第二章动物细胞培养课件

第二章第二章 动物细胞培养动物细胞培养Hela细胞株细胞株人正常胎肝细胞系人正常胎肝细胞系.动物细胞培养的发展历史动物细胞培养的发展历史18591859年年,法国解剖学家法国解剖学家ValpianValpian最早尝试了最早尝试了蛙胚尾部组织的体外培养蛙胚尾部组织的体外培养.1885年，年，Wilhelm Roux把鸡胚的神经把鸡胚的神经板在温热的盐水中维持其存活若干天；板在温热的盐水中维持其存活若干天；1906年，年，Beebe和和Ewing在动物的血液在动物的血液中尝试培养了传染性狗淋巴肉瘤的细胞；中尝试培养了传染性狗淋巴肉瘤的细胞；1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞；养蛙胚神经组织细胞；20世纪初，世纪初，Carrel将外科手术的无菌操将外科手术的无菌操作观念带到了体外培养的实验之中。作观念带到了体外培养的实验之中。.Ross Granville Harrison 18701959,American biologist and anatomist,b.Germantown,Pa.,Ph.D.Johns Hopkins,1894.He went to Yale as professor of comparative anatomy in 1907 and held various honorary positions there until his death.He is known for his work on nerve development in the embryo and on nerve regeneration as well as for his discovery of a method of tissue culture that permits study of isolated living cells in a controlled environment.HarrisonHarrison：组织培养之父：组织培养之父.The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1912in recognition of his work on vascular suture and the transplantation of blood vessels and organsAlexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York,NY,USA b.1873d.1944.动物细胞培养中的常用术语动物细胞培养中的常用术语v细胞培养；组织培养；器官培养细胞培养；组织培养；器官培养v原代培养；传代培养；代原代培养；传代培养；代v细胞系；细胞株细胞系；细胞株v有限细胞系；无限细胞系有限细胞系；无限细胞系v体外转化；体外恶性转化体外转化；体外恶性转化v细胞分裂指数；克隆形成率细胞分裂指数；克隆形成率.第一节第一节 细胞培养需要具备的基本条件细胞培养需要具备的基本条件体外培养细胞的基本特征体外培养细胞的基本特征影响细胞体外培养的理化因素影响细胞体外培养的理化因素细胞培养实验室的设置设备细胞培养实验室的设置设备器具的清洗与无菌操作器具的清洗与无菌操作.（一）体外培养细胞的分型（一）体外培养细胞的分型.贴附型：贴附型：一、体外培养细胞的基本特性一、体外培养细胞的基本特性2.2.悬浮型：悬浮型：成纤维型细胞成纤维型细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞按照体外培养细胞的形态，可以分为：按照体外培养细胞的形态，可以分为：.1.粘附型粘附型成纤维型细胞成纤维型细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞.2.2.悬浮型：悬浮型：形态？形态？来源？来源？生长特点？生长特点？.（二）体外培养细胞的超微结构（二）体外培养细胞的超微结构v细胞外被：细胞外被：糖蛋白膜，利于细胞贴壁。糖蛋白膜，利于细胞贴壁。一、体外培养细胞的基本特性一、体外培养细胞的基本特性v 细胞骨架：细胞骨架：正常细胞微丝微管走行有一定正常细胞微丝微管走行有一定 方向性，转化后行走紊乱。方向性，转化后行走紊乱。v 细胞核：细胞核：与体内正常细胞差不多。与体内正常细胞差不多。v 细胞器：细胞器：线粒体、内质网、高尔基体等线粒体、内质网、高尔基体等 多集中在细胞核周围。多集中在细胞核周围。.（三）体外培养细胞的生长和增殖特性（三）体外培养细胞的生长和增殖特性 一、体外培养细胞的基本特性一、体外培养细胞的基本特性增殖态增殖态:指细胞增殖的状态和过程指细胞增殖的状态和过程功能态功能态:细胞处于执行特定功能活动（如分泌、细胞处于执行特定功能活动（如分泌、传导、吞噬、收缩等）时期的状态传导、吞噬、收缩等）时期的状态1.培养细胞的增殖态和功能态培养细胞的增殖态和功能态.一、体外培养细胞的基本特性一、体外培养细胞的基本特性（三）体外培养细胞的生长和增殖特性（三）体外培养细胞的生长和增殖特性 2.培养细胞生命期培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）细胞在培养中持续增殖和生长的时间，细胞在培养中持续增殖和生长的时间，通常以体外最终可以传代的次数表示。通常以体外最终可以传代的次数表示。.原代培养期：原代培养期：传代期：传代期：衰退期：衰退期：正常细胞生正常细胞生命期大致经命期大致经历历3个阶段个阶段.可见细胞分裂，但不旺盛可见细胞分裂，但不旺盛原代培养期细胞原代培养期细胞的主要特点：的主要特点：细胞群是异质的（细胞群是异质的（Heterogeneous）细胞克隆形成率细胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低很低初代培养细胞多呈二倍体核型初代培养细胞多呈二倍体核型是检测药物很好的实验对象是检测药物很好的实验对象.持续时间长持续时间长传代培养期细胞传代培养期细胞的主要特点：的主要特点：需早期冻存需早期冻存 细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型.细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；衰退培养期细胞衰退培养期细胞的主要特点：的主要特点：细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。.注注:细胞永生性和恶性性非同一性状。细胞永生性和恶性性非同一性状。无限细无限细胞系胞系或或连续细连续细胞系胞系.3.3.每代贴附生长细胞的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：潜伏期潜伏期指数增生期指数增生期平顶期平顶期.潜伏期的潜伏期的特点特点细胞由游离逐渐贴附细胞由游离逐渐贴附细胞可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相细胞可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期志细胞已进入指数增生期.细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程如细胞种类、支持物、促贴附物质相关的过程如细胞种类、支持物、促贴附物质等。等。.潜伏期出现潜伏期出现的原因？的原因？影响潜伏期影响潜伏期长短的因素？长短的因素？.是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段指数增生期指数增生期特点特点细胞群体均一，是理想的实验用细胞细胞群体均一，是理想的实验用细胞培养物中细胞数量呈指数增长培养物中细胞数量呈指数增长.接触抑制？接触抑制？肿瘤细胞接触抑制消失肿瘤细胞接触抑制消失.停滞期停滞期特点特点细胞数量达细胞数量达饱和密度饱和密度，出现密度抑制，出现密度抑制细胞活动小细胞活动小,细胞膜的活动小细胞膜的活动小生长组分下降生长组分下降:010%及时传代：及时传代：.（四）体内外细胞的差异（四）体内外细胞的差异一、体外培养细胞的基本特性一、体外培养细胞的基本特性1.形态的差异：形态的差异：细胞体外培养形态，细胞体外培养形态，难以完全反应体内情况。难以完全反应体内情况。2.分化的差异：分化的差异：体内细胞听命于外源信号，体内细胞听命于外源信号，体外细胞信号来源切断，出现体外细胞信号来源切断，出现 特定基因分化表达减弱或停止。特定基因分化表达减弱或停止。.无菌、无毒：无菌、无毒：体外培养细胞的首要条件。体外培养细胞的首要条件。二、影响细胞培养的理化因素二、影响细胞培养的理化因素 支持物：支持物：表面理化性质，细胞与其接触的机会表面理化性质，细胞与其接触的机会 和亲和性等。和亲和性等。营养条件：营养条件：葡萄糖；氨基酸与蛋白质；维生素葡萄糖；氨基酸与蛋白质；维生素 与生物活性因子等与生物活性因子等 渗透压：渗透压：260-320 mmol/l水：水：三蒸水或超纯水，存放时间一般不超过三蒸水或超纯水，存放时间一般不超过2周周 气体：气体：氧，二氧化碳氧，二氧化碳 pH：7.2-7.4 温度温度：哺乳动物细胞：哺乳动物细胞370.5.动物细胞动物细胞培养实验室的培养实验室的设置设备设置设备.风淋室风淋室 传递窗传递窗.CO2 培养箱培养箱.倒置显微镜倒置显微镜.大容量高压灭菌器大容量高压灭菌器.全自动三重纯水蒸馏器全自动三重纯水蒸馏器.超纯水装置超纯水装置.滤 器ZeissZeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌均采用滤过法除菌.酶标仪酶标仪 微孔板震荡器微孔板震荡器.液氮罐液氮罐.移液器移液器.四、器具的清洁与无菌操作四、器具的清洁与无菌操作(一一)常用器具的清洗常用器具的清洗1.1.玻璃器皿玻璃器皿 清水浸泡清水浸泡 软毛刷沾洗涤剂刷洗软毛刷沾洗涤剂刷洗 自来水冲洗自来水冲洗 晾干晾干 酸液浸泡酸液浸泡过夜过夜 自来水冲洗自来水冲洗1010次以上次以上 三蒸三蒸水漂洗三次水漂洗三次 烘干备用烘干备用.酸液的配制酸液的配制.2.塑料及橡胶制品塑料及橡胶制品清水浸泡清水浸泡 2%NaOH浸泡过夜浸泡过夜 自自来水冲洗来水冲洗 5%稀盐酸浸泡稀盐酸浸泡30分钟分钟 自来水冲洗自来水冲洗10次以上次以上 三蒸水漂洗三蒸水漂洗3次次 晾干备用晾干备用.3.金属制品的清洗金属制品的清洗 毛刷沾洗净剂刷洗或毛刷沾洗净剂刷洗或75%酒精擦洗酒精擦洗 自自来水反复冲洗来水反复冲洗 三蒸水漂洗三蒸水漂洗3次次 烘烘干备用干备用.无菌室与工作台消毒无菌室与工作台消毒(二二)器具的灭菌与消毒器具的灭菌与消毒金属器械、橡胶和塑料制品的消毒金属器械、橡胶和塑料制品的消毒玻璃器皿消毒玻璃器皿消毒.第二节第二节 培养基及各种细胞培养用液培养基及各种细胞培养用液培养液培养液细胞培养其他常用液细胞培养其他常用液 消化液消化液 pH调整液调整液 抗生素液抗生素液天然培养液天然培养液人工合成培养液人工合成培养液无血清培养液无血清培养液平衡盐溶液平衡盐溶液.1.平衡盐溶液（平衡盐溶液（BSS）同时具备同时具备缓冲液的缓冲能力缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性生理盐水的等渗性以及以及培养液的培养液的营养供应营养供应等特点。等特点。.血清、水解乳蛋白、胚胎浸出液、血清、水解乳蛋白、胚胎浸出液、组织液、淋巴液和血浆等组织液、淋巴液和血浆等血清种类血清种类血清质量判定标准血清质量判定标准血清中所含的大体成分血清中所含的大体成分2.天然培养基天然培养基.血清中所含大体成分血清中所含大体成分v多种蛋白质（白蛋白，球蛋白，铁蛋白多种蛋白质（白蛋白，球蛋白，铁蛋白 及转移蛋白等）及转移蛋白等）v多种金属离子多种金属离子v激素激素v促贴附物质促贴附物质v各种生长因子各种生长因子v不明成分不明成分血清的优缺点血清的优缺点血清的使用方法血清的使用方法.3.3.人工合成培养基：人工合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟物质的种类和数量，用人工方法模拟而成。而成。.几种常用合成培养基几种常用合成培养基MEMMEM：低限量低限量EagleEagle培养基培养基Mccoys 5A：原代培养、难以培养的细胞原代培养、难以培养的细胞M199、109培养基：培养基：Morgan研制成功研制成功F12：具有十分复杂的组分，适合进行单细胞培养和克隆化培养具有十分复杂的组分，适合进行单细胞培养和克隆化培养RPMI1640：Moor等研制成功，悬浮、肿瘤、原代、传代等细胞等研制成功，悬浮、肿瘤、原代、传代等细胞DMEM：Dulbeccos Modified Eagle Medium，贴壁细胞，贴壁细胞常用细胞常用细胞系培养基系培养基的的选择？选择？.天然培养基与人工合成培养基的比较天然培养基与人工合成培养基的比较培养基类型培养基类型优点优点缺点缺点天然培养基天然培养基营养成分丰富，营养成分丰富，培养效果好培养效果好来源受限，成分复杂，来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物影响对某些实验产物的提取和实验结果的的提取和实验结果的分析，易发生分析，易发生支原体污染支原体污染人工合成人工合成培养基培养基标准化生产，组标准化生产，组成和含量相对固成和含量相对固定，成本低定，成本低缺少某些成分，不能缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生完全满足体外细胞生长需要长需要.4.4.无血清培养基无血清培养基基本培养基基本培养基+替代血清的补充成分替代血清的补充成分.v胰蛋白酶液胰蛋白酶液:牛胰脏中提取的黄白色粉末，牛胰脏中提取的黄白色粉末，作用强烈，对细胞伤害大。作用强烈，对细胞伤害大。vEDTA液液:通过鏊合钙离子等，改变细胞间通过鏊合钙离子等，改变细胞间的连接，使组织或细胞分散成单个细胞的连接，使组织或细胞分散成单个细胞 v胶原酶液：胶原酶液：细菌中提取，作用温和。细菌中提取，作用温和。5.消化液消化液.表表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项项 目目 胰蛋白酶胰蛋白酶 胶原酶胶原酶消化特性组织消化特性组织 适用于消化软组织适用于消化软组织 适用于消化纤维多的适用于消化纤维多的用用 量量 0.01%0.5%0.1 0.3mg/ml 消化时间消化时间 0.52小时（小块）小时（小块）112小小pH 89 6.57.0作用强度作用强度 强烈强烈 缓和缓和细胞影响细胞影响 时间过长有影响时间过长有影响 无大影响无大影响血清钙镁离子血清钙镁离子 有影响有影响 无影响无影响.6.pH调整液调整液vNaCO3溶液：常用浓度有溶液：常用浓度有7.4%，5.6%和和3.7%三种三种vHepes液：羟乙基哌嗪乙璜酸，氢液：羟乙基哌嗪乙璜酸，氢离子缓冲剂离子缓冲剂.第三节第三节 原代及传代细胞培养原代及传代细胞培养一、一、原代培养原代培养 也称初代培养，是从供体取得组织细也称初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外生长环境中持续培养，中途不胞后在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养细胞的培养过程。分割培养细胞的培养过程。组织块培养法组织块培养法离散细胞培养法离散细胞培养法.鼠鼠胚胚组组织织取取材材.鸡鸭鸟类胚胎组织取材鸡鸭鸟类胚胎组织取材.组组织织块块培培养养法法.分分散散细细胞胞培培养养法法.机机械械分分散散法法.方法方法:计数板的准备计数板的准备 染色染色 加悬液加悬液 镜检镜检细胞计数细胞计数.动动物物细细胞胞原原代代培培养养过过程程图图 思考：传代前为何要换液？怎样判断污染？思考：传代前为何要换液？怎样判断污染？.组织块培养结果组织块培养结果.离散细胞培养结果离散细胞培养结果.根据细胞生长的特点，传代方法有根据细胞生长的特点，传代方法有3 3种：种：悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心法传代：直接传代法：直接传代法：半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（HelaHela细胞）细胞）贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.250.25的的胰蛋白酶液。胰蛋白酶液。二、传代培养二、传代培养.三、细胞系或细胞株的命名和建系三、细胞系或细胞株的命名和建系 HeLaHeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）NIH3T3：美国国立卫生研究院（：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每）建立；每3天传一代，每次接种天传一代，每次接种3105细胞毫升。细胞毫升。CHO：中国地鼠卵巢细胞（中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，宫颈癌上皮细胞，1974年年3月建立月建立 细胞的命名无严格统一规定，大多采用细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义的缩写字或代号表示。有一定意义的缩写字或代号表示。.四、体外培养细胞的纯化四、体外培养细胞的纯化悬浮细胞纯化悬浮细胞纯化：贴壁细胞纯化贴壁细胞纯化：密度梯度离心密度梯度离心 含固化抗体的细胞分离柱含固化抗体的细胞分离柱依据贴壁速度不同依据贴壁速度不同 依据对消化酶敏感性不同依据对消化酶敏感性不同.第四节第四节 培养细胞的常规检测培养细胞的常规检测微生物污染的检测与排除微生物污染的检测与排除生长与增殖特性的检测生长与增殖特性的检测 细胞形态观察细胞形态观察.一、微生物的检测与排除一、微生物的检测与排除（一）微生物污染的途径及预防（一）微生物污染的途径及预防微生物污染的途径有哪些？微生物污染的途径有哪些？对细胞培养实验有何启示？对细胞培养实验有何启示？.1.1.真菌污染的检测：真菌污染的检测：显微镜观察显微镜观察（二）微生物污染的检测（二）微生物污染的检测.2.细菌污染的检测细菌污染的检测肉眼观察培养液是否混浊肉眼观察培养液是否混浊,颜色是否变黄颜色是否变黄显微镜下观察是否有菌体显微镜下观察是否有菌体取培养液进行细菌培养是否出现菌落取培养液进行细菌培养是否出现菌落.3.支原体污染的检测支原体污染的检测v高倍相差显微镜检测高倍相差显微镜检测v地衣红染色法检测地衣红染色法检测v荧光法检测荧光法检测v电子显微镜检测电子显微镜检测.3.支原体污染的检测支原体污染的检测支原体电镜照片支原体电镜照片,煎蛋状煎蛋状荧光染色荧光染色.细胞病变效应检测细胞病变效应检测正常的正常的BHK-21细胞细胞 BHK-21细胞病变图细胞病变图 4.病毒污染的检测病毒污染的检测.4.病毒污染的检测病毒污染的检测血血细细胞胞吸吸附附检检测测.4.病毒污染的检测病毒污染的检测v细胞病变效应检测细胞病变效应检测vPCR检测检测v免疫学方法检测免疫学方法检测v血细胞吸附检测血细胞吸附检测v电子显微镜检测电子显微镜检测.（三）微生物污染的排除（三）微生物污染的排除v抗生素抗生素v加温法加温法v巨噬细胞吞噬法巨噬细胞吞噬法v动物体内接种法动物体内接种法.二、细胞形态观察二、细胞形态观察v光学显微镜：光学显微镜：细胞形状、细胞大细胞形状、细胞大小、核质比、核仁大小及多少等小、核质比、核仁大小及多少等v电子显微镜：电子显微镜：微绒毛、桥粒、微微绒毛、桥粒、微管微丝、核仁的形态及数量等管微丝、核仁的形态及数量等.三、生长增殖特性的检测三、生长增殖特性的检测生长曲线：细胞生长曲线：细胞群体倍增时间群体倍增时间有丝分裂指数有丝分裂指数(MI)：MTT法：法：标记核苷酸标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：掺入量：克隆形成率：克隆形成率：.第五节第五节 无限细胞系的建立无限细胞系的建立v癌细胞体外培养的特性癌细胞体外培养的特性 v肿瘤细胞的建系方法肿瘤细胞的建系方法.一、癌细胞体外培养特性一、癌细胞体外培养特性v癌细胞形态特征：癌细胞形态特征：核质比增大，核仁核质比增大，核仁增大增多，核糖体颗粒丰富增大增多，核糖体颗粒丰富v癌细胞的遗传特性：癌细胞的遗传特性：异倍体或多倍体异倍体或多倍体核型，染色体片段的移位与缺失，癌基核型，染色体片段的移位与缺失，癌基因特异表达等因特异表达等v癌细胞的浸润性：癌细胞的浸润性：v癌细胞的生长特性：癌细胞的生长特性：永生性，血清依永生性，血清依赖小，克隆形成率高赖小，克隆形成率高.v体内癌细胞的原代培养：如体内癌细胞的原代培养：如Hela细胞株细胞株v体外培养细胞的转化：如体外培养细胞的转化：如PK细胞株，细胞株，IB细胞株等细胞株等二、肿瘤细胞的建系方法二、肿瘤细胞的建系方法.二、肿瘤细胞的建系方法二、肿瘤细胞的建系方法v取材：取材：尽量取瘤组织边缘材料尽量取瘤组织边缘材料v培养方式：培养方式：与正常二倍体细胞培养相同与正常二倍体细胞培养相同v培养基：培养基：对培养基的要求不严格对培养基的要求不严格v适宜底物：适宜底物：改善贴壁条件会有好效果改善贴壁条件会有好效果v成纤维细胞的排除：成纤维细胞的排除：机械刮除法，反复机械刮除法，反复贴壁法，消化排除法，密度梯度离心法贴壁法，消化排除法，密度梯度离心法1.体内癌细胞的原代培养体内癌细胞的原代培养.v诱发转化：诱发转化：诱导诱导DNA结构发生稳定性结构发生稳定性突变。有化学法、物理法、生物法突变。有化学法、物理法、生物法 v自发转化：自发转化：原因不明原因不明二、肿瘤细胞的建系方法二、肿瘤细胞的建系方法2.体外培养细胞的转化体外培养细胞的转化.细胞转化的检测细胞转化的检测培养细胞的一般特征：培养细胞的一般特征：培养细胞的一般特征：培养细胞的一般特征：细胞形态、生长速细胞形态、生长速度、倍增时间、克隆形成率、血清依赖性、度、倍增时间、克隆形成率、血清依赖性、表面抗原和接触抑制等表面抗原和接触抑制等培养细胞的遗传学特征：培养细胞的遗传学特征：培养细胞的遗传学特征：培养细胞的遗传学特征：核型分析和染色体核型分析和染色体畸变等畸变等恶性测试：恶性测试：恶性测试：恶性测试：软琼脂培养、浸润性检测和异体软琼脂培养、浸润性检测和异体动物接种检测动物接种检测2.体外培养细胞的转化体外培养细胞的转化.第六节第六节 动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用v活细胞的生物学特性研究活细胞的生物学特性研究v疫苗制备疫苗制备v生物活性因子的制备生物活性因子的制备v单克隆抗体单克隆抗体v药物检测药物检测v组织工程组织工程.小结：小结：1.理解体外培养细胞的基本特性：理解体外培养细胞的基本特性：即分型、生命期及一代生长增殖过程。2.掌握动物细胞培养的常规操作技术：掌握动物细胞培养的常规操作技术：包括器皿的清洗、各种培养用液的用途及制备方法、原代和传代细胞培养及常规检测。3.掌握癌细胞体外培养特性及细胞转化的检测掌握癌细胞体外培养特性及细胞转化的检测4.了解动物细胞培养技术的应用；了解动物细胞培养技术的应用；.睡醒了吗？-谢谢各位!.