第八章动物早期胚胎操作课件

大家好大家好第十二章第十二章动物早期胚胎操作动物早期胚胎操作v胚胎移植技术胚胎移植技术v胚胎分割技术胚胎分割技术v胚胎嵌合技术胚胎嵌合技术v细胞核移植技术细胞核移植技术第一节第一节胚胎移植技术胚胎移植技术v胚胎移植的概念胚胎移植的概念v胚胎移植的生理基础胚胎移植的生理基础v胚胎移植的原则胚胎移植的原则v胚胎移植的技术程序胚胎移植的技术程序v胚胎移植的意义胚胎移植的意义一、胚胎移植的概念一、胚胎移植的概念借助一定的器械，从一头优良雌性动物的借助一定的器械，从一头优良雌性动物的输卵输卵管或子宫管或子宫内取出早期胚胎，移植到另一头处于内取出早期胚胎，移植到另一头处于相相同生理阶段同生理阶段的雌性动物的的雌性动物的相应部位相应部位，使之继续发，使之继续发育成为新个体。育成为新个体。供体：供体：提供胚胎的个体，一般为良种。提供胚胎的个体，一般为良种。受体：受体：接受胚胎的个体，提供胚胎孕育时间和空间。接受胚胎的个体，提供胚胎孕育时间和空间。二、胚胎移植的生理基础二、胚胎移植的生理基础v每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育v早期胚胎处于游离状态，胚胎发育到一定阶段早期胚胎处于游离状态，胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理联系会与子宫发生生理联系v胚胎发育不存在免疫问题胚胎发育不存在免疫问题v胚胎的遗传性不受受体的影响胚胎的遗传性不受受体的影响三、三、胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则v胚胎移植前后所处的环境的同一性胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性的同期性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性v胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内v胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响受不良因素的影响四、胚胎移植的技术程序四、胚胎移植的技术程序v供体和受体的选择供体和受体的选择v供体超数排卵处理供体超数排卵处理v供体母畜的发情鉴定及配种供体母畜的发情鉴定及配种v受体同期发情处理受体同期发情处理v供体早期胚胎的收集供体早期胚胎的收集v胚胎的检查、保存与培养胚胎的检查、保存与培养v胚胎的移植胚胎的移植v供体和受体的术后观察供体和受体的术后观察1.供体和受体的选择供体和受体的选择v供体应具有相当高的育种价值供体应具有相当高的育种价值v供体生殖机能应处于较高的状态：产后供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生天以上，无生殖系统疾病，体质强健殖系统疾病，体质强健v受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种上等，非优良品种v受体健康状况良好，已进入发情季节受体健康状况良好，已进入发情季节v供受体发情时间应接近或一致供受体发情时间应接近或一致2.供体超数排卵处理供体超数排卵处理v超数排卵（超数排卵（superovulation）：应用生殖激素处理，使单胎或双胎动物有更多卵泡发育并排出卵巢的过程。v超数排卵的意义：超数排卵的意义：采用超数排卵可大大增加每次的排卵数量v动物常用超排激素：动物常用超排激素：PMSG、垂体促性腺激素（FSH、LH）、PGF2、GnRH、hCG等供体超排处理供体超排处理3.3.发情观察和配种发情观察和配种 4.受体同期发情处理受体同期发情处理同期发情（同步发情）：同期发情（同步发情）：就是利用某些激素制剂，人为地控制并调整母畜的就是利用某些激素制剂，人为地控制并调整母畜的发情周期，使其在预定的时期内集中发情的方法。发情周期，使其在预定的时期内集中发情的方法。同期发情在畜牧生产中的意义：同期发情在畜牧生产中的意义：A.便于集中或定时对一群母畜进行输精，使母畜的妊娠、便于集中或定时对一群母畜进行输精，使母畜的妊娠、分娩和幼畜的培育相对集中。分娩和幼畜的培育相对集中。B.利于家畜胚胎移植的应用利于家畜胚胎移植的应用同期发情的机理及方法同期发情的机理及方法A.“弹簧法弹簧法”：向待处理母牛群同时施用孕激素，抑制卵：向待处理母牛群同时施用孕激素，抑制卵泡的发育和发情，经过一定时期同时停药，随之引起同泡的发育和发情，经过一定时期同时停药，随之引起同期发情。期发情。B.“割草法割草法”：利用前列腺素或其类似物（：利用前列腺素或其类似物（PGF2），使），使黄体溶解，中断黄体期，降低了孕激素水平，从而提前黄体溶解，中断黄体期，降低了孕激素水平，从而提前进入卵泡期，使发情提前到来。进入卵泡期，使发情提前到来。机理：机理：借助外源激素对卵巢的作用，使被处理的母畜借助外源激素对卵巢的作用，使被处理的母畜卵巢按预定的要求发生变化，并使其功能处于一个共卵巢按预定的要求发生变化，并使其功能处于一个共同的基础之上，达到同期发情的目的。同的基础之上，达到同期发情的目的。5.供体早期胚胎的收集供体早期胚胎的收集v胚胎冲洗液的配制胚胎冲洗液的配制：v手术法收集胚胎手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚v非手术法收集胚胎非手术法收集胚胎二路法三路法6.供体胚胎的分级检查供体胚胎的分级检查v形态学检查形态学检查根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。胞在透明带中的比例确定胚胎级别。v细胞荧光法细胞荧光法v测定代谢活性法测定代谢活性法v小鼠输卵管胚胎移植小鼠输卵管胚胎移植v小鼠子宫胚胎移植小鼠子宫胚胎移植v大动物非手术法胚胎移植大动物非手术法胚胎移植7.胚胎移植胚胎移植v供体和受体的抗炎处理供体和受体的抗炎处理v健康状况检查健康状况检查v返情状况检查返情状况检查v妊娠检查及妊娠确定妊娠检查及妊娠确定8.供体和受体的术后观察及处理供体和受体的术后观察及处理9.9.影响胚胎移植成功率的因素影响胚胎移植成功率的因素v胚胎因素胚胎因素:胚胎的质量，胚胎的发育阶段，胚胎胚胎的质量，胚胎的发育阶段，胚胎在体外停留的时间等。在体外停留的时间等。v母体因素：母体因素：供受体发情的同期化程度、受体的供受体发情的同期化程度、受体的孕酮水平、移植部位等。孕酮水平、移植部位等。v其他因素：其他因素：移植方法、移植器官污染程度及操移植方法、移植器官污染程度及操作者的熟练程度。作者的熟练程度。胚胎移植产出的犊牛胚胎移植产出的犊牛一次移入三枚胚全部成活一次移入三枚胚全部成活受体母羊与所生羔羊受体母羊与所生羔羊五、五、胚胎移植的意义胚胎移植的意义v发挥优良母畜的繁殖潜力发挥优良母畜的繁殖潜力借腹怀胎借腹怀胎v促进家畜改良的速度促进家畜改良的速度 快速繁殖快速繁殖v代替种畜的引进，保存品种资源代替种畜的引进，保存品种资源v胚胎生物技术的基础胚胎生物技术的基础试管动物、转基因试管动物、转基因动物、克隆动物等动物、克隆动物等第二节第二节胚胎分割技术胚胎分割技术v概念概念v胚胎分割的方法胚胎分割的方法v影响胚胎分割效果的因素影响胚胎分割效果的因素一、概念一、概念采用机械方法用特制的显微刀片或玻璃采用机械方法用特制的显微刀片或玻璃微针将早期胚胎分割成为微针将早期胚胎分割成为2等份、等份、4等份或等份或8等份，从而获得同卵双生、四生或八生的一等份，从而获得同卵双生、四生或八生的一项技术。项技术。胚胚胎胎分分割割过过程程同同卵卵双双生生三、影响胚胎分割效果的因素三、影响胚胎分割效果的因素v分割胚胎发育的阶段分割胚胎发育的阶段v胚胎分割的次数胚胎分割的次数v操作液操作液v动物种类动物种类v分割胚的移植分割胚的移植四、胚胎分割存在的问题四、胚胎分割存在的问题v初生体重低初生体重低v遗传一致性：遗传一致性：同一胚胎切割后获得的后代，理论上遗传性状应该完全一致，但事实并不这样。v同卵多胎的局限性：同卵多胎的局限性：至今最好的结果是由一枚牛胚胎获得3个牛犊。第三节第三节胚胎嵌合技术胚胎嵌合技术v嵌合体的概念嵌合体的概念v嵌合体的制作方法嵌合体的制作方法v嵌合体的标记与分析嵌合体的标记与分析v嵌合率的影响因素嵌合率的影响因素v嵌合体的应用前景嵌合体的应用前景一、概念一、概念嵌合体：嵌合体：同一个体中同时存在不同基因型的细同一个体中同时存在不同基因型的细胞或组织，这种个体称为嵌合体。胞或组织，这种个体称为嵌合体。胚胎嵌合：胚胎嵌合：把两个或多个不同基因型的早期胚把两个或多个不同基因型的早期胚胎（细胞）聚集在一起形成复合胚胎，进而发育胎（细胞）聚集在一起形成复合胚胎，进而发育为不同程度嵌合个体的过程。为不同程度嵌合个体的过程。二、胚胎嵌合体的制作方法二、胚胎嵌合体的制作方法1.1.聚合法聚合法聚合法聚合法胚胚聚合胚胚聚合：去透明带后，去透明带后，PHA作用下作用下CO2培养箱中培养箱中聚合，去聚合，去PHA，继续培养，继续培养卵裂球（细胞）胚聚合法卵裂球（细胞）胚聚合法：两组细胞间聚合两组细胞间聚合：在空透明带中将两类细胞用在空透明带中将两类细胞用PHA聚聚合，琼脂包埋培养合，琼脂包埋培养2.注入法注入法注入法注入法细胞（卵裂球、细胞（卵裂球、ICM、ES等）显微注入囊胚腔中，与等）显微注入囊胚腔中，与ICM合并，最后发育得到的个体即嵌合胚。合并，最后发育得到的个体即嵌合胚。有有色色鼠鼠与与白白色色鼠鼠胚胚胎胎融融合合三、嵌合体的标记与分析三、嵌合体的标记与分析1.遗传标记遗传标记v毛色毛色v同工酶同工酶磷酸葡萄糖异构酶磷酸葡萄糖异构酶v其他方法其他方法2.人工标记人工标记v绿色荧光蛋白基因绿色荧光蛋白基因v半乳糖苷半乳糖苷酶酶基因基因四、嵌合率的影响因素四、嵌合率的影响因素vv供体细胞供体细胞供体细胞供体细胞供体细胞发育的全能性、核型的正常与供体细胞发育的全能性、核型的正常与否及遗传背景对种系嵌合率有较大影响。否及遗传背景对种系嵌合率有较大影响。vv受体胚胎受体胚胎受体胚胎受体胚胎一般来说，导入的受体胚胎越早，其形一般来说，导入的受体胚胎越早，其形成嵌合体的嵌合程度越高，但嵌合体的获得成嵌合体的嵌合程度越高，但嵌合体的获得率低。率低。五、嵌合体的应用前景五、嵌合体的应用前景v染色体畸变研究染色体畸变研究v基因突变研究基因突变研究v转基因动物生产转基因动物生产v胚胎种间移植胚胎种间移植第四节第四节细胞核移植技术细胞核移植技术v定义定义v核移植技术程序核移植技术程序v核移植成功率的影响因素核移植成功率的影响因素v核移植技术的应用前景核移植技术的应用前景一、核移植定义一、核移植定义v通过显微操作的方法，将通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核供体细胞的细胞核放入预放入预先去核的先去核的卵母细胞卵母细胞或或早期受精卵早期受精卵中，形成一个新的中，形成一个新的核质重组胚核质重组胚，供体核在受体胞质作用下，发生发育，供体核在受体胞质作用下，发生发育程序重编，使得重组胚得以分裂、分化并最终发育程序重编，使得重组胚得以分裂、分化并最终发育成一个新的个体。成一个新的个体。v狭义的动物克隆仅指狭义的动物克隆仅指细胞核移植细胞核移植，广义的动物克隆，广义的动物克隆还包括卵裂球分离、胚胎分割。还包括卵裂球分离、胚胎分割。二、核移植技术程序二、核移植技术程序v供体细胞的准备供体细胞的准备v受体胞质的准备受体胞质的准备v卵母细胞的去核卵母细胞的去核v重组胚的构建重组胚的构建v重组胚的激活重组胚的激活v重组胚的培养和胚胎移植重组胚的培养和胚胎移植芬兰多赛特白羊芬兰多赛特白羊苏格兰黑苏格兰黑面母绵羊面母绵羊核供体核供体卵供体卵供体乳腺细胞乳腺细胞饥饿培养饥饿培养去核去核电融合电融合新的新的 卵细胞卵细胞桑椹胚或囊胚桑椹胚或囊胚假孕母羊假孕母羊多莉多莉体体细细胞胞克克隆隆技技术术的的方方法法1.供体细胞的准备供体细胞的准备v种类：种类：胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞v单细胞制备单细胞制备v关键技术：关键技术：血清饥饿培养，使细胞周期停留在血清饥饿培养，使细胞周期停留在细胞周期的细胞周期的G0期期2.受体胞质的准备受体胞质的准备（1）种类：）种类：M期卵母细胞、合子期受精卵、期卵母细胞、合子期受精卵、2细胞胚胎细胞胚胎（2）M期卵母细胞最适合期卵母细胞最适合v胞质环境含高水平成熟促进因子胞质环境含高水平成熟促进因子(MPF)v便于染色体定位和去核操作便于染色体定位和去核操作3.卵母细胞的去核卵母细胞的去核v盲吸法盲吸法v半卵去核法半卵去核法v化学诱导去核化学诱导去核:脱羰秋水仙碱脱羰秋水仙碱vA:盲吸法去核前盲吸法去核前M期卵母细胞期卵母细胞vB:去核后卵母细胞去核后卵母细胞M卵母细胞去核卵母细胞去核(200)M卵母细胞去核前后卵母细胞去核前后H33342荧光染色荧光染色(100)4.重组胚的构建重组胚的构建v融合法融合法v细胞质内注核法细胞质内注核法5.重组胚的激活重组胚的激活v电激活电激活v乙醇激活乙醇激活v钙离子和钙离子载体钙离子和钙离子载体A23187v离子霉素离子霉素vSr2+激活激活6.重组胚的培养和胚胎移植重组胚的培养和胚胎移植vv2002年，广西大学胚胎细胞克隆兔年，广西大学胚胎细胞克隆兔体细胞克隆奶牛（山东）体细胞克隆奶牛（山东）体细胞克隆牛（莱阳农学院体细胞克隆牛（莱阳农学院）体细胞克隆猫体细胞克隆猫韩国科学家培育出首只克隆狗韩国科学家培育出首只克隆狗2005年年08月月05日日09:06北京晨报北京晨报三、核移植成功率的影响因素三、核移植成功率的影响因素v供体细胞类型和细胞周期的影响供体细胞类型和细胞周期的影响v受体胞质的影响受体胞质的影响v供体细胞与受体胞质的相互作用供体细胞与受体胞质的相互作用v重组胚的激活重组胚的激活四、核移植技术的应用前景四、核移植技术的应用前景1.基础学科中的应用基础学科中的应用v细胞分化程度与发育潜能的关系；细胞分化程度与发育潜能的关系；v核质相互作用的机制核质相互作用的机制2.畜牧业中的应用畜牧业中的应用v育种上可缩短育种年限，快速繁殖优良种群；育种上可缩短育种年限，快速繁殖优良种群；v为转基因家畜生产提供新的方法为转基因家畜生产提供新的方法3.物种保护上的应用物种保护上的应用v拯救濒危动物，扩大濒危动物的数量拯救濒危动物，扩大濒危动物的数量4.医疗卫生上的应用医疗卫生上的应用v制药业：制药业：v治疗性克隆技术：治疗性克隆技术：v异种器官移植技术：异种器官移植技术：2004年01月24日07:29北京青年报中国首例异体克隆动物克隆濒危动物北山羊在新疆乌鲁木齐县六十户乡降生谢谢！谢谢！小结v基本概念：胚胎移植；同期发情；胚胎嵌合；基本概念：胚胎移植；同期发情；胚胎嵌合；核移植核移植v基本原理：胚胎移植的生理基础及原则基本原理：胚胎移植的生理基础及原则v基本技术：胚胎移植的技术流程基本技术：胚胎移植的技术流程核移植的技术程序核移植的技术程序核移植的关键技术核移植的关键技术小小鼠鼠细细胞胞期期胚胚胎胎收收集集用透明质酸酶处理受精卵细胞团用透明质酸酶处理受精卵细胞团大动物手术法胚胎收集大动物手术法胚胎收集大动物非手术法胚胎收集大动物非手术法胚胎收集牛胚胎发育模式图牛胚胎发育模式图小鼠早期胚胎小鼠早期胚胎6天收集的胚胎（未拣）天收集的胚胎（未拣）子宫移植子宫移植