第七章植物细胞和次生物质生产详解课件

第七章第七章 植物细胞培养及次生物质生产植物细胞培养及次生物质生产植物的单细胞培养植物细胞的悬浮培养植物细胞的大规模培养和次生物质生产一、植物单细胞培养定义植物细胞培养（plant cell culture）：是指在离体条件下对植物单细胞或小的细胞团进行培养使其增值培养形成单细胞无性系或再生植株的技术。目的及意义 进行细胞代谢研究 用于突变体的筛选、遗传转化 次生代谢物质的生产（一）单细胞的分离有完整的植物器官分离单细胞有培养的组织分离单细胞1、由植物完整的器官分离单细胞 叶片是最好的材料机械法酶解法1.1机械法用刀片刮叶片（二）单细胞的培养培养方法主要有：平板培养法（plating culture）看护培养法（nurse culture）微室培养法（micro-chamber culture）条件培养法（conditioned culture）平板培养技术二、植物细胞的悬浮培养（一）定义：细胞悬浮培养（cell suspension culture）：指将游离的细胞或细胞团按照一定的细胞浓度悬浮在细胞培养基中进行培养的方法。（二）特点1、细胞可以不断增值，形成高密度的细胞群 体，适于大规模培养2、能够提供大量的较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。（三）成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。1悬浮培养体系的建立 材料材料愈伤组织愈伤组织外植体：幼苗、胚轴、子叶。外植体：幼苗、胚轴、子叶。例如：新疆紫草愈伤组织的诱导种子 消毒 萌发 根、胚轴、子叶（作为外植体）接种到含2.4-D和KT的MS培养基上诱导愈伤组织。筛选方法 愈伤组织外观为大小均一大小均一的小颗粒，疏疏松易碎、外观湿润松易碎、外观湿润、，细胞色泽呈鲜艳鲜艳的乳白或淡黄色。的乳白或淡黄色。挑出愈伤组织培养于高有机质、高激素、低糖的培养基中培养，诱导出更多得到愈伤组织。悬浮培养挑选的愈伤组织于液体培养基（2克入40ml）120r/min，25，弱光下培养23d 依次用500um、100um的尼龙膜过滤 均匀的悬浮体系培养物悬浮培养体系建立2、悬浮细胞增值的衡量标准细胞鲜重（细胞真空去掉多余水分的重量）细胞干重（细胞收集80干燥至恒重的重量）细胞密实体积（细胞悬浮液离心后的体积，以每ml培养液中细胞总体积所占的ml数表示）细胞计数（血细胞计数板计算）3、培养细胞的同步化（周期同步化）定义：指的是同一悬浮体系中所有的细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。目的：使同一体系中细胞能保持相对一致的细胞学和生理学性质。细胞周期同步化方法分选法低温处理饥饿法抑制剂法4、悬浮培养的方式分批培养连续培养（1）分批培养：）分批培养：指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行培养的技术。即将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养的技术。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止即行停止。分批培养的特点 如如果果使使处处在在静静止止期期的的细细胞胞悬悬浮浮液液保保存存时时间间太太长长，则则会会引引起起细细胞胞的的大大量量死死亡亡和和解解体体。因因此此，当当细细胞胞悬悬浮浮液液达达到到最最大大干干重重产产量量之之后后，即即在在刚刚进进入入静静止止期的时候，须尽快进行继代。期的时候，须尽快进行继代。（2）连续培养）连续培养指在培养过程中，不断注入新鲜培养基，指在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排掉用过的培养基，保持培养物的容积恒排掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养液中的营养物质得到不断补充。定，使培养液中的营养物质得到不断补充。类型分为类型分为封闭型封闭型和和开放型开放型两种两种加入培养基加入培养基排出培养基及其培养物排出培养基及其培养物连续培养图示：连续培养图示：排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，进出数量保持平衡。进出数量保持平衡。封闭型连续培养的特点封闭型连续培养的特点 悬浮在悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来排出液中的细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到培养系统中。之后，又被放回到培养系统中。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液及其中细胞的容积相等。及其中细胞的容积相等。开放型连续培养的特点开放型连续培养的特点 培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的恒定水平上恒定水平上（通过调节流入和流出的速度）（通过调节流入和流出的速度）。三、植物细胞大规模培养和次生物质生产（一）、植物产生的代谢物质1、类型 初生代谢物：淀粉、糖类、蛋白质等 次生代谢物：酚类化合物、黄酮类、生物碱、帖类、皂苷等。2、植物次生代谢产物在医药、食品、轻化 工业等领域具有重要意义 例如：麻醉药物：莨菪碱健身药品：人参皂苷、人参三醇心血管系统方面：芸香苷、槲皮素天然色素：叶黄素、类胡萝卜素香水香料类：挥发油3、植物细胞大规模培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境 提高生产效率 发展新型生物技术产业植物次生代谢产物市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病1820（美国）阿吗灵循环系统障碍药525（全世界）奎宁治疗疟疾510（美国）毛地黄心脏病药2035（美国）（二）大规模培养技术建立三步骤：（二）大规模培养技术建立三步骤：高产细胞株的建立和筛选高产细胞株的建立和筛选高产细胞株的增值培养高产细胞株的增值培养大规模培养体系建立大规模培养体系建立（三）适合工业生产细胞株的筛选指标：（三）适合工业生产细胞株的筛选指标：1）分散性好，适合大规模悬浮培养2）均一性好，细胞大小，生理状态一致3）生长速度快，培养周期短4）目标产物含量高，容易分离5）细胞遗传稳定性好生产瓶颈生产瓶颈（四）、植物细胞大规模培养系统 用培养瓶在摇床上培养培养方式 用生物反应器大规模培养 搅拌式生物反应器常用的生物反应器 气升式生物反应器 旋转式生物反应器通气搅拌罐式生物反应器通气搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器气升式生物反应器发酵罐