临床PCR检验的室内质控方法课件

临临床床PCR检验检验的室内的室内质质控控方法方法卫生部临床检验中心 李金明1精选ppt临床PCR检验的室内质控方法卫生部临床检验中心 李金明1存在的存在的问题问题l概念不清l不知道具体怎么做l不会写室内质控的SOPl不知道如何选择室内质控物l不会分析室内质控的结果2精选ppt存在的问题概念不清2精选ppt室内室内质质控控SOP存在的存在的问题问题l责任人不清。l质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。l没有明确所选用的质控方法。对前20次的测定的室内质控没有解决方法。l没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。并且一般都没有阴性失控的判断方法。l没有失控后的分析及处理措施。3精选ppt室内质控SOP存在的问题责任人不清。3精选ppt室内室内质质量控制（量控制（InternalQualityControl,IQC)的概念的概念l由由实验实验室工作人室工作人员员，采取一定的方法和步，采取一定的方法和步骤骤，连连续评续评价本价本实验实验室工作的可靠性程度，旨在室工作的可靠性程度，旨在监测监测和和控制本控制本实验实验室工作的精密度室工作的精密度，提高本室常，提高本室常规规工作工作中批内、批中批内、批间样间样本本检验检验的一致性，以的一致性，以确定确定测测定定结结果是否可靠、可否果是否可靠、可否发发出出报报告的一告的一项项工作工作。l可概括可概括为为:(1)(1)执执行者行者：实验实验室技室技术术人人员员；(2)(2)目目的的：监测实验监测实验室室测测定的重复性；定的重复性；(3)(3)功能功能：决定：决定了当批了当批测测定的有效性，定的有效性，报报告可否告可否发发出。是出。是对实验对实验室室测测定的定的即即时时性性评评价价。4精选ppt室内质量控制（Internal Quality Contro室内室内质质量控制（量控制（IQC）的基本内容）的基本内容l主要包括三个方面：（1）测定前的质量控制；（2）统计学质量控制；（3）质量控制的评价。5精选ppt室内质量控制（IQC）的基本内容主要包括三个方面：5精选pp测定前的质量控制l实验室设施、仪器设备及管理l理想的试剂和操作方法 l人员培训 6精选ppt测定前的质量控制实验室设施、仪器设备及管理6精选ppt实验实验室室设设施、施、仪仪器器设备设备及管理及管理l实验室空间及工作流程的设计l实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源7精选ppt实验室设施、仪器设备及管理实验室空间及工作流程的设计7精选p理想的理想的PCR实验实验室室设计设计A产产物分析区物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓缓冲冲间间缓缓冲冲间间缓缓冲冲间间专专用走廊用走廊工作流向工作流向扩扩增区增区标标本制本制备备区区试剂试剂准准备备区区8精选ppt理想的PCR实验室设计A产物分析区空气流向空气流向空气流向空产产物分析区物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓缓冲冲间间缓缓冲冲间间缓缓冲冲间间专专用走廊用走廊工作流向工作流向扩扩增区增区标标本制本制备备区区试剂试剂准准备备区区理想的理想的PCR实验实验室室设计设计B9精选ppt产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间临床PCR实验室设计的一般原则l各区独立l注意风向l因地制宜l方便工作“十六字口十六字口诀诀”10精选ppt临床PCR实验室设计的一般原则各区独立“十六字口诀”10精选产产物分析区物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓缓冲冲间间缓缓冲冲间间缓缓冲冲间间专专用走廊用走廊工作流向工作流向扩扩增区增区标标本制本制备备区区试剂试剂准准备备区区传递窗传递窗传递窗11精选ppt产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间临临床床PCR实验实验室室质质量管理的特点量管理的特点 l“无基因”概念 l实验室要有严格的人员进入限制和程序 l使用合格的试剂和消耗品 12精选ppt临床PCR实验室质量管理的特点“无基因”概念 12精选ppPCR实验实验室室“污污染染”的主要来源的主要来源l临床标本中存在的大量待测微生物l科研中得到的质粒克隆l以前分析研究的特定微生物l大量存在于实验环境中的特定微生物l以前扩增产物的残留污染。这也是PCR实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。13精选pptPCR实验室“污染”的主要来源临床标本中存在的大量待测微生物PCR实验实验室的重要防室的重要防“污污染染”措施措施l实验室的严格分区及工作程序的严格遵守 l化学方法：实验台面可使用10的次氯酸钠（漂白剂）清洗；有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时，在转回之前，应将其置于210的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。l紫外照射：实验台面、仪器设备、实验室空间lUNG14精选pptPCR实验室的重要防“污染”措施实验室的严格分区及工作程序的仪仪器器设备设备及管理及管理lPCR仪、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案，并定期维护;PCR仪、加样器、恒温设备应定期进行校准15精选ppt仪器设备及管理15精选ppt理想的理想的试剂试剂:试剂试剂的的质检质检l核酸提取或标本处理方法的抗干扰能力（能否 有效地去掉PCR抑制物）l测定下限(Detection limit)（定性测定）l测定准确性和线性范围l批内变异和批间变异l试剂批间的一致性l有否污染l其他：外包装、试剂的完整性、有效期、说明书等16精选ppt理想的试剂:试剂的质检核酸提取或标本处理方法的抗干扰能力（能理想的操作方法l按照试剂盒说明书操作即可吗?l操作中影响测定结果的关键环节l写出具有可操作性的SOP17精选ppt理想的操作方法17精选ppt人人员员培培训训l培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。l如何培训：讲座、讨论、自学和参加培训班等。l培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。18精选ppt人员培训培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方统计质控方法l质控物浓度的选择l每次（批）测定质控物的数量及放置l质控规则lLevey-Jennings质控图方法 l“即刻法”质控方法 l“假阳性”的统计质控方法19精选ppt统计质控方法质控物浓度的选择19精选ppt质质控物控物浓浓度的度的选择选择l定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度l定性测定：接近方法测定下限的浓度l阴性质控物20精选ppt质控物浓度的选择定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度每次（批）每次（批）测测定定质质控物的数量及控物的数量及放置放置l标本数量如小于30，弱阳性和阴性质控各1份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加l均匀分散于临床标本中，与临床标本一同处理（核酸提取）l扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。21精选ppt每次（批）测定质控物的数量及放置标本数量如小于30，弱阳性和阴性阴性质质控控样样本的种本的种类类l阴性原血清样本l实验过程中带入的空管l仅含扩增反应混合液的管22精选ppt阴性质控样本的种类阴性原血清样本22精选ppt阴性原血清阴性原血清样样本的功能本的功能l监测实验室的以前扩增产物的“污染”l由实验操作所致的标本间的交叉污染。具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开等l扩增反应试剂的污染。23精选ppt阴性原血清样本的功能监测实验室的以前扩增产物的“污染”23精核酸提取核酸提取过过程中程中带带入的空管入的空管l监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在（在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增）24精选ppt核酸提取过程中带入的空管监测核酸提取过程中的实验室“污染”的仅仅含含扩扩增反增反应应混合液的管混合液的管l监测试剂的“污染”25精选ppt仅含扩增反应混合液的管监测试剂的“污染”25精选ppt质控规则的表达方式及定义 l质控规则的表达方式 l质控规则的功能 l常用质控规则的符号及定义 26精选ppt质控规则的表达方式及定义 质控规则的表达方式 26精选ppt质控规则的表达方式l通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。l当质控测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。l常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。27精选ppt质控规则的表达方式通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控质控规则的功能 l简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。28精选ppt质控规则的功能 简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。2常用质控规则的符号及定义 符符号号定定义义l12S 一个质控测定值超出2s控制限。l13S 一个质控测定值超出3s控制限。l22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。lR4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。l41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。l7T 七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变 化。l10X 十个连续的质控测定值同时处于均值（）的同一侧。29精选ppt常用质控规则的符号及定义 符 号 Levey-Jennings质控图方法l也称Shewhart质控图，是由美国的Shewhart于1924年首先提出，并用于工业产品的质量控制。l二十世纪五十年代初，Levey-Jennings将其引入临床检验的质量控制。经Henry和Segalove的改良，即为目前常用的Levey-Jennings质控图。30精选pptLevey-Jennings质控图方法也称Shewhart质质控图31精选ppt质控图31精选ppt32精选ppt32精选pptLevey-Jennings质控控图基本的基本的统计学含学含义l稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。l如以3s为失控限，假失控的概率为0.3%。33精选pptLevey-Jennings质控图基本的统计学含义稳定条件“即刻法”质控方法l“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，即Grubs异常值取舍法；l只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。34精选ppt“即刻法”质控方法“即刻法”质控方法的实质是一种统计学方法，“假阳性假阳性”的的统计统计学室内学室内质质控方法控方法l基于日常检验的阳性率比值(呈正态分布)l直接概率计算方法（不呈正态分布）35精选ppt“假阳性”的统计学室内质控方法基于日常检验的阳性率比值(呈正基于日常基于日常检验检验的阳性率比的阳性率比值值l半Levey-Jennings质控图法 36精选ppt基于日常检验的阳性率比值半Levey-Jennings质控图质质控控规则规则l当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定，并增加一倍阴性质控样本。l如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+3SD,则为失控,为1+3S规则。本次结果阴性结果根据阳性质控样本的情况,决定是否可以发出,所有阳性样本结果不能发出，需查找出现阳性率增高的原因，并在增加一倍阴性质控样本的情况下重新检测。37精选ppt质控规则当阴性质控样本为阳性时,不管阳性率测定比值为何，均为可能的几种失控表可能的几种失控表现现 l曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由于某一天操作上的失误导致实验室被污染如标本泄漏，产物泄漏，试剂被污染等l向上的趋势性变化：可能存在累积性的产物污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而使病人结果的阳性率逐渐增高。此时实验室需要进行彻底清洁。38精选ppt可能的几种失控表现 曲线向上漂移：提示出现污染，污染可能是由直接概率直接概率计计算法算法l按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被称为小概率事件，即发生的可能性很小。l当一个小概率事件发生时，则可能有误差存在，有必要对其发生的原因进行分析。l对每天的日常病人结果中阳性率出现的概率进行计算，如果这种结果出现的概率小于5%时，则可判为失控。39精选ppt直接概率计算法按统计学规律，一个事件发生的概率小于5%被称为根据二根据二项项式分布的概率式分布的概率计计算算l在一个实验室中某检测项目结果的阳性率为p,计算在n个血液样本中有k个阳性结果的概率。根据二项式分布的概率计算公式如下：P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k (1)其中n为当次实验检测标本数，k为阳性个数，p为阳性率。lP(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。40精选ppt根据二项式分布的概率计算在一个实验室中某检测项目结果的阳性率根据二根据二项项式分布的概率式分布的概率计计算算l如果一个实验室检测HBV DNA，平常病人结果的阳性率为10%，即p=0.1,在某一次检测25个样本出现6个阳性结果，19个阴性结果，则检测过程中是存在污染的可能性可通过下述方法计算。即计算在25个样本中出现6个或6个以上阳性结果的概率，此时的概率为1-（获得0个或1个或2个或3个或4个或多5个阳性结果的概率）即：l1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334l则在这个实验室一次检测25个标本获得6个或6个以上阳性结果的概率为3.34%，小于5%，属于小概率事件，即发生的可能性很小，可能有污染所致假阳性结果的可能。41精选ppt根据二项式分布的概率计算如果一个实验室检测HBV DNA，平根据泊松分布的概率根据泊松分布的概率计计算算l在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目如HCV RNA、CT、结核杆菌、淋球菌的阳性结果率均较低，这时虽然可以使用公式（1）计算概率，但如果标本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更为简便的方法。根据泊松分布，可使用下式计算概率：P(X=k)=(np)ke-np/k!(2)l P(X=k)5%为失控。此时，阴性标本可以发出报告，所有阳性标本在查清原因后重做。42精选ppt根据泊松分布的概率计算在血液筛查检测中，许多实验室或检测项目根据泊松分布的概率根据泊松分布的概率计计算算l一个实验室中，某项目每次检测结果的阳性率约为2%，则在100个样本中出现8个阳性结果的概率。l根据泊松分布，可使用公式（2）计算概率，此时n=100,p=0.02,k=8,np=2代入公式（2）计算得 P(X=10)=28e-2/8!=0.0009。43精选ppt根据泊松分布的概率计算一个实验室中，某项目每次检测结果的阳性标本间交叉污染的概率计算l如果所有阳性结果的出现是连续性的，则可能存在标本间的交叉污染，即阳性样本污染了它邻近的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下：P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)!（3）其中n为当次实验检测标本数，r为连续出现阳性的个数。l 当某次实际测定标本连续阳性的概率大于所计算的概率，则判为失控。阴性标本结果可以发出，阳性标本要考虑标本间交叉污染的问题。44精选ppt标本间交叉污染的概率计算如果所有阳性结果的出现是连续性的，则标本间交叉污染的概率计算l如在一次检测100个标本的HBV DNA检测中，所有两个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-2+1)/100!/2!(100-2)!=99/4950=0.02 概率为2.0%。因此，如在100个标本中，连续出现两个为阳性次数有3次，即概率为3.0%，则为失控。l而在一次检测100个标本，所有三个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率为0.06%。因此，如果如在100个标本中，连续出现三个为阳性次数有1次，即概率为1.0%，为失控。45精选ppt标本间交叉污染的概率计算如在一次检测100个标本的HBV D室内质量控制的评价lIQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测定的有效性的判断，也反应了实验室测定趋势的变化。lIQC的失控不能做为处罚的依据，应建设性的找出失控的原因，针对其采取措施加以改进。l对IQC应定期进行评价。46精选ppt室内质量控制的评价IQC是一个集体活动，不光是对实验室一次测阳性阳性质质控控样样本失控的常本失控的常见见原因原因l核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留、所用耗材如离心管有PCR抑制物等。l仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。l试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。47精选ppt阳性质控样本失控的常见原因核酸提取中的随机误差。如核酸提取中阳性阳性质质控控样样本本测测定定结结果偏低或果偏低或为为阴性阴性结结果偏低果偏低阴性阴性临临床床标标本本中中无无强强阳性阳性临临床床标标本本中中有有较较强强阳性阳性临临床床标标本本中有阳性中有阳性临临床床标标本本全全为为阴性阴性观观察察临临床床标标本情况本情况所所用用离离心心管管含含抑制物抑制物Taq酶酶活活性性降降低低核核酸酸提提取取试试剂剂效率低效率低更更换换进进口口离离心心管管更更 换换Taq酶酶再再检测检测更更换换核核酸酸提提取取试剂试剂所有所有标标本重新本重新检测检测核核酸酸提提取取中中靶靶核核酸酸丢丢失失核核酸酸提提取取中中抑抑抑抑物物残残留留核核酸酸提提取取试试剂剂混入混入扩扩增增仪仪孔孔间间温温度差异度差异随机误差检检测测质质控控样样本本及及35份份已已知阳性知阳性样样本本质质控控样样本本测测定定正正常常且且阳阳性性样样本本有有些些值值增加增加质质控控及及已已知知阳阳性性样样本本测测定定仍仍异常异常按按系系统统误误差差途途径径分分析析重重新新提提取取或或已已知知浓浓度度DNA在同一孔内在同一孔内扩扩增增结结果正常果正常结结果仍低果仍低进进行行扩扩增增仪仪孔孔温温度度校校准准后后再再检测检测Taq酶酶 或或逆逆转转录录酶酶失活失活48精选ppt阳性质控样本测定结果偏低或为阴性结果偏低阴性临床标本中无强阳避免假阴性的措施避免假阴性的措施l纯化核酸l标本重复双份测定 l稀释标本 l使用“内质控”（Internal Control,IC)49精选ppt避免假阴性的措施纯化核酸49精选ppt阴性阴性质质控控样样本的常本的常见见失控原因失控原因 l扩增产物的“污染”l临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”50精选ppt阴性质控样本的常见失控原因 扩增产物的“污染”50精选ppt阴性阴性质质控控样样本本测测定定为为阳性阳性临临床床标标本亦全本亦全为为阳性阳性临临床床标标本中有阳性也有阴性本中有阳性也有阴性扩扩增增产产物物“污污染染”试剂试剂“污污染染”同同时检测时检测的的标标本情况本情况扩扩增增产产物物轻轻度度“污污染染”标标本本间间交交叉叉“污污染染”35空空管管室室内静置内静置58份份水水样样本本检测检测试试剂剂直直接接扩扩增增检测检测验证验证验证验证58份份 水水样样本本检测检测暂暂停停日日常常检检验验，实实验验室清室清洁洁、通、通风风更更换试剂换试剂措施措施有有阳阳性性，则则确确认认有有实验实验室室“污污染染”无无阳阳性性，说说明明为为标标本交叉本交叉“污污染染”改善操作改善操作措施措施51精选ppt阴性质控样本测定为阳性临床标本亦全为阳性临床标本中有阳性也有避免避免PCR检验检验假阳性假阳性结结果的措施果的措施l严格的实验室分区l使用带“滤芯”的吸头l设立“阴性”质控（与标本同时处理）l使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂l临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌、淋球菌等经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。52精选ppt避免PCR检验假阳性结果的措施严格的实验室分区52精选pptIQC的局限性lIQC可能可能测测不出的不出的误误差差l测测定前定前测测定中定中测测定后定后样样本本鉴鉴定不定不对对样样本吸取不本吸取不对对结结果果记录错误记录错误 样样本本贮贮存中存中变质变质试剂试剂加入不加入不对对l此此类误类误差的差的发发生率在不同的生率在不同的实验实验室有所不同，室有所不同，一般要求小于一般要求小于0.1%，且，且应应均衡地分布于均衡地分布于测测定定前、前、测测定中和定中和测测定后的不同定后的不同阶阶段。段。53精选pptIQC的局限性IQC可能测不出的误差53精选ppt54精选ppt谢谢！54精选ppt此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！此课件下载可自行编辑修改，供参考！