分子杂交与印迹技术课件

一、分子杂交和印迹技术一、分子杂交和印迹技术（一）分子杂交和印迹技术的基本原理；（一）分子杂交和印迹技术的基本原理；（二）影响分子杂交的因素；（二）影响分子杂交的因素；（三）核酸探针（三）核酸探针（四）分子杂交和印迹技术的种类及应用（四）分子杂交和印迹技术的种类及应用一、分子杂交和印迹技术1掌握分子杂交及印迹技术的基本原理，分掌握分子杂交及印迹技术的基本原理，分子杂交、探针的概念。子杂交、探针的概念。熟悉探针的来源，选择探针的基本原则，熟悉探针的来源，选择探针的基本原则，寡核苷酸探针的选择要求，探针的同位素寡核苷酸探针的选择要求，探针的同位素标记及非同位素标记的特点及种类。核酸标记及非同位素标记的特点及种类。核酸分子杂交种类，分子杂交种类，Southern Blot、Northern Blot的基本原理、过程及区别的基本原理、过程及区别。了解影响杂交反应的因素，各种杂交条件了解影响杂交反应的因素，各种杂交条件的选择。的选择。掌握分子杂交及印迹技术的基本原理，分子杂交、探针的概念。2核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)分子杂交以分子杂交以分子杂交以分子杂交以DNADNA的变性和复性为理论基础的变性和复性为理论基础的变性和复性为理论基础的变性和复性为理论基础。DNA在某在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由双链变成单链的过程谓之的过程谓之DNADNA变性变性变性变性。变性。变性DNA的单链重新合成双链的过的单链重新合成双链的过程为程为DNADNA的复性的复性的复性的复性。分子杂交是分子杂交是不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。双链的过程。双链的过程。双链的过程。在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同的分子之间形成同的分子之间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的基本原理一、分子杂交与印迹技术的基本原理核酸分子杂交(nucleic acid hybridiza3DNA的变性的变性(denaturation)定义定义：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解开双链解开成两条单链的过程。成两条单链的过程。本质：只改变二级结构，不改变核苷酸排列本质：只改变二级结构，不改变核苷酸排列方法：方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。变性后其它理化性质变化：变性后其它理化性质变化：OD260增高增高粘度下降粘度下降比旋度下降比旋度下降浮力密度升高浮力密度升高酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失目目 录录DNA的变性(denaturation)定义：在某些理化因素4DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂5例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增增色色效效应应：DNA变变性性，由由于于解解链链使使更更多多的的共共轭轭双双键键暴暴露露，使使其其溶溶液液OD260增增高高，并并与与解解链链程程度度有有一一定定的的比比例例关关系系的的现现象。象。目目 录录例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：D6热变性热变性解解链链曲曲线线：如如果果在在连连续续加加热热DNADNA的的过过程程中中以以温温度度对对A260A260（absorbanceabsorbance，A A，A260A260代代表表溶溶液液在在260nm260nm处处的的吸吸光光率率）值值作作图图，所所得得的的曲线称为解链曲线曲线称为解链曲线。目目 录录 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成。变性是在一个相当窄的温度范围内完成。在在DNA变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%（一半）（一半）时的温度称为时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度的解链温度，又称融解温度(melting temperature,Tm)。其大小与。其大小与G+C含量成正比。含量成正比。G、C含量越高，含量越高，Tm越大；越大；DNA越长，越长，Tm越大；溶液的越大；溶液的离子强度增高，离子强度增高，Tm增加。增加。在在Tm时，有一半的时，有一半的DNA双链被打开双链被打开热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A2607DNA的复性与分子杂交的复性与分子杂交 DNA复性复性(renaturation)的定义的定义在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可恢的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性复性。减色效应减色效应DNA复性时，其溶液复性时，其溶液OD260降低。降低。热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing)。目目 录录DNA的复性与分子杂交 DNA复性(renaturati8变性和复性的应用：核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)在在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类变性后的复性过程中，如果将不同种类的的DNA单链分子或单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成可以在不同的分子间形成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的这种杂化双链可以在不同的DNA与与DNA之间形之间形成，也可以在成，也可以在DNA和和RNA分子间或者分子间或者RNA与与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。变性和复性的应用：核酸分子杂交(hybridization)9复性复性RNADNA复性RNADNA10二、影响杂交的因素二、影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度浓度大，复性快；分子量大，复性慢浓度大，复性快；分子量大，复性慢温度温度离子强度离子强度杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性核酸分子的复杂性非特异性杂交反应非特异性杂交反应二、影响杂交的因素核酸分子的浓度和长度11三、核酸探针三、核酸探针*探针探针(probe)概念概念 一一小小段段用用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标标标记记其其末末端端或或全全链链的的已已已已知知知知序序序序列列列列的的的的多多多多聚聚聚聚核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸，与与固固定定在在NC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，判判断断是是否否有有同同源源的的核核酸酸分分子子存存在。在。探针的种类探针的种类 基因组基因组DNA探针；探针；cDNA 探针；探针；RNA探针；寡核苷酸探针。探针；寡核苷酸探针。三、核酸探针*探针(probe)概念 12基因组基因组基因组基因组DNADNA探针：探针：探针：探针：为某一基因的全部或部分序列；为某一基因的全部或部分序列；为某一基因的全部或部分序列；为某一基因的全部或部分序列；制备制备制备制备：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌 体连接，基因克隆后酶切获得。体连接，基因克隆后酶切获得。体连接，基因克隆后酶切获得。体连接，基因克隆后酶切获得。PCR PCR扩增基因组扩增基因组扩增基因组扩增基因组DNADNA片段片段片段片段 注意：真核基因使用编码序列（外显子）作注意：真核基因使用编码序列（外显子）作注意：真核基因使用编码序列（外显子）作注意：真核基因使用编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。DNADNA探针的优点：探针的优点：探针的优点：探针的优点：制备方法简单；相对制备方法简单；相对制备方法简单；相对制备方法简单；相对RNARNA而言而言而言而言DNADNA探针不易降解；探针不易降解；探针不易降解；探针不易降解；DNA DNA探针的标记方法较成熟探针的标记方法较成熟探针的标记方法较成熟探针的标记方法较成熟基因组DNA探针：13cDNA探针：探针：cDNAcDNA上指点互补上指点互补上指点互补上指点互补mRNAmRNA的的的的DNADNA分子分子分子分子优点：不含内含子和高度重复序列优点：不含内含子和高度重复序列优点：不含内含子和高度重复序列优点：不含内含子和高度重复序列 但不易获得但不易获得但不易获得但不易获得.RNA探针探针单链单链RNA分子分子优点优点优点优点:无互补双链的竟争无互补双链的竟争无互补双链的竟争无互补双链的竟争,杂交效率高杂交效率高杂交效率高杂交效率高,稳定性高稳定性高稳定性高稳定性高 不存在重复序列不存在重复序列不存在重复序列不存在重复序列,非特异性杂交较少非特异性杂交较少非特异性杂交较少非特异性杂交较少 可用可用可用可用RNaseRNase将未杂交的探针水解将未杂交的探针水解将未杂交的探针水解将未杂交的探针水解,减少本底干扰减少本底干扰减少本底干扰减少本底干扰.但：易降解；标记复杂但：易降解；标记复杂但：易降解；标记复杂但：易降解；标记复杂应用应用应用应用:检测检测检测检测DNADNA、mRNAmRNA；观察基因转录及真核基因的；观察基因转录及真核基因的；观察基因转录及真核基因的；观察基因转录及真核基因的表达调控表达调控表达调控表达调控cDNA探针：14寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针优点优点优点优点：根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的不利影响不利影响不利影响不利影响 链短（链短（链短（链短（1050bp)1050bp)1050bp)1050bp)、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需时间短（短于克隆探针）时间短（短于克隆探针）时间短（短于克隆探针）时间短（短于克隆探针）能识别序列内能识别序列内能识别序列内能识别序列内1 1 1 1个碱基的变化，明显降低杂交的个碱基的变化，明显降低杂交的个碱基的变化，明显降低杂交的个碱基的变化，明显降低杂交的TmTmTmTm值值值值 可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记设计原则设计原则设计原则设计原则 长度：长度：长度：长度：1050bp1050bp1050bp1050bp（过长，合成困难、杂交时间长；过短，（过长，合成困难、杂交时间长；过短，（过长，合成困难、杂交时间长；过短，（过长，合成困难、杂交时间长；过短，特异性差）特异性差）特异性差）特异性差）G+C G+C G+C G+C含量：含量：含量：含量：4060%4060%4060%4060%探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构 避免同一碱基重复出现多于避免同一碱基重复出现多于避免同一碱基重复出现多于避免同一碱基重复出现多于4 4 4 4个个个个 一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，若与非靶基因序列有若与非靶基因序列有若与非靶基因序列有若与非靶基因序列有70%70%70%70%以上的同源性，应重新设计以上的同源性，应重新设计以上的同源性，应重新设计以上的同源性，应重新设计寡核苷酸探针15DNA探探针针通通常常为为400500个个碱碱基基，在在探探针标记过程中可调整针标记过程中可调整DNA探针的长度。探针的长度。RNA探针探针的长度的长度 相对就不那么易控制相对就不那么易控制 探针的长度探针的长度探针太短，可与多个位点杂交降低特异性探针太短，可与多个位点杂交降低特异性探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性。探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性。F=(1/4)L 2NF值：探针和靶序列杂交的可能频率值：探针和靶序列杂交的可能频率L：探针的核苷酸数目（长度）：探针的核苷酸数目（长度）N：靶序列的复杂性：靶序列的复杂性 DNA和和RNA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针DNA探针通常为400500个碱基，在探针标记过程中可调整16探针的标记探针的标记标记物标记物核素标记物（同位素标记）：核素标记物（同位素标记）：核素标记物（同位素标记）：核素标记物（同位素标记）：3232P P、3535S S、3 3H H等等等等非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等高辛、荧光素等高辛、荧光素等高辛、荧光素等一个理想的探针标记物：一个理想的探针标记物：具有高度灵敏性具有高度灵敏性具有高度灵敏性具有高度灵敏性标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对检测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环检测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环检测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环检测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环境污染少、价格低境污染少、价格低境污染少、价格低境污染少、价格低若用酶学方法标记时，对酶的若用酶学方法标记时，对酶的若用酶学方法标记时，对酶的若用酶学方法标记时，对酶的KmKmKmKm值影响小，也不值影响小，也不值影响小，也不值影响小，也不影响下一步酶促反应影响下一步酶促反应影响下一步酶促反应影响下一步酶促反应探针的标记标记物17可准确定量，灵敏度高可检测固相介质可准确定量，灵敏度高可检测固相介质上上10fg(10-15g)的的DNA本底低，易除去旧探针重新杂交新探针本底低，易除去旧探针重新杂交新探针特异性高特异性高,对杂交无影响对杂交无影响放射性标记放射性标记-应用最多的一类应用最多的一类优点优点缺点缺点短半衰期的探针要求临时制备短半衰期的探针要求临时制备,随用随标随用随标放射性递减使探针降解放射性递减使探针降解放射性对人体有害放射性对人体有害,需防护需防护费用贵费用贵可准确定量，灵敏度高可检测固相介质上10fg(10-15g)18无放射性，对人体的危害小无放射性，对人体的危害小探针性质稳定，可供长时间内持续使用探针性质稳定，可供长时间内持续使用检测过程快，可同时进行不同标记探针检测过程快，可同时进行不同标记探针的杂交的杂交本底较低本底较低 非放射性标记非放射性标记优点优点缺点缺点灵敏度和特异性不如放射性探针灵敏度和特异性不如放射性探针杂交条件受到报告基团的限制杂交条件受到报告基团的限制重新杂交新探针较困难重新杂交新探针较困难 无放射性，对人体的危害小非放射性标记优点缺点灵敏度和特异性不19生物素生物素地高辛地高辛荧光素：荧光素：FITC，罗丹明，罗丹明化学发光物：如化学发光物：如ECL光密度或电子密度标记物光密度或电子密度标记物碱性磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)非放射性标记物种类非放射性标记物种类生物素非放射性标记物种类20探针标记方法探针标记方法缺口平移法缺口平移法缺口平移法缺口平移法(nick translation)(nick translation)随机引物法随机引物法随机引物法随机引物法(random primer)(random primer)：六核苷酸残：六核苷酸残：六核苷酸残：六核苷酸残基的引物基的引物基的引物基的引物PCRPCR标记法标记法标记法标记法末端标记法末端标记法末端标记法末端标记法探针纯化探针纯化探针标记方法21四、印迹技术的类别及应用四、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。（二）二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究用于蛋白质定性定量及相互作用研究。四、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southe22 （四）（四）其他其他斑点印迹斑点印迹斑点印迹斑点印迹(dot blotting)dot blotting)原位杂交原位杂交原位杂交原位杂交(in situ hybridization)(in situ hybridization)DNADNA点阵点阵点阵点阵 (DNA array)(DNA array)DNADNA芯片技术芯片技术芯片技术芯片技术 (DNA chip)(DNA chip)（四）其他23分子杂交实验分子杂交实验目目 录录分子杂交实验目 录24分子杂交与印迹技术课件25(一一)Southern 印迹杂交印迹杂交1975年，英国年，英国Southern创建创建DNA/DNA杂交，即将杂交，即将DNA电泳、转印到固电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。相支持物上，用探针进行检测的方法。(一)Southern 印迹杂交1975年，英国Sout26Southern 杂交杂交(Southern bloting)的主要步骤的主要步骤待测待测DNA样品的制备、酶切样品的制备、酶切待测待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中凝胶中DNA的变性：碱变性的变性：碱变性Southern转膜：转膜：硝酸纤维素硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备探针的制备 Southern杂交杂交杂交结果的检测杂交结果的检测Southern 杂交(Southern bloting)的27Southern印迹杂交法印迹杂交法M1 210SSC 转转移缓冲液移缓冲液Whatman滤纸滤纸凝胶凝胶Whatman滤纸滤纸纸巾纸巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2与探针同源杂交的与探针同源杂交的基因基因DNA片段片段基因组基因组DNADNA酶切片段酶切片段内切酶内切酶NC或尼龙膜或尼龙膜NC膜或尼龙膜膜或尼龙膜Southern印迹杂交法M1210SSC 转移缓冲液28分子杂交与印迹技术课件29分子杂交与印迹技术课件30(二二)Northern 印迹杂交印迹杂交(Northern bloting)检测检测RNA（主要是（主要是mRNA）的方法）的方法与与Southern杂交的不同杂交的不同靶核酸：靶核酸：靶核酸：靶核酸：RNARNARNARNA电泳电泳电泳电泳转膜：不需变性转膜：不需变性转膜：不需变性转膜：不需变性(二)Northern 印迹杂交(Northern b31Northern印迹杂交RNARNA的提取的提取由于由于RNase具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止具有活性高、不易灭活的特点，在提取中必须防止RNase对对RNA的降解作用。细胞裂解液的降解作用。细胞裂解液异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍可以抑制此酶活性。可以抑制此酶活性。RNARNA变性电泳变性电泳电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使电泳前应加变性剂，如甲醛、乙二醛等使RNA二级结构解体，才能使二级结构解体，才能使RNA严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进严格按相对分子质量大小分离。变性剂还可促进RNA与硝酸纤维素膜结合。与硝酸纤维素膜结合。印迹转移印迹转移若待测的若待测的RNA片段较大，可预先将凝胶置于片段较大，可预先将凝胶置于0.05mol/L NaOH中浸泡中浸泡20 min min，以水解成较小的片段，再用以水解成较小的片段，再用20 xSSC浸泡浸泡45 min min，以加快，以加快RNA的印迹转移。的印迹转移。预杂交预杂交杂交杂交洗膜洗膜放射自显影或化学显色放射自显影或化学显色Northern印迹杂交RNA的提取由于RNase具有活性高32(三三)Western 杂交印迹法杂交印迹法(Western(Western bloting)bloting)检测蛋白质检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤：主要步骤：蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)(PAGE)电泳电泳电泳电泳蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：蛋白质的电转移：NCNC膜膜膜膜靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测靶蛋白的免疫学检测 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应(三)Western 杂交印迹法(Western bloti33Western印迹杂交Western印迹杂交34分子杂交与印迹技术课件35三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较36放放射射自自显显影影照照片片目目 录录放射自显影照片目 录37(四四)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交进行杂交，称为原位杂交。特点特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高靶序列灵敏度高靶序列灵敏度高靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态(四)原位杂交(in situ hybridization)38核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记探针的选择和标记杂交杂交杂交结果检测杂交结果检测核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片39分子杂交与印迹技术课件40分子杂交与印迹技术课件41分子杂交与印迹技术课件42DNA点阵点阵目目 录录DNA点阵目 录43DNA芯片芯片(DNA chip)cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。基因芯片基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)DNA芯片(DNA chip)基因芯片基因芯片(gene 44目目 录录目 录45是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当46分子杂交与印迹技术课件47分子杂交与印迹技术课件48