第二章抗原抗体反应--课件

第二章第二章 抗原抗体反应抗原抗体反应Antigen-Antibody Reaction抗原抗体反应（抗原抗体反应（antigen and antibody reactionantigen and antibody reaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。体内应。体内（invivoinvivo）、）、体外体外(invitro)(invitro)。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的作用；体外反应则根据抗原的物理性状、抗体的类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固类型及参与反应的介质（例如电解质、补体、固相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、相载体等）不同，可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。型。2024/7/162024/7/162 2第一节 抗原抗体反应的原理抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性。这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的。此外，还需要它们之间的紧密接触，才能有足够的结合力。2024/7/162024/7/163 3课件课件一、抗原抗体的结合力 有四种分子间引力参与并促进抗原抗体间的特异性结合：1静电引力（electrostatic forceelectrostatic force）2范登华引力（Vonder WaalsVonder Waals force force）3氢键结合力（hydrogen bonding forcehydrogen bonding force）4疏水作用力(hydrophobic(hydrophobic interactional interactional force force )2024/7/162024/7/164 4课件课件1静电引力（electrostatic force）是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。又称为库伦引力间相互吸引的力。又称为库伦引力（CoulombicCoulombic force force）。例如，一方分子上带碱性氨基酸（如赖氨酸）游离例如，一方分子上带碱性氨基酸（如赖氨酸）游离氨基氨基（NH3+NH3+），），和酸性氨基酸（如天门冬氨酸）游和酸性氨基酸（如天门冬氨酸）游离的羧基离的羧基（COOCOO），），可与另一方带相反电荷的对可与另一方带相反电荷的对应基团相互吸引。两者相互吸引可促进结合。应基团相互吸引。两者相互吸引可促进结合。这种引力的大小和两电荷间的距离的平方成反比。这种引力的大小和两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越强。两个电荷距离越近，静电引力越强。2024/7/162024/7/165 5课件课件2范德华引力（Vonder Waals force）是原子与原子、分子与分子互相接近时分子极化是原子与原子、分子与分子互相接近时分子极化作用发生的一种吸引力，是抗原与抗体两个大分作用发生的一种吸引力，是抗原与抗体两个大分子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力。云中的偶极摆动而产生吸引力。范德华引力的大小与两个相互作用的基团的极化范德华引力的大小与两个相互作用的基团的极化程度的乘积呈正比，与它们之间距离的程度的乘积呈正比，与它们之间距离的7 7次方呈反次方呈反比；比；分子构象的互补可以最大限度发挥该力的作用，分子构象的互补可以最大限度发挥该力的作用，引力更强，其能量小于静电引力。引力更强，其能量小于静电引力。2024/7/162024/7/166 6课件课件3氢键结合力（hydrogen bonding force）是供氢体上的氢原子与氢受体原子间的引力。如分子中的氢原子和电负性大的氮、氧等原子相互吸引的力。当具有亲水基团（如OH，NH2及COOH）的抗体与相对应的抗原彼此接近时，相互间即可形成氢键，使抗原与抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强。2024/7/162024/7/167 7课件课件4疏水作用力(hydrophobic interactional force)在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子排斥而趋向聚集而产生的力称为疏水作用力。当抗原表位与抗体超变区靠靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，使抗原抗体进一步相互吸引，从而促进其相互结合。疏水作用力是这些力中最强的。对维系抗原抗体结合作用最大。2024/7/162024/7/168 8课件课件二、抗原抗体的亲和性和亲合力亲和性（affinityaffinity）是指抗体分子上一个抗原结合点对应的抗原表位之间的结合强度，它取决于抗原抗体之间的空间构型的互补程度。它是抗原抗体之间固有的结合力。亲和性可用平衡常数K来表示：K=K1/K2 K K表示抗原抗体结合的稳定性和亲和力表示抗原抗体结合的稳定性和亲和力,K1,K1表示结合常数表示结合常数,K2,K2表示解离常数。表示解离常数。K K值越大，亲和性越高；亲和性越高，与抗值越大，亲和性越高；亲和性越高，与抗原结合越牢。原结合越牢。Ag+Ab AgAb2024/7/162024/7/169 9课件课件抗体的亲合力（avidity）是指一个完整抗体的抗原结合部位与抗原表位之间结合强度。与亲和性、抗体结合价、抗原的有效抗原表位数等有关。表现出多价优势，如IgG为两价，亲和力为单价的103倍，IgM为510价，亲和力为单价的107倍。2024/7/162024/7/161010课件课件三、亲水胶体转化为疏水胶体大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为亲水胶体溶液，不会发生自然沉淀，且均待负电荷。抗原抗体的结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。如再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。2024/7/162024/7/161111课件课件第二节 抗原抗体反应的特点 特异性 比例性 可逆性 阶段性2024/7/162024/7/161212课件课件一、特异性抗原抗体的特异性（specificity）是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两个分子之间空间结构的互补性决定的。不同的抗体超变区氨基酸残基的变异性使曹沟形状千变万化，只有与其结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。这种特异性如同钥匙和锁的关系。2024/7/162024/7/161313课件课件例如白喉抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外毒素结合。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测相应的抗体或抗原。但较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，皆可出现交叉反应。如，Weil-Felix reaction2024/7/162024/7/161414课件课件二、比例性比例性（proportionality）是指抗原抗体特异性时，生成结合物的量与反应物的浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见的反应。根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线（图13-1）。2024/7/162024/7/161515课件课件图图13-1 13-1 沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系2024/7/162024/7/161616课件课件三、可逆性抗原抗体反应遵循生物大分子热动力学反应原则，其反应式为：Ab-AgAbAg=k1/k2=k 式中各反应项的单位以式中各反应项的单位以molmol表示，表示，k1k1表示反应速度常数，表示反应速度常数，k2k2为逆反应速度常数，为逆反应速度常数，K K是反应平衡时的速度常数。由上是反应平衡时的速度常数。由上式可知，式可知，K K值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗值是反映抗原抗体间结合能力的指示，所以抗体亲和力通常以体亲和力通常以K K值表示。值表示。2024/7/162024/7/161717课件课件抗原与抗体结合形成复合物后，在一定条件下，抗原与抗体结合形成复合物后，在一定条件下，又可以解离为游离的抗原与抗体，这种特性称为又可以解离为游离的抗原与抗体，这种特性称为抗原抗体反应的可逆性抗原抗体反应的可逆性（renersibilityrenersibility）。抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，形抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合，形成的复合物是不牢固的，在一定条件下可以解离成的复合物是不牢固的，在一定条件下可以解离因此抗原抗体反应形成复合物的过程是一个动态因此抗原抗体反应形成复合物的过程是一个动态平衡。平衡。Ag+Ab AgAb 电解质、pH合适温度2024/7/162024/7/161818课件课件抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：是抗体对应抗原的亲和力；是环境因素对复合物的影响。2024/7/162024/7/161919课件课件 四、阶段性n n第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合的阶段。此。此阶段反应快，仅需数秒至数分钟，但不出现可见反阶段反应快，仅需数秒至数分钟，但不出现可见反应；应；第二为可见反应阶段第二为可见反应阶段。这一阶段抗原抗体复合物在。这一阶段抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、环境因素（如电解质、pHpH、温度、补体）的影响、温度、补体）的影响下，进一步交联和聚集，表现凝集、沉淀、溶解、下，进一步交联和聚集，表现凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶补体结合介导的生物现象等肉眼可见的反应。此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。实际上这两段反应慢，往往需要数分钟至数小时。实际上这两个阶段以严格区分，所需时间亦受多种因素和反应个阶段以严格区分，所需时间亦受多种因素和反应条件的影响，如反应开始时抗原抗体浓度较高，且条件的影响，如反应开始时抗原抗体浓度较高，且两者比例恰当，则很快能形成可见反应。两者比例恰当，则很快能形成可见反应。2024/7/162024/7/162020课件课件第三节 影响抗原抗体反应的因素抗原抗体自身的因素：抗原 抗体环境因素：电解质 酸碱度 温度 2024/7/162024/7/162121课件课件抗原抗体自身的因素2024/7/162024/7/162222课件课件（一）抗原抗原的理化性状、抗原表位种类和数目等均可影响抗原抗体反应的结果。例如，颗粒性抗原与相应的抗体反应后出现凝集现象；可溶性抗原与相应的抗体反应后出现沉淀现象；抗原单价抗原与相应抗体反应后不出现沉淀现象；血细胞与IgG类抗体反应不出现凝集现象。2024/7/162024/7/162323课件课件（二）抗体1.来源 不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。如家兔不同动物来源的免疫血清，其反应性存在差异。如家兔等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价带，与相应抗原结合等大多数动物的免疫血清，由于具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄，抗原不易出现可见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合物。而单克隆抗体一般不用于沉淀或足或过剩，均易形成可溶性复合物。而单克隆抗体一般不用于沉淀或凝集反应。凝集反应。2.浓度 抗体的浓度是相对于抗原而言的，二者浓度合适时才抗体的浓度是相对于抗原而言的，二者浓度合适时才易出现可见的反应结果，所以在试验前应先进行预试验，滴定抗原抗易出现可见的反应结果，所以在试验前应先进行预试验，滴定抗原抗体最佳反应浓度。体最佳反应浓度。3.特异性与亲和力 特异性与亲和力是影响抗原抗体反特异性与亲和力是影响抗原抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确度。试验试剂应尽可能应的关键因素，它们共同影响试验结果的准确度。试验试剂应尽可能选择高特异性、高亲和力的抗体，以保证试验的可靠性。选择高特异性、高亲和力的抗体，以保证试验的可靠性。2024/7/162024/7/162424课件课件环境条件2024/7/162024/7/162525课件课件（一）电解质抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中须有中须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集，形成大块的凝集或沉淀。集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用凝集物的形成，常用0.850.85氯化钠或各种缓冲液作抗原及氯化钠或各种缓冲液作抗原及抗体的稀释液及反应液。由于氯化钠在水溶液中解离成抗体的稀释液及反应液。由于氯化钠在水溶液中解离成NaNa+和和C1C1，可分别中和复合物上羧基和氨基的电荷，使，可分别中和复合物上羧基和氨基的电荷，使复合物的颗粒的电荷下降，有利于复合物间相互聚集，形复合物的颗粒的电荷下降，有利于复合物间相互聚集，形成大块的复合物。成大块的复合物。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。2024/7/162024/7/162626课件课件（二）酸碱度蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，PH过高或过低都将影响抗原与抗体的理化性质。抗原抗体反应一般在pH为68进行。例如当pH达到或接近颗粒性抗原的等电点时，即使无相应抗体存在，也会引起抗原非特异性的凝集（自凝），造成假阳性反应。2024/7/162024/7/162727课件课件（三）温度抗原抗体反应必须在合适的温度中进行。一般以一般以15154040为宜，最佳反应温度为为宜，最佳反应温度为3737，在此范围内，在此范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。但若温度高于反应加速。但若温度高于5656时，可导致已结合的抗原抗时，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏；温度越低，结合速度越慢，体再解离，甚至变性或破坏；温度越低，结合速度越慢，但结合牢固，更易于观察。某些特殊的抗原抗体反应，对但结合牢固，更易于观察。某些特殊的抗原抗体反应，对温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在温度有一些特殊的要求，例如冷凝集素在4 4左右与红细左右与红细胞结合最好，胞结合最好，2020以上反而解离。以上反而解离。2024/7/162024/7/162828课件课件此外，适当振荡和搅拌也能促进抗原抗体分子的接触，加速反应，其作用于反应物粒子大小成正比。2024/7/162024/7/162929课件课件对照的设置抗原抗体反应的影响因素较多，因此应十分注意实验条件的选择和稳定化，必须严格设置好试验对照。对照是实验质量控制的手段之一,目的在于消除无关变量对实验结果的影响。对照一般分为：（1）阳性对照、（2）阴性对照、（3）空白对照、（4）标准对照2024/7/162024/7/163030课件课件1.阳性对照阳性对照(positive control)：阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种免疫学实验模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血清各种免疫学实验模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血清较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified(recalcified human human plasma)plasma)为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。2024/7/162024/7/163131课件课件阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测国外检测HBsAgHBsAg的的ELISAELISA试剂盒检测敏感度约为试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为，阳性对照品中含量约为10ng/ml10ng/ml。在。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。2024/7/162024/7/163232课件课件2.阴性对照阴性对照(negative control)：阴性对照品的基本组成除了不含待测物质（抗原或抗体）以外，其余成分应尽量与检测标本的组成相一致。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAgHBsAg检测检测的阴性对照品中不可含的阴性对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。免疫学实验也是阴性。免疫学实验一般要求同时设置阴性对照一般要求同时设置阴性对照2323份。份。2024/7/162024/7/163333课件课件3.空白对照空白对照(blank control):指不做任何实验处理的对照组。空白对照能明白地对比和衬托出实验组的变化和结果,增加说服力。2024/7/162024/7/163434课件课件标准品对照标准品对照（standard control)：在定量测定的免疫学实验中，标准品的设置是能够定量的基础。实验应含有制作标准曲线用的(参考)标准品，一般包括覆盖可检测范围的4-5个浓度。2024/7/162024/7/163535课件课件第四节 抗原抗体反应的类型随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫学实验方法的基础上，新的免疫学测定方法不断出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更稳定。目前根据抗原和抗体性质的不同和反应条件的差别，抗原抗体反应出现的现象和结果不同，以及反应时参与的其他条件不同，可将抗原抗体反应分为五种类型：2024/7/162024/7/163636课件课件表表13-1 13-1 抗原抗体反应的基本类型抗原抗体反应的基本类型反应类型实验技术检 测 方 法敏感度沉淀反应液相沉淀试验琼脂凝胶扩散凝胶电泳技术观察沉淀、检测浊度观察扫描沉淀线或环观察扫描沉淀峰、弧等+,+凝集反应直接凝集试验间接凝集试验凝集抑制试验协同凝集试验抗球蛋白试验用裸眼、放大镜或显微镜观察红细胞或胶乳等颗粒的凝集现象同上同上同上同上+补体参与的反应补体溶血试验补体结合试验以裸眼或光电比色仪观察测定溶血现象同上+中和反应病毒中和试验毒素中和试验病毒感染性丧失外毒素毒性丧失+免疫标记荧光免疫技术放射免疫技术酶标免疫技术发光免疫技术生物素-亲和素技术金标免疫技术检测荧光现象检测放射性强度检测酶底物显色、发光、荧光等测定发光强度结合其他标记技术检测金颗粒沉淀+2024/7/162024/7/163737课件课件