4.4.用无菌棉签浸入细用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转琼脂表面（每次转6060）使菌液均匀分）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘布，最后沿平板内缘涂抹一周。涂抹一周。5 5.平板置室温干燥平板置室温干燥3535分钟，用无菌镊子或纸片分配器分钟，用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于将抗菌纸片粘贴于M-HM-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中距离应大于能移动；各抗菌纸片中距离应大于24mm24mm，纸片距平板，纸片距平板内缘应大于内缘应大于15mm15mm。6.6.盖上平板的盖子，置盖上平板的盖子，置3535培养箱内孵育培养箱内孵育16181618小时后小时后阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育2424小小时。时。7.7.用游标卡尺或直尺量取用游标卡尺或直尺量取抑菌环直径，根据抑菌环直径，根据CLSICLSI标标准，报告细菌对该抗生素准，报告细菌对该抗生素 敏感敏感(susceptible,S)(susceptible,S)、耐药耐药(resistant,R)(resistant,R)、中介中介(intermediate,I)(intermediate,I)。2024/7/1625纸片扩散法影响因素纸片扩散法影响因素n nMICn n接种菌量n n细菌生长率n n抗生素含量、扩散性n n平皿厚度n n温度，预孵育时间2024/7/1626纸片扩散法标准化纸片扩散法标准化n nCLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)n n每年修订更改n n包括质控包括质控n n新药的判定标准新药的判定标准n n特殊耐药性的检测特殊耐药性的检测2024/7/1627CLSI的法规的法规n n规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控；n n规定常规测试报告的抗生素；n n不同的药判定标准不同；n n不同的菌判定标准也不同。2024/7/1628常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(1)肠杆菌科肠杆菌科 绿脓和绿脓和非肠杆菌科非肠杆菌科一一 级级氨苄西林氨苄西林头孢他啶，庆大霉素头孢他啶，庆大霉素头孢唑林，庆大霉素头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林替卡西林，哌拉西林二级二级阿米卡星阿米卡星 阿米卡星阿米卡星氨苄西林氨苄西林/舒巴坦舒巴坦头孢吡肟，头孢哌酮头孢吡肟，头孢哌酮 阿莫西林阿莫西林/克拉维酸克拉维酸氨曲南氨曲南头孢呋肟，头霉素头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南环丙沙星，亚胺培南头孢噻肟，头孢曲松头孢噻肟，头孢曲松替卡西林替卡西林/克拉维酸克拉维酸 环丙沙星，亚胺培南环丙沙星，亚胺培南妥布霉素，复方磺胺妥布霉素，复方磺胺 替卡西林，哌拉西林替卡西林，哌拉西林 三级三级氨曲南，头孢他啶氨曲南，头孢他啶头孢曲松头孢曲松卡那霉素，奈替米星卡那霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星氯霉素，奈替米星妥布霉素妥布霉素四环素，氯霉素四环素，氯霉素2024/7/1629常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(2)葡萄球菌肠球菌一级一级苯唑西林，青霉素苯唑西林，青霉素青霉素，氨苄西林青霉素，氨苄西林二级二级红霉素类红霉素类万古霉素万古霉素克林霉素，万古霉素克林霉素，万古霉素三级三级氯霉素氯霉素庆大霉素庆大霉素2024/7/1630常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(3)流感嗜血杆菌肺炎链球菌一级一级氨苄西林，青霉素氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素青霉素，红霉素复方磺胺复方磺胺 复方磺胺复方磺胺二级二级头孢呋肟，头孢噻肟头孢呋肟，头孢噻肟 氧氟沙星，四环氧氟沙星，四环素素头孢他啶，氯霉素头孢他啶，氯霉素万古霉素万古霉素三级三级阿奇霉素，头孢克罗阿奇霉素，头孢克罗 氯霉素，利福平氯霉素，利福平环丙沙星，亚胺培南环丙沙星，亚胺培南利福平，利福平，四环素四环素2024/7/1631预报用药预报用药(一一)测试药测试药菌名菌名推测其他药物的敏感推测其他药物的敏感性性n n 苯唑西林苯唑西林 葡萄球菌葡萄球菌所有所有-内酰胺类内酰胺类n n 四环素四环素所有（除葡所有（除葡多西环素，米诺环素多西环素，米诺环素萄球菌和不萄球菌和不动杆菌动杆菌n n红霉素红霉素GG球菌球菌罗红罗红霉素霉素，克拉，克拉霉素霉素，阿奇霉素阿奇霉素n n克林霉素克林霉素所有所有林可霉素林可霉素2024/7/1632预报用药预报用药(二二)测试药测试药菌名菌名推测其他药物的敏感推测其他药物的敏感性性n n氨苄西林氨苄西林肠球菌肠球菌青霉素青霉素n n青霉素青霉素GG葡萄球菌葡萄球菌氨苄氨苄西林西林，美洛，美洛西林西林 替卡替卡西林西林n n头孢噻吩头孢噻吩肠杆菌科肠杆菌科头孢头孢拉定，头孢氨苄拉定，头孢氨苄 头孢头孢克罗克罗n n奈啶酸奈啶酸肠杆菌科肠杆菌科所有所有氟喹诺酮类氟喹诺酮类n n万古霉素万古霉素所有所有替考拉宁替考拉宁n n以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。养后观察其最低抑菌浓度。n n稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法。养基者为肉汤稀释法。药敏试验药敏试验-稀释法稀释法常用抗菌药物容积稀释法步骤浓度（mg/mL）来源体积(mL)CAMHB(mL)最终浓度（mg/mL）15120储存液195122512步骤1112563512步骤1131284512步骤11764564步骤41132664步骤41316764步骤417888步骤711498步骤7132108步骤7171111步骤10110.5121步骤10130.25131步骤10170.125原理：聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时加入加入100l100l浓度为浓度为10105 5 CFU/ml CFU/ml的菌液，盖上盖板，的菌液，盖上盖板，3535161620h20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度，通过通过CLSICLSI标准判断其敏感和耐药。再取标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml0.01ml容量接种容量接种环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代培养，经培养，经3535过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死99.999.9原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)(MBC)。微量液体稀释法微量液体稀释法(microdilution test)操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解2.2.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素 100l100l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。3.3.挑选挑选1818 2424小时的菌落置小时的菌落置M-HM-H肉汤增菌肉汤增菌4 4 6 6小时。小时。4.4.制备制备0.50.5麦氏比浊管，然后麦氏比浊管，然后1:2001:200稀释，使之最终稀释，使之最终 浓度浓度10105 5 CFU/ml CFU/ml。5.5.用微量加样器接种用微量加样器接种100l100l 到到9696孔中，盖上盖板。孔中，盖上盖板。同时作阳性、阴性对照。同时作阳性、阴性对照。6.手工看浊度或仪器自动 判读。按照CLSI标准报 告细菌对某抗菌药物为 敏感、耐药和中介。阅读结果的正确光源阅读结果的正确光源细细 菌菌反射光反射光透射光透射光细细 菌菌反射光反射光透射光透射光肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌 肺炎链球菌肺炎链球菌(移去盖子移去盖子)铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌-、草绿色链、草绿色链(移去盖子移去盖子)不动杆菌属细菌不动杆菌属细菌 嗜血杆菌属嗜血杆菌属 伯克霍尔德菌伯克霍尔德菌 淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌(移去盖子移去盖子)葡萄球菌葡萄球菌 VANVAN、OXAOXA、LINLIN脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌(移去盖子移去盖子)肠球菌肠球菌 VANVAN弧菌属弧菌属 注：阅读葡萄球菌中应注意的纸片法药敏结果是任何有可见的菌落生长均应视作对VANVAN、OXAOXA、LINLIN抗菌药物耐药2024/7/1641肉汤稀释法肉汤稀释法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml 混 混清抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml，孵育35，1620h，判读。2024/7/1642琼脂稀释法琼脂稀释法 浓度 16 32 64 128 256 ug/ml 制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104/每个点，孵育，判读结果2024/7/1643肉汤稀释法肉汤稀释法n n调节离子浓度的MH肉汤n n宏量肉汤法（2ml,13x100mm）微量肉汤法（0.1ml,微量板）自动化仪n n优点：准确，可靠，可用于研究。n n缺点：n n劳动强度大劳动强度大n n细菌生长情况不可查细菌生长情况不可查2024/7/1644琼脂稀释法琼脂稀释法n n优点：金标准精确可靠n n可同时测定多株菌（40株）n n细菌生长情况可查n n缺点：n n测多个药时劳动强度大n n制备平皿费时费力E test 法法n nE E试条是一条试条是一条5mm50mm5mm50mm的无孔试剂载体，一面固的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度；菌药物，另一面有读数和判别的刻度；n n抗菌药物的梯度可覆盖有抗菌药物的梯度可覆盖有2020个个MICMIC对倍稀释浓度的对倍稀释浓度的宽度范围；宽度范围；n n将将E E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。操作方法：操作方法：1414步骤与纸片扩散法相同。步骤与纸片扩散法相同。5.5.用镊子将用镊子将E-TESTE-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表面，有刻度的一面向外，直径度的一面向外，直径140mm140mm的平板可放置的平板可放置6 6条，条，9mm9mm平板只能平板只能放置放置1 12 2试条试条 。6.6.孵育，置平板于孵育，置平板于3535孵育孵育161624h24h。7.7.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)(MIC)。2024/7/16wanghui-ART48E test 法法 细菌生长区E test 塑料条椭圆形细菌生长抑制区256128 8016判读抑菌浓度（MIC ug/ml)2024/7/1649E test 法法n n优点n n连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好n n影响因素少，稳定性高影响因素少，稳定性高n n操作简单，省时操作简单，省时n n缺点：昂贵n n用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，分枝杆菌2024/7/1650联合药物敏感试验联合药物敏感试验n n体外联合药物敏感试验的目的：n n扩大抗菌谱，治疗混合感染n n预防或推迟细菌耐药性的发生n n联合用药可以减少剂量景避免达到毒性剂量n n对某些耐药细菌引起的严重感染，联合用药比单一用药时效果更好。联合药物敏感试验联合药物敏感试验n n抗菌药物联合用药可出现4种结果：n n无关作用：两种药物联合作用的活性等于其单独活性。n n拮抗作用：两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性。n n累加作用：两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和。n n协同作用：两种药物联合作用显著大于其单独作用总和。联合药物敏感试验联合药物敏感试验n n棋盘稀释法是目前临床最常用的定量方法，利用肉汤稀释法的原理，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测是菌的MIC，根据所得MIC确定药物稀释度（一般为68个稀释度），药物最高稀释度为其MIC值的2倍，依次对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，接种菌量为5105cfu/ml,35孵育18 24小时后观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数。联合药物敏感试验联合药物敏感试验n nFIC指数=A药联合的MIC/A药单测MIC+B药联合的MIC/B药单测MIC。n n判断标准：n nFIC指数，0.5为协同作用；n n 0.5 1相加作用；n n 1 2 无关作用；n n 2拮抗作用厌氧菌体外药物敏感试验厌氧菌体外药物敏感试验n n由于厌氧菌感染多为内源性感染，厌氧菌对目前常用抗菌药物的敏感性较为稳定，加之厌氧菌培养要求特殊，临床试验室一般不做体外药敏试验。n n厌氧菌药敏试验指征：n n明确厌氧菌引起的严重感染，n n已确诊的厌氧菌感染经验治疗未能奏效，n n需长期用药的厌氧菌感染。厌氧菌体外药物敏感试验厌氧菌体外药物敏感试验n n厌氧菌体外药敏试验有琼脂稀释法、肉汤稀释法、E试验和内酰胺酶检测，其基本原理和方法与需氧菌相同，只是在培养基、操作环境和培养条件应根据厌氧菌的特定需求改变。n n厌氧菌培养的气体条件：80%N2、10%H2和10%CO2，还需要加入冷催化剂钯粒和亚甲蓝指示剂。厌氧菌体外药物敏感试验厌氧菌体外药物敏感试验n n厌氧菌体外药物敏感试验的条件