第八章微生物的遗传和变异课件

第八章微生物的遗传变异第八章微生物的遗传变异第一节 遗传变异的物质根底第二节 基因突变和诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程第五节 菌种的衰退、复壮和保藏内容提要内容提要 亲代的性亲代的性状在子代表现出来，使子代与亲代亲代的性亲代的性状在子代表现出来，使子代与亲代有相似的现象，叫遗传。从分子水平上讲，遗传就是遗有相似的现象，叫遗传。从分子水平上讲，遗传就是遗传信息的复制和表达。传信息的复制和表达。亲代与子代及子代各个体之间，无论在形态结构亲代与子代及子代各个体之间，无论在形态结构和生理机能方面，总会有差异，这种同类型不同个体和生理机能方面，总会有差异，这种同类型不同个体之间的差异称为变异。从分子水平讲，是遗传信息发之间的差异称为变异。从分子水平讲，是遗传信息发生了变化。生了变化。遗传和变异是生物体最本质的属性之一。遗传和变异是生物体最本质的属性之一。遗传遗传heredity或或inheritance 变异variation 遗传型遗传型：表型表现型：表型表现型：又称基因型，指某一生物个体所含的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特征的宗和，是其遗传型在适宜环境条件下通过代谢和发育而得到的具体表达。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。有些基因结构未发生变化仅表型改变不是变异，有些基因结构未发生变化仅表型改变不是变异，只能称适应或饰变只能称适应或饰变modification。变异是基因结。变异是基因结构发生变化，而且往往是不可逆的变化，此变化可以构发生变化，而且往往是不可逆的变化，此变化可以遗传给子代形成新的品种。遗传是相对的，变异是绝遗传给子代形成新的品种。遗传是相对的，变异是绝对的；遗传中有变异，变异中有遗传。对的；遗传中有变异，变异中有遗传。饰变：是指外表的修饰性的改变，即一种饰变：是指外表的修饰性的改变，即一种不涉及遗传物不涉及遗传物质质结构改变而发生在转录、转译水平上的表型改变。结构改变而发生在转录、转译水平上的表型改变。表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为橘生淮南那么为橘，生于淮北那么为枳。变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质遗传物质结构或数量的改变结构或数量的改变，即遗传型的改变。，即遗传型的改变。遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 自发突变频率通常为10-6-10-9微生物是遗传学研究中的明星：t微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。t很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。t对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。微生物的独特生物学特性：微生物的独特生物学特性：1个体的体制极其简单；个体的体制极其简单；2营养体一般都是单倍体；营养体一般都是单倍体；3易于在成分简单的组合培养基上大量生长易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁繁 殖；殖；4繁殖速度快；繁殖速度快；5易于积累不同的中间代谢产物或终产物；易于积累不同的中间代谢产物或终产物；6菌落形态特征的可见性和多样性；菌落形态特征的可见性和多样性；7环境条件对微生物群体中各个个体作用的环境条件对微生物群体中各个个体作用的直直 接性和均一性；接性和均一性；8易于形成营养缺陷型；易于形成营养缺陷型；9各种微生物一般都有相应的病毒；各种微生物一般都有相应的病毒；10)存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；第一节第一节 遗传与变异的物质根底遗传与变异的物质根底w一核酸遗传变异的物质根底一核酸遗传变异的物质根底一核酸遗传变异的物质根底一核酸遗传变异的物质根底3 3个经典实验个经典实验个经典实验个经典实验二遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式二遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式1 1、证明、证明DNADNA是遗传物质的经典转化实验是遗传物质的经典转化实验GriffithGriffith是第一个发现转化现象的是第一个发现转化现象的 ，虽，虽然当时还不知道称之为转化因子的本质是然当时还不知道称之为转化因子的本质是什么，但是他的工作为后来什么，但是他的工作为后来AveryAvery等人进等人进一步揭示转化因子的实质，确立一步揭示转化因子的实质，确立DNADNA为遗为遗传物质奠定了重要根底。传物质奠定了重要根底。一核酸遗传变异的物质根底一核酸遗传变异的物质根底一核酸遗传变异的物质根底一核酸遗传变异的物质根底3 3个经典实验个经典实验个经典实验个经典实验转化实验材料方法动物实验细菌培养实验S型菌无细胞抽提液试验光滑型（光滑型（S）粗糙型（粗糙型（R）有有荚荚膜膜菌落光滑菌落光滑分泌毒素分泌毒素致致病病无无荚荚膜膜菌落粗糙菌落粗糙无无毒毒不不致致病病SSS三个血清型三个血清型RRR三个血清型三个血清型实验材料：实验材料：肺炎双球菌肺炎双球菌活的S菌加活R菌和热死S菌抽血分离死加活S菌死加活R菌或死S菌活肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验1动物实验动物实验杀死 无菌落生长 体外培养 活菌 体外培养 菌落 菌落多菌落少 体外混合培养杀死 活菌 转化实验2细菌培养实验大量R菌落活R菌S菌无细胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落转化实验3S型菌无细胞抽提液试验S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+二噬菌体感染实验二噬菌体感染实验A.D.HersheyA.D.Hershey和和M.ChaseM.Chase，19521952年年1含含32P-DNA的的一一组组：放放射射性性85%在在沉沉淀淀中中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性以以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验 2含含35S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在上清液中在上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性TMVHRVHRVTMV原始株原始株拆开拆开重建重建感染感染别离纯化别离纯化 植物病毒的拆开与重建实验 l一核酸存在的七个水平一核酸存在的七个水平l细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核l细胞核水平细胞核水平:原核区与真核生物的细胞核结构不同，原核区与真核生物的细胞核结构不同，核外核外DNA细细胞质中胞质中,真核：真核：DNA+组蛋白组蛋白l染色体水平染色体水平:倍性倍性(真核真核)和染色体数真核：多条；原和染色体数真核：多条；原核：一条核：一条l核酸水平：在原核中同染色体水平、存在局部二倍体，核酸水平：在原核中同染色体水平、存在局部二倍体，DNA或或RNA少数病毒，复合或裸露，双链或单链少数病毒，复合或裸露，双链或单链少数病毒少数病毒二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式l一核酸存在的七个水平一核酸存在的七个水平l基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录息量，转录翻译翻译l密码子水平：密码子水平：DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的单位是密码子。密码子是由核酸分排列顺序。遗传密码的单位是密码子。密码子是由核酸分子上三个连续核苷酸序列决定的。三个连续的枋苷酸序列子上三个连续核苷酸序列决定的。三个连续的枋苷酸序列l核苷酸水平：核苷酸是核酸的组成单位，最小的突变或核苷酸水平：核苷酸是核酸的组成单位，最小的突变或交换单位，四种碱基交换单位，四种碱基二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式基因组：是指单倍体细胞中所含的全套遗传物质，包括细胞中基因组：是指单倍体细胞中所含的全套遗传物质，包括细胞中的基因及非基因的的基因及非基因的DNA序列。序列。大多数细菌和噬菌体而言，基因组是指单个染色体上所含的全大多数细菌和噬菌体而言，基因组是指单个染色体上所含的全部基因。部基因。二倍体直核生物：单倍体配子或配子体细胞核内整套染色二倍体直核生物：单倍体配子或配子体细胞核内整套染色体所含的体所含的DNA分子及其所携带的全部基因。分子及其所携带的全部基因。微生物的基因组一般都比较小，其中最小的大肠杆菌噬菌体微生物的基因组一般都比较小，其中最小的大肠杆菌噬菌体MS2仅仅3000bp，含，含3个基因，而人的染色体个基因，而人的染色体DNA为为.x109bp.基因组学：研究生物基因组的组成、组内各基因的精细结构、基因组学：研究生物基因组的组成、组内各基因的精细结构、相互关系及表达调控的科学。相互关系及表达调控的科学。第二节、微生物的基因组第二节、微生物的基因组原核生物的质粒1.定义和特点 定义：存在于微生物染色体以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。所含的基因对寄主细胞一般是非必需的，只是在某些特殊的条件下质粒能赋予寄主细胞以特殊的机能，使寄主得到生长优势。特点：超螺旋结构、独立的复制子、严谨型复制、松弛型复制、质粒消除整合第三节第三节 微生物的染色体外遗传因子微生物的染色体外遗传因子2、质粒的主要类型：根据质粒所编码的功能和赋予的表型效、质粒的主要类型：根据质粒所编码的功能和赋予的表型效应。应。抗性因子抗性因子Resistancefactor，R因子：主要包括抗药性和抗重因子：主要包括抗药性和抗重金属两大类。金属两大类。Amp、Kan致育因子致育因子Fertilityfactor，F因子：最早发现的与大肠杆菌因子：最早发现的与大肠杆菌的有性生殖有关的质粒。决定细菌的性别。的有性生殖有关的质粒。决定细菌的性别。CoL质粒质粒colplasmid：大肠杆菌毒素因子，含有编码大肠杆：大肠杆菌毒素因子，含有编码大肠杆菌素的基因。一种细菌蛋白，菌素的基因。一种细菌蛋白，Ti质粒tumor inducing plasmid：Ti质粒tumor inducing plasmid：Ri质粒质粒rootinducingplasmid:基 因 突 变突变与育种第四节、微生物突变和诱变育种一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变序列的任何改变基因突变：一、基因突变一、基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞简称突变，是变异的一类，泛指细胞内或病毒粒内遗传物质的分子结内或病毒粒内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传变化，可自发构或数量发生的可遗传变化，可自发或诱导产生。狭义突变指基因突变或诱导产生。狭义突变指基因突变广义突变是指基因突变和染色体畸变。广义突变是指基因突变和染色体畸变。基因突变：指一个基因内部遗传物质基因突变：指一个基因内部遗传物质结构或结构或DNADNA序列的任何变化，包括一序列的任何变化，包括一对或少数几对的缺失、插入或置换，对或少数几对的缺失、插入或置换，导致遗传性状的变化。导致遗传性状的变化。突变的特点 基因突变突变的机制 突变类型 微生物突变体的主要类型微生物突变体的主要类型形态突变型形态突变型 菌落形态突变型菌落形态突变型菌体形态突变型菌体形态突变型生化突变型生化突变型营养突变体营养突变体(营养缺陷型营养缺陷型)抗性突变体抗性突变体发酵突变型发酵突变型:能利用到不能利用能利用到不能利用毒力突变型：致病能力增强或减弱毒力突变型：致病能力增强或减弱条件致死突变型条件致死突变型致死突变型致死突变型:突变后生活能力丧失或下降导致突变后生活能力丧失或下降导致死亡的突变型。死亡的突变型。产量突变型产量突变型按突变按突变实质分实质分二基因突变的特点二基因突变的特点(5(5个特点个特点)1.1.1.1.随机性随机性随机性随机性 2.2.2.2.稀有性：稀有性：稀有性：稀有性：10101010-9-9-9-910101010-6-6-6-63.3.3.3.独立性独立性独立性独立性4.4.4.4.稳定性稳定性稳定性稳定性5.5.5.5.可逆性可逆性可逆性可逆性基因突变随机性自发性和不对应性的证明基因突变随机性自发性和不对应性的证明变 量 试 验 涂 布 试 验 影印培养试验 大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成50小管)(在同一个大管中作整体培养)29 291 83 9 22 19 17 20 抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数变量试验 涂布试验 涂布敏感菌5104个共12个平板5104个菌落5000个细菌/菌落喷入T1保温重新涂布后 喷入T1保温6个平板共353个菌落 6个平板共28个菌落无药培养基含药培养基影印培养试验 原始敏感菌种基因突变及其机制基因突变及其机制 移码突变 染色体畸变 碱基的置换 一对碱基被另外的一对碱基置换。一对碱基被另外的一对碱基置换。转换转换(transition)：即：即DNA链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。链中的一个嘌呤被嘌呤或嘧啶被嘧啶所置换。颠换颠换(transversion)：即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。：即一个嘌呤被嘧啶或嘧啶被嘌呤所置换。1 诱变的机制(1)碱基的置换碱基的置换碱基的置换 直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂碱基的置换 C OHT：烯醇式CT：酮式OA.TT.AG.CA.T酮式G T烯醇式.COBr5-BU:酮式C OHBr5-BU:烯醇式碱基的置换 间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂碱基的置换 G.CA.BUG.BUA.BUG.CA.TA.TA.TA.TG.CA.BU酮式G.BU烯醇式烯醇式酮式分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与翻译发生错误造成突变点以后全部遗传密码转录与翻译发生错误ABC ABCABCABCABCABCABCABCAB+ABC ABCCBA CBA CBA CBA CBAABC BCA BCA BCABCABCABCABCA增添一个碱基增添一个碱基缺少一个碱基缺少一个碱基移码突变 染色体畸变 某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝 酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分 子大损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。染色体畸变 紫外线诱变作用机理紫外线诱变作用机理 可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂 能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变 DNADNA的损伤修复的损伤修复 DNA DNA的损伤：的损伤：DNADNA在复制时产生错配、病毒基因整在复制时产生错配、病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变合，某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏等，破坏DNADNA的双螺旋结构，从而影响的双螺旋结构，从而影响DNADNA的复制，的复制，并使并使DNADNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征生物突变。常的特征生物突变。假设假设DNADNA的损伤或错配得不到修复，会导致的损伤或错配得不到修复，会导致DNADNA突突变。其主要形式：变。其主要形式：一个或几个碱基被置换一个或几个碱基被置换 插入一个或几个碱基插入一个或几个碱基 一个或多个碱基对缺失一个或多个碱基对缺失 DNA DNA的损伤修复的损伤修复光复活修复、切除修复光复活修复、切除修复光复活修复：光复活修复：400nm400nm左右的光激活光复活酶，专左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上的一分解紫外光照射引起的同一条链上的TTTT或或CCCC，CTCT二聚体。包括从单细胞生物到鸟类，而二聚体。包括从单细胞生物到鸟类，而高等哺乳动物无高等哺乳动物无切除修复：将切除修复：将DNADNA分子中的受损伤局部切除，以分子中的受损伤局部切除，以 完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、完整的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNA DNA外切酶、外切酶、DNADNA连接酶均参与。连接酶均参与。发生在发生在DNADNA复制前复制前重组修复发生在复制后：复制时，跳过损重组修复发生在复制后：复制时，跳过损伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损伤伤部位，新链产生的缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除但在后代逐渐稀释。部位并没有切除但在后代逐渐稀释。诱导修复：造成诱导修复：造成DNADNA损伤或抑制复制的处理均能损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反响称为应急反响(SOS(SOS response)response)。此过程诱导产生切除修复和重组修。此过程诱导产生切除修复和重组修复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的复中的关键蛋白和酶，同时产生无校对功能的DNADNA聚合酶。所以会有聚合酶。所以会有2 2种结果：修复或变异种结果：修复或变异进化。进化。自发突变与育种自发突变与育种从生产中选育定向培育优良品种诱变育种 从青霉素产量看诱变育种诱变育种的基本环节诱变育种的原则诱变育种的定义二、突变与育种诱变育种诱变育种 诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均诱变育种就是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，高，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践从中挑选少数符合育种目的突变株，以供生产实践或科学实验之用。或科学实验之用。诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、诱变育种除提高产量外，还可改进产品质量、扩大品种种类和简化工艺等目的。它具有方法简便、扩大品种种类和简化工艺等目的。它具有方法简便、工作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使工作速度快和收效显著等优点，仍是目前最广泛使用的育种手段。用的育种手段。效价：指有效成分的浓度。1ug/ul称为1 单位1945时间1943194319431947195519711977目前发酵单位(u/ml)10025050085085080002万5万510万 从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种诱变育种的根本环节诱变育种的根本环节大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产出发菌株计算出诱变诱变育种工作中应考虑的几个原那么选优良的出发菌株处理单孢子或单细胞悬液选用最适剂量设计或采用高效筛选方案或方法利用复合处理的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株挑选优良的出发菌株生产中用过的自发变异菌株选用具有有利于进一步研究或应用性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用对诱变剂敏感性较高的增变变异株处理单孢子或单细胞悬液芽孢杆菌应处理芽孢放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，放线菌霉菌要稍加萌发后使用出发菌株应制成均匀悬夜选择简便有效的诱变剂选择简便有效的诱变剂出发菌株 含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离紫外线选择优良突变株选用最适剂量选用最适剂量剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示剂量以诱变剂浓度和处理时间来表示适宜剂量：能扩大变异幅度又能促使 变异移向正变范围的剂量充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落设计或采用高效筛选方案或方法设计或采用高效筛选方案或方法一个出发菌株诱变剂处理选出200个单 孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5 株40株40株40株40株40株诱变剂处理8创造新型筛选方法v1 1、初筛：以、初筛：以量量为主为主v2 2、复筛：以、复筛：以质质为主为主突变株的筛选方法 高产突变菌株的筛选方法 抗性突变体的筛选方法 营养缺陷型的的筛选方法 与突变株的筛选相关的几个概念与突变株的筛选相关的几个概念相关培养基根本培养基：能够满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的组合培养基。完全培养基：是在根本培养基中添加天然物质后能满足某种微生物各种营养缺陷型的营养要求的加富培养基。补充培养基：是在根本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的加富培养基。与突变株的筛选相关的几个概念三类遗传型野生型 A+B+营养缺陷型 A+B-原养型 A+B+突变突变春日霉素产生春日霉素产生菌的孢子悬液菌的孢子悬液高产突变株的筛选高产突变株的筛选 琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板 梯度培养皿法梯度培养皿法强抗性中抗性弱抗性含异烟肼接敏感菌含突变株抗药性突变株的筛选营养缺陷型的筛选方法营养缺陷型的筛选方法诱变剂处理淘汰野生型：青霉素浓缩法、菌丝过滤法、差异杀菌法检出缺陷型：夹层培养法、限量补充培养法、逐个 检出法、影印接种法鉴定缺陷型中间培养淘汰野生型青霉素浓缩法淘汰野生型青霉素浓缩法培养基培养基(含青霉素含青霉素)接入诱变菌液接入诱变菌液 （含抗性突变株）（含抗性突变株）涂布涂布培养培养淘汰野生型差异杀菌法1.适用于细菌的芽孢2.原理：将诱变处理的芽孢接种到根本培养基上，野生型的芽孢生长成营养细胞，而缺陷型的不能生长成营养细胞。检出缺陷型夹层培养法小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）检出缺陷型限量补充培养法 微量蛋白胨的根本培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株检出缺陷型逐个检出法检出缺陷型逐个检出法涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基菌种营养缺陷型检出缺陷型(影印接种法影印接种法)完全培养基完全培养基影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型鉴定缺陷型生长谱法：根本培养基+氨基酸 根本培养基+维生素 根本培养基+嘌呤或嘧啶第三节、基因重组和杂交育种 一、原核生物的基因重组 细菌的基因重组原核微生物 通过转化、接合、转导、原生质体融合等形式进行 一 局部物质转移和基因重组。转化(transformation)几个概念：转化、转化因子、感受态 转化过程转化的特点 转 化(transformation)受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞局部遗传性状发生变化的现象叫转化。转化因子:有转化活性的外源DNA片断转化是游离的片段的转移和重组游离的片段叫转化因子转化因子由供体提供自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得双链有转化能力，单链没有.受体细胞最能接受外源DNA片段并能实现转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为分钟(对数期的中期)感受态感受态的决定决定因素细胞遗传性决定：大肠杆菌，根瘤菌属等和菌龄有关：对数生长的中后期环腺苷酸cAMP可提高1000 倍 Ca2+能促使细胞进入感受态感受态因子是受体细胞外表上的一种蛋白质，即膜相关DNA结合蛋白功能使转化因子结合在受体细胞外表细胞壁自溶素和几种核酸酶 每个受体细胞外表约有30-80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体外表结合点上时，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。转化过程转化转化过程过程转化的特点 不需两个细胞直接接触，供体DNA提取出来，注入受体即可。转染：感受态细胞吸收质粒DNA和噬菌体DNA。转导的种类 完全转导流产转导局限转导溶源转变遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组。转导子：重组受体细胞 转导的发现 转导(transduction)转导的特点 普遍转导供体A-B+完全普遍性转导完全普遍性转导(compietetransduction)A-B+A+B-少数受体A+B+经重组形成转导子鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌A-B+色氨酸缺陷型A+B-组氨酸缺陷型galbioGal半Bio生宿主基因组整合不正常切离（10-410-6）正常切离正常dgaldbio低频转导LFT裂解物的形成局限转导局限转导：少数：少数特定基因特定基因转导的特点 需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触 噬菌体DNA不接合到寄主染色体 噬菌体蛋白质包裹寄主任何一局部DNA片段噬菌体DNA整合到寄主染色体上 噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换 普遍性转导 局限性转导接 合 及 其 发 现因子和接合 接合(conjugation):细菌杂交，细 胞间的直接接触。雄性菌株与雌性菌株接合结果+A+B+C-D-生物甲缺陷型A-B-C+D+苏亮缺陷型接 合 及 其 发 现A+B+C+D+通通过过细细胞胞间间的的直直接接接接触触能能进进行行大大段段的的转转移移的的过过程程，叫叫接接合合雄性菌株 Hfr菌株 F 菌株 菌株 （雌株）因子和接合大肠杆菌的结合因子和接合大肠杆菌的结合 F+菌株F-F+F+F+F-FFFHfrHfrF+（多数情况下）F-+HfrHfrHfr（少数情况下）雄性菌株与雌性菌株接合结果F-三者根本区别在于DNA转移的方式不同 转化：供体DNA片断注入受体细胞，通过细胞膜接合：供体进入受体通过性纤毛转导：供体DNA片断通过媒介噬菌体携带进入受体(四四)原生质体融合原生质体融合 通通过过人人为为方方法法，使使遗遗传传性性状状不不同同的的两两细细胞胞的的原原生生质质体体发发生生融融合合，并并产产生生重重组组子子的的过程，称为原生质体融合或细胞融合。过程，称为原生质体融合或细胞融合。原生质体融合的一般原理和主要过程原生质体融合的一般原理和主要过程先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，入线如细菌可用溶菌酶或青霉素处理，入线菌可用溶菌酶或相应的脱壁权衡利弊，真菌可用蜗牛酶或菌可用溶菌酶或相应的脱壁权衡利弊，真菌可用蜗牛酶或相应的脱壁酶等相应的脱壁酶等)去除细胞壁，再将形成的原生质体离心去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并参加促融合剂聚集，并参加促融合剂PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)促进融合，然后在促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁 或进行分裂的或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子一有性杂交一有性杂交二准性杂交二准性杂交菌丝联结菌丝联结异核体的形成异核体的形成形成双倍体形成双倍体别离子的产生别离子的产生第四节、真核微生物的杂交育种第四节、真核微生物的杂交育种v目的基因即外源基因或供体基因的取得目的基因即外源基因或供体基因的取得v载体系统的选择，载体系统的选择，v目的基因与载体重组体的构建，目的基因与载体重组体的构建，v重组载体导入受体细胞，重组载体导入受体细胞，v工程菌或工程细胞株的表达、检测以及实验工程菌或工程细胞株的表达、检测以及实验室和一系列生产性试验等。室和一系列生产性试验等。第五节第五节 基因工程基因工程根本操作包括：根本操作包括：基因工程的应用基因工程的应用在生产多肽类药物、疫苗中的应用改造传统工业发酵菌种动、植物特性的基因工程改进基因工程在环境保护中的应用根本流程：根本流程：关键要素：关键要素：第六节、菌种的衰退、复壮和保藏第六节、菌种的衰退、复壮和保藏一、菌种的衰退与复壮二、菌种的保藏菌种的衰退与复壮菌种的衰退与复壮菌种衰退指群体中退化个体再数量上占一定比例后，表现出菌种生产性能下降或优良性状丧失的现象。复壮是指菌种已发生衰退后，再通过纯种别离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，从而恢复该菌种原有典型性状的一种措施。衰退的防止1.控制传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不易衰退的细胞接种传代构巢曲霉用子囊孢子不用分生孢子4.采用有效的菌种保藏方法菌种复壮1.纯种别离2.通过宿主进行复壮3.淘汰以衰退的个体菌种保藏原理：创造一个最有利于菌种休眠的环境，减原理：创造一个最有利于菌种休眠的环境，减少传代少传代方法：1.低温保藏法2.隔绝空气保藏法：石蜡油保藏法、橡皮塞密封保藏法、琼脂柱穿刺封口保藏法3.枯燥保藏法：砂土管保藏法、真空冷冻枯燥法4.寄主保藏法