第9章电泳和电色谱课件

第第 九九 章章电泳技术电泳技术11.基础理论1.1定义带电颗粒在电场的作用下，向着与其带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳之为电泳(electrophoresis(electrophoresis，简称，简称EP)EP)电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面表面电势电势和和双电层双电层的因素起着决定性的作用。的因素起着决定性的作用。图1电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。2电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、1、2、和球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。1.2 电泳技术的发展过程电泳技术的发展过程3n20世世纪纪50年年代代，以以支支持持介介质质为为主主的的电电泳泳模模式式不不断断涌涌现现，如如滤滤纸纸、醋醋酸酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。纤维素薄膜、淀粉薄膜等。n60年年代代以以后后发发展展了了以以凝凝胶胶为为主主的的支支持持物物的的电电泳泳方方法法，如如聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。胶、琼脂糖凝胶电泳等。n1967年在凝胶电泳的基础上建立了年在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。n70年年代代以以后后根根据据不不同同需需要要推推出出了了多多种种电电泳泳模模式式，如如圆圆盘盘电电泳泳、垂垂直直板板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术n90年年代代又又推推出出了了分分辨辨率率极极高高的的高高效效毛毛细细管管电电泳泳。多多年年来来科科学学家家们们对对电电泳泳结结果果的的分分析析做做了了大大量量的的工工作作，建建立立了了各各种种实实验验方方法法，电电泳泳后后对对分分离离物物质质可可以以用用染染色色、扫扫描描、紫紫外外吸吸收收、放放射射自自显显影影、生生物物活活性性测测定定等等方方法法进进行分析，得到所需数据。行分析，得到所需数据。4(1)电泳迁移电泳迁移(electrophoretic migration)：在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动，单位是在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动，单位是cm(2)迁移时间迁移时间(migration time)：用：用tm表示表示 在在电电泳泳过过程程中中，带带电电粒粒子子在在电电场场的的作作用用下下做做定定向向移移动动所所用用的的时时间间，单位是单位是min。(3)电泳速度电泳速度(electrophoretic velocity)：用：用Vep表示表示 在在单单位位时时间间内内，带带电电粒粒子子在在电电场场的的作作用用下下做做定定向向运运动动的的距距离离，单单位位是是cm/sec1.3电泳的常用术语5(4)电场强度电场强度(electric field strength)：用：用E表示表示 在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应，单位是在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应，单位是 V/cmE=V/Lt 式中式中V为电压，为电压，Lt为两端电极的距离。为两端电极的距离。(5)电渗流电渗流(electroosmotic flow)：用：用EOF表示表示在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷之间相互作用，在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷之间相互作用，形成形成 一个正离子层，导致流体朝负极方向移动，称为电渗流，这种现象也一个正离子层，导致流体朝负极方向移动，称为电渗流，这种现象也称之为电渗称之为电渗(electroosmosis)现象。现象。AB6(6)相对迁移率相对迁移率(relative mobility)：用：用mR表示蛋白质样品的表示蛋白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率，即迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率，即 蛋白质的迁移距离蛋白质的迁移距离(cm)mR=示踪染料的迁移距离示踪染料的迁移距离(cm)71.4 电泳的基本原理电泳的基本原理（1）带电颗粒）带电颗粒溶溶液液中中任任何何物物质质由由于于其其本本身身的的解解离离或或表表面面吸吸附附其其它它带带电电质质点点而而带带电电，在在电电场场中中就就会会发发生生迁迁移移，移移动动方方向向取取决决于于它它们的带电符号。们的带电符号。NaCl Na+Cl 生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、多多糖糖等等常常以以颗颗粒粒分分散散在在溶溶液中，它们的净电荷取决于溶液中的液中，它们的净电荷取决于溶液中的H+浓度浓度8（2）电泳迁移率）电泳迁移率(mobility)荷电溶质在电场中所受的静电引力荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的荷电荷数与溶质的荷电荷数Z和电场强度和电场强度E成正比成正比 f=EZe (1)带带电电颗颗粒粒在在迁迁移移中中同同时时受受到到来来自自于于介介质质的的摩摩擦擦力力 ，对对于于球球形形颗颗粒粒来来说说，在在自由溶液中此阻力服从自由溶液中此阻力服从Stock定律：定律：=6rve (2)ve是是在在介介质质粘粘度度为为的的溶溶液液中中，半半径径为为r的的带带电电颗颗粒粒的的移移动动速速度度。但但在在凝凝胶胶中中，这这种种阻阻力力并并不不完完全全符符合合Stocks定定律律。还还取取决决于于介介质质中中的的其其它它因因素素如如凝凝胶胶厚厚度度、颗颗粒大小和介质的内渗等。粒大小和介质的内渗等。当当f=时，荷电溶质恒速泳动时，荷电溶质恒速泳动,ve=E =u0E其中其中 u0=为电解质溶质的迁移率为电解质溶质的迁移率92分类方法种类分离原理区带电泳移界电泳稳态电泳（等速电泳、等电聚焦电泳）支持介质纸电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳琼脂凝胶电泳琼脂凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳介质形状薄层电泳薄层电泳板电泳板电泳 柱电泳柱电泳 10(1)区区带带电电泳泳(zone electrophoresis，ZEP)：是是在在半半固固相相或或胶胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液，然然后后在在介介质质上上加加电电场场，带带电电颗颗粒粒在在支支持持介介质质上上或或支支持持介介质质内内迁迁移移，在在电电泳泳过过程程中中，不不同同的的离离子子成成分分在在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带均一的缓冲液系统中分离成独立的区带(图图a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。，这是当前应用最广泛的电泳技术。(2)移移界界电电泳泳(moving boundary electrophoresis，MBEP)：是是把把电电场场加加在在生生物物大大分分子子溶溶液液和和缓缓冲冲溶溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图图b)。(3)稳稳态态电电泳泳(steady state electrophoresis)：带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下电电迁迁移移一一定定时时间间后后达达到到一一个个稳稳定定状状态态，此此后后，电电泳泳条条带带的的宽宽度度不不随随时时间间的的变变化化而而变变化化，如如等等速速电电泳泳(isotachophoresis，ITP)、等等电电聚聚焦电泳焦电泳(isoelectric focusing，IEF)(图图c、d)。abcda 区带电泳区带电泳 b 移界电泳移界电泳 c 等速电泳等速电泳 d 等电聚焦等电聚焦112.1凝胶电泳n n作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。分为：连续洗脱（柱式）和不连续凝胶电泳小等特性。分为：连续洗脱（柱式）和不连续凝胶电泳n n凝胶电泳的支持介质：凝胶电泳的支持介质：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PGApolyacrylamidegel,PGA）由丙烯酰胺和交联剂由丙烯酰胺和交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺在引发甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；剂和增速剂的作用下，聚合而成；琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由分是由1,31,3连接的连接的-D-D吡喃半乳糖和吡喃半乳糖和1,41,4连接的连接的3,63,6脱水脱水-D D吡喃半乳糖交替形成的；吡喃半乳糖交替形成的；12柱式凝胶电泳n原理：当溶质泳动到凝胶末端时，通入洗脱液分别回收各个组分。这种方法不仅操作简便，凝胶还可重复使用。n缺点：回收的溶质浓度很低。柱式凝胶电泳示意图13不连续凝胶电泳由浓度不同的两层凝胶组由浓度不同的两层凝胶组成，上层凝胶浓度低，对成，上层凝胶浓度低，对溶质无阻滞作用，溶质在溶质无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶此层得到浓缩；下层凝胶浓度高，各组分根据在凝浓度高，各组分根据在凝胶中迁移率的差别得到分胶中迁移率的差别得到分离。离。1415聚丙烯酰胺电泳（聚丙烯酰胺电泳（PAGE）16琼脂糖凝胶的性能、结构与特点其优点如下：其优点如下：其优点如下：其优点如下：n n琼脂糖凝胶孔径较大，琼脂糖凝胶孔径较大，琼脂糖凝胶孔径较大，琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%0.075%琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为800nm800nm，可以分，可以分，可以分，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较低。析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较低。析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较低。析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较低。n n机械强度高：可以在浓度机械强度高：可以在浓度机械强度高：可以在浓度机械强度高：可以在浓度1%1%以下使用；以下使用；以下使用；以下使用；n n无毒；无毒；无毒；无毒；n n染色、脱色程序简单，背景色较低；染色、脱色程序简单，背景色较低；染色、脱色程序简单，背景色较低；染色、脱色程序简单，背景色较低；n n热可逆性；热可逆性；热可逆性；热可逆性；n n生物中性：一般不与生物材料结合；生物中性：一般不与生物材料结合；生物中性：一般不与生物材料结合；生物中性：一般不与生物材料结合；n n电内渗（电内渗（电内渗（电内渗（EEOEEO）大：对于对流电泳有益）大：对于对流电泳有益）大：对于对流电泳有益）大：对于对流电泳有益琼脂糖凝胶的特性：琼脂糖凝胶的特性：琼脂糖凝胶的特性：琼脂糖凝胶的特性：琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖(agarose)(agarose)是从琼脂中精制出来的胶状多糖是从琼脂中精制出来的胶状多糖是从琼脂中精制出来的胶状多糖是从琼脂中精制出来的胶状多糖(gel-forming(gel-forming polysaccharide)polysaccharide)，琼脂又是从天然的红色的墨角藻，琼脂又是从天然的红色的墨角藻，琼脂又是从天然的红色的墨角藻，琼脂又是从天然的红色的墨角藻(red-seaweed)(red-seaweed)中提取出来中提取出来中提取出来中提取出来的。的。的。的。172.22.2载体两性电解质载体两性电解质pHpH梯度等电聚焦梯度等电聚焦n n等电聚焦（等电聚焦（isoelectrofocusingisoelectrofocusing）,IEF,IEF利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的在一个稳定的、连续的、线性的pHpH梯度中进行蛋梯度中进行蛋白质的分离和分析。白质的分离和分析。n n利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。质和两性分子。n n根据建立根据建立pHpH梯度的原理不同，梯度有分为载体两梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（性电解质梯度（Carrier ampholytes pH Carrier ampholytes pH gradientgradient）和固相梯度。）和固相梯度。18工作原理n n蛋白质的等电点蛋白质的等电点蛋白质的等电点蛋白质的等电点蛋白质最主要的特性是它蛋白质最主要的特性是它蛋白质最主要的特性是它蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的带电行为，它们在不同的带电行为，它们在不同的带电行为，它们在不同的的的的pHpH环境中带不同数量环境中带不同数量环境中带不同数量环境中带不同数量的正电或负电，只是在某的正电或负电，只是在某的正电或负电，只是在某的正电或负电，只是在某一一一一pHpH时，蛋白质的净电时，蛋白质的净电时，蛋白质的净电时，蛋白质的净电荷为荷为荷为荷为0 0，此，此，此，此pHpH即为该蛋白即为该蛋白即为该蛋白即为该蛋白的等电点（的等电点（的等电点（的等电点（isoelectric isoelectric point pIpoint pI）。）。）。）。n n蛋白质的等电点取决于它蛋白质的等电点取决于它蛋白质的等电点取决于它蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是的氨基酸组成和构象，是的氨基酸组成和构象，是的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。一个物理化学常数。一个物理化学常数。一个物理化学常数。n n可以利用等电点差异来进可以利用等电点差异来进可以利用等电点差异来进可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析行蛋白质的分离、分析行蛋白质的分离、分析行蛋白质的分离、分析 载体两性电解质载体两性电解质载体两性电解质载体两性电解质pHpH梯度等电聚焦是在支梯度等电聚焦是在支梯度等电聚焦是在支梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两持介质中加入载体两持介质中加入载体两持介质中加入载体两性电解质，通以直流性电解质，通以直流性电解质，通以直流性电解质，通以直流电后在两极之间形成电后在两极之间形成电后在两极之间形成电后在两极之间形成稳定、连续和线性的稳定、连续和线性的稳定、连续和线性的稳定、连续和线性的pHpH梯度，当带电的梯度，当带电的梯度，当带电的梯度，当带电的蛋白质分子进入该体蛋白质分子进入该体蛋白质分子进入该体蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，系时，便会产生移动，系时，便会产生移动，系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等并聚集于相当于其等并聚集于相当于其等并聚集于相当于其等电点的位置。电点的位置。电点的位置。电点的位置。等电聚焦分离示意图等电聚焦分离示意图19等电聚焦示意图20载体两性电解质在电场中形成载体两性电解质在电场中形成pHpH梯度的模式图梯度的模式图n n在没有电场时，载体两性电解质的在没有电场时，载体两性电解质的在没有电场时，载体两性电解质的在没有电场时，载体两性电解质的pHpH值大约是该溶液值大约是该溶液值大约是该溶液值大约是该溶液pHpH范围的平均值，所有载体两性范围的平均值，所有载体两性范围的平均值，所有载体两性范围的平均值，所有载体两性电解质分子都带有荷电。电解质分子都带有荷电。电解质分子都带有荷电。电解质分子都带有荷电。n n当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0 0的位置时才停止，这个位置的位置时才停止，这个位置的位置时才停止，这个位置的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pHpH等于分子本身的等于分子本身的等于分子本身的等于分子本身的pIpI。n n其次，一些低其次，一些低其次，一些低其次，一些低pIpI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到荷减少到荷减少到荷减少到0 0才停止。同样的，其周围环境溶液才停止。同样的，其周围环境溶液才停止。同样的，其周围环境溶液才停止。同样的，其周围环境溶液pHpH值也等于它本身的值也等于它本身的值也等于它本身的值也等于它本身的pIpI。依次类推，所。依次类推，所。依次类推，所。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加有的载体两性电解质分子用增加有的载体两性电解质分子用增加有的载体两性电解质分子用增加pIpI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个的位置，从而给出一个的位置，从而给出一个的位置，从而给出一个pHpH梯度。梯度。梯度。梯度。21IEF特点特点n受溶质扩散影响小，受溶质扩散影响小，IEF可消除分子扩散引可消除分子扩散引起的分离度下降。起的分离度下降。n两性电解质的加入对产品产生两性电解质的加入对产品产生污染污染；npH梯度梯度稳定性稳定性不高；不高；n操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象；操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象；222.3二维电泳n n第一相第一相 等电聚焦n n第二相第二相 SDSPAGE目的：为了获得更详细的组分信息目的：为了获得更详细的组分信息目前已经广泛应用于蛋白质组研究中目前已经广泛应用于蛋白质组研究中23二维电泳原理二维电泳原理 在凝胶电泳槽的在凝胶电泳槽的y方向上具有浓度分布，而在方向上具有浓度分布，而在x方向上首先调配方向上首先调配pH值梯度，使溶质分子以等电点聚值梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当pH值的缓值的缓冲液渗透到凝胶中，在冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质再次方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分子量泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分子量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之间得到进一步分离。间得到进一步分离。二维电泳凝胶电泳等电点聚焦242526二维电泳特点二维电泳特点n分离度高，可分离等电点相差分离度高，可分离等电点相差0.01个个pH值的值的蛋白质；蛋白质；n处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产物，用于科学研究；物，用于科学研究；27凝胶电泳系统主要包括u电泳仪u电泳槽u附属设备3 电泳系统电泳系统28(1)常常压压电电泳泳仪仪(600V)：主主要要用用于于SDS-聚聚丙丙烯烯酰胺凝胶电泳；酰胺凝胶电泳；(2)高高压压电电泳泳仪仪(3000V)：用用于于载载体体两两性性电电解解质质等电聚焦电泳和等电聚焦电泳和DNA测序；测序；(3)超超高高压压电电泳泳仪仪(30000-50000V)：用用于于毛毛细细管管电泳。电泳。3.1 电泳仪电泳仪根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：29(1)自由界面电泳槽自由界面电泳槽Tiselius设设计计的的自自由由界界面面电电泳泳槽槽是是一一个个U形形玻玻璃璃管管，在在U形形管管下下部部放放待待分分离离的的蛋蛋白白溶溶液液，管管臂臂联联接接到到电电极极上上，在在电电场场的的作作用用下下，缓缓冲冲系系统统中中蛋蛋白白质质界界面面的的移移动动可可用用光光学学法法照照相相，得得到到电电泳泳图图谱谱。这种电泳槽目前已不使用。这种电泳槽目前已不使用。3.2 电泳槽电泳槽电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。电极电极U形管Tiselius自由界面电泳装置示意图自由界面电泳装置示意图30(2)圆盘电泳圆盘电泳50年年代代末末商商品品圆圆盘盘电电泳泳槽槽问问世世。圆圆盘盘电电泳泳槽槽有有上上下下两两个个电电泳泳槽槽和和带带有有铂铂金金电电极极的的盖盖，电电泳泳槽槽具具有有若若干干个个孔孔，可可插插电电泳泳管管。将将丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶贮贮液液装装在在玻玻璃璃管管内内，凝凝胶胶在在电电泳泳管管中中聚聚合合成成柱柱状状胶胶条条，样样品品经经电电泳泳分分离离，蛋蛋白白区区带带染染色色后后呈呈圆圆盘盘状状，因因而而称称圆圆盘盘电电泳泳(disc electrophoresis)。圆盘电泳聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.331(3)板状电泳槽板状电泳槽 板板状状电电泳泳槽槽是是目目前前使使用用最最多多的的电电泳泳槽槽，是是将将凝凝胶胶灌灌装装在在两两块块平平行行的的玻玻璃璃板板中中间间，因因而而称称板板状状电电泳泳(slab electrophoresis)。板板状状电电泳泳的的最最大大优优点点是是包包括括标标准准相相对对分分子子质质量量蛋蛋白白在在内内的的多多个个样样品品可可在在同同一一块块凝凝胶胶上上在在相相同同的的条条件件下下进进行行电电泳泳，便便于于利利用用各各种种鉴鉴定定方方法法，直直接接比比较较各各样样品品的的区区带带，保保证证结结果果的的准准确确可可靠靠；还还可可进进行行双双向向电电泳泳。另另外外，板板胶胶电电泳泳时时产产生生的的热热量量容容易易消消散散，凝凝胶胶电电泳泳结结果果便便于于照照相相和和制制成成干干胶胶。板板状状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。垂板电泳槽垂板电泳槽图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统32平板电泳槽平板电泳槽双向电泳槽双向电泳槽适用于将凝胶电泳的图谱转移到固相转移膜上33 随随着着电电泳泳技技术术的的发发展展，电电泳泳技技术术的的种种类类逐逐渐渐增增加加，凝凝胶胶电电泳泳在在制制胶胶、电电泳泳系系统统的的冷冷却却、凝凝胶胶染染色色及及结结果果分分析析等等方方面面手手段段日日趋趋完完善善，科科学学家家们们研研制制出出各各种种电电泳泳附附属属设设备备，如如梯梯度度混混合合仪仪、外外循循环环恒恒温温系系统统、脱脱色色仪仪、凝凝胶胶干干燥燥系系统统、凝凝胶胶扫扫描描仪、凝胶成像仪等。仪、凝胶成像仪等。3.3 附属设备附属设备用于对各种凝胶和放射自显影胶片、印记杂交片的分析凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统 34毛细管电泳仪35 目目前前最最常常用用的的电电泳泳操操作作模模式式是是区区带带电电泳泳中中的的聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳和和琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳，前前者者主主要要用用于于蛋蛋白白质质的的分分离离鉴鉴定定，后后者者主主要要于于核核酸酸的的分分析析鉴鉴定定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。4 电泳的操作模式电泳的操作模式36电泳流程n n制胶：溶液配制（丙烯酰胺、制胶：溶液配制（丙烯酰胺、N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解质等），灌胶；质等），灌胶；n n电泳：加样可在凝胶上的任何位置，电泳：加样可在凝胶上的任何位置，浓度一般为浓度一般为0.52mg/ml0.52mg/ml；n n固定：固定：n n染色：染色：n n脱色：脱色：37习题习题n n电泳的概念电泳的概念n n电泳技术的分类电泳技术的分类n n常用的凝胶电泳技术有哪些？常用的凝胶电泳技术有哪些？n n电泳装置的基本组成电泳装置的基本组成n n聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程n nSDS-PAGESDS-PAGE电泳的基本原理及过程电泳的基本原理及过程n n琼脂糖电泳的特点及其应用琼脂糖电泳的特点及其应用n n等电聚焦及其特点等电聚焦及其特点38 例子：例子：血血 清清 蛋蛋 白白 醋醋 酸酸 纤纤 维维 薄薄 膜膜 电电 泳泳目的：1.1.掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.2.熟悉电泳仪器的使用和操作熟悉电泳仪器的使用和操作原 理：血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，分子大小、形状各有差异。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分离成。A、1、2、五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进行比色测定，计算各区带的百分数。39实验操作步骤及注意点实验操作步骤及注意点1、准备与点样1）将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端 2cm 处点样（膜不能折；在膜上标记记号）。2）用点样器蘸血清少许（不能看见有液滴形成），按在点样处（点样要与膜边缘垂直，且大小均匀）。2、电泳将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极紧密接触（不能留有气泡），平衡5min。通电，电压100V,时间1h。3、染色电泳结束，将膜放入氨基黑 10B 染色，3min 后取出，漂洗，反复几次，至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。404、定量1）取 6 支试管并编号，分别加入 0.4N 氢氧化钠 4ml。2）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带将各条带浸入试管，不时摇动，洗脱蓝色。3）光光度计比色，波长为 650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取其它 5 管的光密度值。5、计算总吸光度 光密度总和 TA12 各部分蛋白质的百分数：蛋白质A/T10041 结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日