分子遗传学课件

第一章遗传的物质基础-DNA第一节第一节遗传物质的本质遗传物质的本质第二节第二节DNA的结构和性质的结构和性质第三节第三节DNA变性和复性变性和复性第四节第四节分子杂交分子杂交第一章第一章 遗传遗传的物的物质质基基础础-DNA第一第一节节 遗传遗传物物质质的本的本质质1第一节遗传物质的本质1868年年，瑞瑞士士的的内内科科医医生生Friedrich Miescher从从外外科科医医院院包包扎扎伤伤口口的的绷绷带带上上的的脓脓细细胞胞核核中中提提取取到到一一种种富富含含磷磷元元素素的的酸酸性性化化合合物物，将将其其称称为为核核质质或或核核素素(nuclein)；后后来来他他又又从从鲭鲭鱼鱼精精子子中中分分离离出出类类似似的的物物质质，并并指指出出它它是是由由一一种种碱碱性性蛋蛋白白质质与与一一种种酸酸性性物物质质组组成成的的，此此酸酸性性物物质质即即是是现现在所知的核酸在所知的核酸(nucleic acid)。Friedrich Miescher米歇尔（米歇尔（1844-1895）一、遗传物质的发现第一第一节节 遗传遗传物物质质的本的本质质1868年，瑞士的内科医生年，瑞士的内科医生Fried218891889年年，奥奥尔尔特特曼曼(R.(R.Altmann)Altmann)首首次次提提出出了了核核酸酸(nucleic acid)(nucleic acid)的名称。的名称。1885-19011885-1901年年，KosselKossel等等证证实实核核酸酸由由A A、G G、C C、U U四四种碱基。种碱基。1911-19341911-1934年年 LeveneLevene等等 确确定定了了核核酸酸有有两两种种，一一种种是是脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸(DNA)(DNA)，另另一一种种是是核核糖糖核核酸酸(RNA)(RNA)。证证实实核核酸酸由由不不同同的的碱碱基基组组成成。其其最最简简单单的的单单体体结结构构是是碱碱基基-核核糖糖-磷磷酸酸构构成成的的核苷酸。核苷酸。科赛尔（科赛尔（1853-1927）列文列文(1869-1940)1889年，奥年，奥尔尔特曼特曼(R.Altmann)首次提出了核酸首次提出了核酸(3核酸是遗传物质核酸是遗传物质遗传物质必须具备哪些特点？1)在体细胞中含量稳定；2)在生殖细胞中含量减半；3)能携带遗传信息；4)能精确地自我复制；5)能发生变异；核核 酸酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。，携带和传递遗传信息。核核 酸酸(nucleic acid)是以核苷酸是以核苷酸为为基本基本组组成成单单41.1.遗传物质的主要载体遗传物质的主要载体-染色体。染色体。（通通过过对对细细胞胞有有丝丝分分裂裂、减减数数分分裂裂和和受受精精过过程程的的研研究究，人人们们了了解解到到染染色色体体在在生生物物的的传传宗宗接接代代过过程程中中，能能够够保保持持一一定定的的稳稳定定性性和和连连续续性性。因因此此，人人们们认认为为染染色色体体在在遗遗传传上上起起着着主主要要作作用。）用。）2.2.2.2.DNADNADNADNA是是是是主主主主要要要要的的的的遗遗遗遗传传传传物物物物质质质质-除除了了少少数数的的RNARNA病病毒毒之之外外，DNADNA几几乎乎是是所有生物遗传信息的携带者所有生物遗传信息的携带者。(染染色色体体的的主主要要成成分分是是DNADNA和和组组蛋蛋白白，虽虽然然这这两两种种成成分分都都在在基基因因功功能能上上起起着着重重要要的的作作用用，但但多多数数证证据据证证明明，基基因因的的主主要要特特性由性由DNADNA决定，或者说遗传信息贮存在决定，或者说遗传信息贮存在DNADNA中中)。3.3.DNADNA是遗传物质的证据。是遗传物质的证据。如如果果DNA确确是是遗遗传传物物质质,那那么么能能不不能能把把DNA和和蛋蛋白白质质分分开开，单单独独观观察察DNA的的作作用用呢呢？这这些些实实验验已已在在微微生生物物中中做做了了,证证明明遗传物质确是遗传物质确是DNA（或（或RNA）。证据：证据：遗传遗传物物质质的主要的主要载载体体-染色体。染色体。证证据：据：56Frederick Griffith格里菲斯格里菲斯(1879-1941)利用肺炎双球菌感染小利用肺炎双球菌感染小鼠的一系列生物学实验，鼠的一系列生物学实验，发现了一种可以在细菌发现了一种可以在细菌之间转移的遗传分子之间转移的遗传分子，即即转化因子转化因子格里菲斯实验格里菲斯实验n1928年Frederick Griffith 转化实验6Frederick Griffith 利用肺炎双球菌感染小利用肺炎双球菌感染小67 1944年年Avery等等人人通通过过肺肺炎炎球球菌菌转转化化实实验验证证明明DNA是是携携带带遗遗传信息的分子传信息的分子Oswald Theodore Avery埃弗里（埃弗里（1877-1955）DNA分子中贮存着遗传信息分子中贮存着遗传信息7Oswald Theodore AveryDNA分子中分子中贮贮存存7人们仍不相信DNA是遗传物质,这是由于：（1）因认为蛋白分子量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA分子量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。人人们们仍不相信仍不相信DNA是是遗传遗传物物质质,这这是由于：（是由于：（1）因）因认为认为蛋白分蛋白分81952年年，Hershey 和和 Chase 完成噬噬菌菌体体感感染染实实验验1952年，年，Hershey 和和 Chase 完成噬菌体感染完成噬菌体感染实实910RNA也是遗传物质也是遗传物质1956年吉尔年吉尔(A.Gierer)和施拉姆和施拉姆(G.Schraman)发发现烟草花叶病毒现烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus,TMV）的的遗传物质是遗传物质是RNA1957年美国的弗伦克尔年美国的弗伦克尔-康拉特康拉特(Fraenkel-Conrat)和和B.Singre用病毒重建实验证实了这一结论用病毒重建实验证实了这一结论Heinz Ludwig Fraenkel-ConratAlfred Gierer 10Heinz Ludwig Fraenkel-Conrat1011 烟草花叶病毒是一种烟草花叶病毒是一种RNA病毒，不含病毒，不含DNA，它，它有一个圆筒状的蛋白质外有一个圆筒状的蛋白质外壳，由壳，由2130个相同的亚基个相同的亚基组成，内有一条组成，内有一条RNA分子，分子，沿着内壁在蛋白质亚基之沿着内壁在蛋白质亚基之间盘旋间盘旋 11 烟草花叶病毒是一种烟草花叶病毒是一种RNA病毒，不含病毒，不含DNA1118891889年年，奥奥尔尔特特曼曼(R.(R.Altmann)Altmann)首首次次提提出出了了核核酸酸(nucleic acid)(nucleic acid)的名称。的名称。1885-19011885-1901年年，KosselKossel等等证证实实核核酸酸由由A A、G G、C C、U U四四种碱基。种碱基。1911-19341911-1934年年 LeveneLevene等等 确确定定了了核核酸酸有有两两种种，一一种种是是脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸(DNA)(DNA)，另另一一种种是是核核糖糖核核酸酸(RNA)(RNA)。证证实实核核酸酸由由不不同同的的碱碱基基组组成成。其其最最简简单单的的单单体体结结构构是是碱碱基基-核核糖糖-磷磷酸酸构构成成的的核苷酸。核苷酸。科赛尔（科赛尔（1853-1927）列文列文(1869-1940)二、DNA和RNA的化学组成1889年，奥年，奥尔尔特曼特曼(R.Altmann)首次提出了核酸首次提出了核酸(121929年Levene和London提出四核苷酸假说：“不同DNA的成分都是相同的”。1948年 Alfred Mirsky，Hars Ris R.Vendrely，A.Boivin两组学者分别发现不同的生物体细胞中DNA的含量都是其配子中的两倍。1950英Chargaff对各种生物DNA的碱基组成进行了定律测定，发现DNA的“当量规律”即：嘌呤的总含量和嘧啶的总含量相等；且不同生物DNA碱基组成有明显差异。否定了四核苷酸假说，提示了A-T、G-C 互补的可能性。1929年年Levene和和London提出四核苷酸假提出四核苷酸假说说：“不同不同1314核酸的分类及分布核酸的分类及分布 存在于细胞核和线粒体内。存在于细胞核和线粒体内。存在于胞核、胞液和线粒体。存在于胞核、胞液和线粒体。(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的遗传型体的遗传型(genotype)。参与遗传信息的复制与表达。参与遗传信息的复制与表达。某些病毒某些病毒RNA也可作为遗传信也可作为遗传信息的载体。息的载体。核核 酸酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。带和传递遗传信息。14核酸的分核酸的分类类及分布及分布 存在于存在于细细胞核和胞核和线线粒体内。存在于胞核粒体内。存在于胞核1415核酸的基本组成单位是核苷酸核酸的基本组成单位是核苷酸(nucleotide)碱基碱基戊糖戊糖磷酸磷酸核苷酸核苷酸核苷核苷核酸核酸DNA的基本组成单位是的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸。RNA的基本组成单位是的基本组成单位是核糖核苷酸核糖核苷酸。元素组成：元素组成：C、H、O、N、PP元素的含量较多并且恒定，约占元素的含量较多并且恒定，约占911%。15核酸的基本核酸的基本组组成成单单位是核苷酸位是核苷酸(nucleotide)碱基戊碱基戊1516嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 碱基碱基腺嘌呤（腺嘌呤（A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）胞嘧啶（胞嘧啶（C）胸腺嘧啶胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（尿嘧啶（U）DNA、RNA均有均有DNA有有RNA有有每种核酸都含有四种碱基每种核酸都含有四种碱基。（一）碱（一）碱 基基16嘌嘌呤呤 嘧啶嘧啶 碱基腺碱基腺嘌嘌呤（呤（A）鸟鸟嘌嘌呤（呤（G）胞）胞嘧啶嘧啶（C）胸腺）胸腺1617嘧啶嘧啶嘌呤嘌呤17嘧啶嘧啶嘌嘌呤呤17除除了了上上述述五五类类基基本本的的碱碱基基外外，核核酸酸中中还还有有一一些些含含量量甚甚少少的的碱碱基基，称称为为稀稀有有碱碱基基。稀稀有有碱碱基基种种类类极极多多，大大多多数数都都是是甲甲基基化化碱碱基基。tRNA中中含含有有较多的稀有碱基。较多的稀有碱基。18生物体内游离存在的嘌呤碱基生物体内游离存在的嘌呤碱基稀有碱基稀有碱基除了上述五除了上述五类类基本的碱基外，核酸中基本的碱基外，核酸中还还有一些含量甚少的碱基，称有一些含量甚少的碱基，称为为18五五种种碱碱基基都都能能形形成成酮酮式式-烯烯醇醇式式或或氨氨基基-亚亚氨氨基基的的互互变变异异构构。这这两两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。19 五种碱基都能形成五种碱基都能形成酮酮式式-烯烯醇式或氨基醇式或氨基-亚亚氨基的互氨基的互变变异构。异构。这这两两1920 一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，它们可以取代一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，它们可以取代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶和和6-巯基嘌呤巯基嘌呤就常用于治疗某些类型的癌症。就常用于治疗某些类型的癌症。5-氟尿嘧啶相氟尿嘧啶相应的核苷酸类似于胸苷酸，是一种潜在的胸苷酸合成酶的抑应的核苷酸类似于胸苷酸，是一种潜在的胸苷酸合成酶的抑制剂，胸苷酸合成酶是制剂，胸苷酸合成酶是DNA合成所必需的酶。合成所必需的酶。次黄嘌呤次黄嘌呤20 一些合成的一些合成的嘌嘌呤和呤和嘧啶嘧啶具有具有临临床床应应用价用价值值，它，它2021（二）戊（二）戊 糖糖（构成（构成RNA）核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)-D-呋喃核糖呋喃核糖-D-2-脱氧呋喃核糖脱氧呋喃核糖21（二）戊（二）戊 糖（构成糖（构成RNA）核糖）核糖(ribose)（构成（构成DN2122碱基和核糖（或脱氧核糖）通过碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键糖苷键连连接形成接形成核苷核苷（或脱氧核苷）。（或脱氧核苷）。（三）核（三）核 苷（苷（nucleoside）RNA 腺苷、鸟苷腺苷、鸟苷 尿苷、胞苷尿苷、胞苷 DNA 脱氧腺苷、脱氧鸟苷脱氧腺苷、脱氧鸟苷 脱氧胸苷、脱氧胞苷脱氧胸苷、脱氧胞苷 22碱基和核糖（或脱氧核糖）通碱基和核糖（或脱氧核糖）通过过糖苷糖苷键连键连接形成核苷（或脱氧核接形成核苷（或脱氧核2223（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖上核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖上C5相连的羟基被磷酸分子酯化所形成的。相连的羟基被磷酸分子酯化所形成的。23（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide）核苷酸就是核苷的磷核苷酸就是核苷的磷2324一一个个核核苷苷酸酸3 的的羟羟基基与与另另一一个个核核苷苷酸酸5 的的-磷磷酸酸基基团团缩缩合合形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键(phosphodiester bond)多多个个脱脱氧氧核核苷苷酸酸通通过过磷磷酸酸二二酯酯键键构构成成了了具具有有方方向向性性的的线线性性分分子子，称称为为多多聚聚核苷酸，核苷酸，即即DNA链或链或RNA链链（四）核苷酸之间通过（四）核苷酸之间通过3,5-磷酸二酯键连磷酸二酯键连接接24一个核苷酸一个核苷酸3的的羟羟基与另一个核苷酸基与另一个核苷酸5的的-磷酸基磷酸基团缩团缩合合2425交交替替的的磷磷酸酸基基团团和和戊戊糖糖构构成成了了DNA的骨架的骨架(backbone)。DNA链的方向是链的方向是5 3 25交替的磷酸基交替的磷酸基团团和戊糖构成了和戊糖构成了DNA的骨架的骨架(backbone2526脱氧核糖核酸和核糖核酸的比较脱氧核糖核酸和核糖核酸的比较26脱氧核糖核酸和核糖核酸的比脱氧核糖核酸和核糖核酸的比较较2627DNA的一级结构是指脱氧核苷酸之间的连接方式和排列顺序。的一级结构是指脱氧核苷酸之间的连接方式和排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列碱基序列。5533一、一、DNA的一级结构的一级结构第二节第二节 DNA的结构和性质的结构和性质27DNA的一的一级结级结构是指脱氧核苷酸之构是指脱氧核苷酸之间间的的连连接方式和排列接方式和排列顺顺序。序。2728化学式化学式PAPCPGPT或 PA-C-G-T ACGT多聚核苷酸链具有方向性，若不特别注多聚核苷酸链具有方向性，若不特别注明，明，一般规定从一般规定从5端书写至端书写至3端端。线条式线条式文字式文字式双链双链DNA的两条链为反向平行，必须注的两条链为反向平行，必须注明各条链的走向。明各条链的走向。核酸的表示方式核酸的表示方式28化学式化学式PAPCPGPT多聚核苷酸多聚核苷酸链链具有方向性，若不特具有方向性，若不特2829生生物物的的遗遗传传信信息息贮贮存存于于DNA碱碱基基序序列列中中，生生物物界界的的多多样样性性即即寓寓于于DNA分分子子中中的的4种种脱氧核苷酸千变万化的精确排列顺序中。脱氧核苷酸千变万化的精确排列顺序中。基基因因的的遗遗传传信信息息的的物物质质基基础础就就是是4种种碱碱基基的精确排列顺序。的精确排列顺序。可可以以通通过过测测定定DNA序序列列来来研研究究DNA所所载载的的信息及其功能。信息及其功能。DNA一级结构的意义：一级结构的意义：29生物的生物的遗传遗传信息信息贮贮存于存于DNA碱基序列中，生物界的多碱基序列中，生物界的多样样性即寓性即寓2930 根据碱基配对原则，当一条多核苷酸链的序列被确定根据碱基配对原则，当一条多核苷酸链的序列被确定后，即可决定另一条互补链的序列。这就表明，遗传信息后，即可决定另一条互补链的序列。这就表明，遗传信息由碱基的序列所携带。由碱基的序列所携带。DNA碱基配对示意图碱基配对示意图30 根据碱基配根据碱基配对对原原则则，当一条多核苷酸，当一条多核苷酸链链的序列的序列30（一）（一）DNA双螺旋模型的诞生双螺旋模型的诞生Watson&Crick建立双螺旋模型主要是受到建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响：个方面的影响：（1）1938年年W.T.Astbury&Bell用用x衍衍射射技技术术研研究究DNA。1947年年拍摄了第一张拍摄了第一张DNA的衍射照片，并推断的衍射照片，并推断DNA分子的结构是：分子的结构是：柱柱状状；多多核核苷苷酸酸是是一一叠叠扁扁平平的的核核苷苷酸酸；核核酸酸残残基基取取向向和分子长轴垂直，间距为和分子长轴垂直，间距为3.4nm。（2）1951年年Pauling和和Corey运运用用化化学学的的定定律律来来推推理理，而而不不做做具具体体的实验，建立了蛋白质的的实验，建立了蛋白质的-螺旋模型。螺旋模型。（3）晶晶体体学学者者美美J.Donohue&Chargaff的的指指点点纠纠正正起起初初的的同同类类碱基配对的错误构想，而提出互补配对的正确构型。碱基配对的错误构想，而提出互补配对的正确构型。（4）R.Franklin&Wilkins在在1952年底拍得了年底拍得了DNA结晶结晶X衍射照片。衍射照片。二、二、DNA的二级结构的二级结构 双螺旋结构双螺旋结构（一）（一）DNA双螺旋模型的双螺旋模型的诞诞生二、生二、DNA的二的二级结级结构构31（二）双螺旋模型(doublehelixmodel)双螺旋模型有以下特点双螺旋模型有以下特点：（要求）（要求）(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。(2)两条链反向平行其5和3方向相反。(3)双螺旋直径2nm；螺距3.4nm；上下相邻碱基的垂直距离0.34nm，交角为36；每个螺旋有10个碱基对。(4)糖一磷酸链是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。(5)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。(6)碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。(7)DNA双螺旋有大沟(major or wide groove)和 小 沟(minor or narrow groove)的存在。（二）双螺旋模型（二）双螺旋模型(double helix model)双双32模型中的碱基配对有何重要性？（要求）A-T,G-C配对可形成很好的线性氢键；A-T对和G-C对的几何形状一样，使双链中两侧脱氧核糖之间的距离相近，使双螺旋保持均一；碱基对处在同一平面内垂直于对称轴，沿对称轴旋转180仍保持原对称性，不论核苷酸的顺序如何，都不影响双螺旋的结构，其外形都是光滑均匀的圆柱体；模型中碱基对处于同一平面，但实际其存在一个小角度的扭转，称螺旋桨式扭转，使相邻碱基间的重叠面积大，增加了碱基间的堆集力，增强了双螺旋的稳定性；为DNA半保留复制奠定了基础。模型中的碱基配模型中的碱基配对对有何重要性？（要求）有何重要性？（要求）A-T,G-C 配配对对可形成可形成3334（三）（三）DNA二级结构的稳定因素二级结构的稳定因素（要求）（要求）DNA二级结构的稳定因素(1)碱基对之间的氢键。(2)碱基的堆集力。它包括：疏水作用；范德华力；磷酸基的负电荷斥力；(3)核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷34（三）（三）DNA二二级结级结构的构的稳稳定因素（要求）定因素（要求）DNA二二级结级结构的构的稳稳341.两条两条DNA链之间碱基对形成的链之间碱基对形成的氢键氢键（hydrogen bond）：）：使四种碱基形成特异配对关系，使四种碱基形成特异配对关系，G-C间可形成间可形成3对氢键，对氢键，A-T之间有两对氢键之间有两对氢键。虽然氢键是一种弱键，但。虽然氢键是一种弱键，但DNA中氢键中氢键数量多，所以氢键是比较重要的因素。数量多，所以氢键是比较重要的因素。2.碱基堆积力碱基堆积力（base stacking force）：双螺旋结构内部）：双螺旋结构内部碱基层层堆积，形成了一个强大的疏水区，消除了介质中碱基层层堆积，形成了一个强大的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响。水分子对碱基之间氢键的影响。这是维持这是维持DNA双螺旋稳定双螺旋稳定的主要因素。的主要因素。3.介质中的阳离子（如介质中的阳离子（如Na+、K+和和Mg2+）可与磷酸基团上）可与磷酸基团上的负电荷形成的负电荷形成离子键离子键，降低了，降低了DNA链之间的排斥力、范德链之间的排斥力、范德华引力等，有利于双螺旋的稳定。华引力等，有利于双螺旋的稳定。1.两条两条DNA链链之之间间碱基碱基对对形成的形成的氢键氢键（hydrogen b3536DNA二级结构的稳定因素与二级结构的稳定因素与Tm值值(1)碱基对之间的氢键碱基对数越多双链越稳定（Tm越大），在设计PCR引物时，最少16nt，最好为20-24nt(2)碱基堆集力碱基间相互作用强度与相邻碱基之间的环面积成正比，即：嘌呤与嘌呤嘌呤与嘧啶嘧啶与嘧啶即DNA链中嘧啶越多Tm值越低，反之嘌呤越多Tm越高，链越稳定。(3)核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷与介质中盐离子结合屏蔽静电排斥作用，使链稳定盐离子浓度降低，屏蔽减弱，Tm降低盐离子浓度大于生理盐水，随浓度增加，Tm增加36DNA二二级结级结构的构的稳稳定因素与定因素与Tm值值(1)碱基碱基对对之之间间的的氢键氢键36Watson和和Crick所所描描述述的的双双螺螺旋旋结结构构是是B型型DNA，是是在在生生理理条条件件下下（低低浓浓度度盐盐溶溶液液中中）的的构构型型，其其仅仅仅仅是是众众多多DNA双双螺螺旋旋构构象象中中的的一一种种。在在外外界界条条件件的的改改变变下下，双双螺螺旋旋的的构构象象也会改变。也会改变。三、双螺旋结构的构象变异 Watson和和Crick所描述的双螺旋所描述的双螺旋结结构是构是B型型DNA，37（一）DNA构象的类型DNA的构象现已知有：A，B，C，D，E，T，Z 7种。引起DNA双链构象改变有以下因素：（1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度。（一）（一）DNA构象的构象的类类型型38目目前前已已知知DNADNA双双螺螺旋旋结结构构可可分分为为A A、B B、C C、D D及及Z Z型型等等数数种种，除除Z Z型型为为左左手手双双螺螺旋旋外外，其其余余均均为为右右手手双双螺螺旋。旋。Z-DNA B-DNA 目前已知目前已知DNA双螺旋双螺旋结结构可分构可分为为A、B、C、D及及Z型等数种，除型等数种，除3940A，B，Z型型DNA构象的比较构象的比较B型结构：型结构：右手双股螺旋；碱基在右手双股螺旋；碱基在内，戊糖在外，碱基平面垂直内，戊糖在外，碱基平面垂直于螺旋轴；螺旋轴穿过碱基对；于螺旋轴；螺旋轴穿过碱基对；双螺旋每转一周为双螺旋每转一周为10个碱基对；个碱基对；大沟宽而深，小沟窄而浅。大沟宽而深，小沟窄而浅。A型结构：型结构：右手双股螺旋，每圈右手双股螺旋，每圈11个碱基对；碱基平面倾斜个碱基对；碱基平面倾斜20，螺旋轴位于大沟，小沟宽而浅，螺旋轴位于大沟，小沟宽而浅，大沟极深；螺旋变粗变短，螺大沟极深；螺旋变粗变短，螺距距23nm。Z型结构：型结构：左手螺旋，每圈左手螺旋，每圈12个碱个碱基对；碱基平面倾斜基对；碱基平面倾斜9，螺旋，螺旋轴位于小沟，没有大沟，小沟轴位于小沟，没有大沟，小沟窄而深。窄而深。在生理溶液中，在生理溶液中，B-DNA与与Z-DNA可以互变。可以互变。40A，B，Z型型DNA构象的比构象的比较较B型型结结构：右手双股螺旋；碱基构：右手双股螺旋；碱基40分子分子遗传遗传学学课课件件41421.右手螺旋右手螺旋B-DNA:相对湿度相对湿度92%，钠盐，钠盐细胞内主要的存细胞内主要的存 在形式在形式A-DNA:相对湿度相对湿度75%，钠盐，钠盐转录时转录时DNA-RNA 杂交杂交C-DNA:相对湿度相对湿度66%，锂盐，锂盐染色体及某些病染色体及某些病 毒的毒的DNA中中2.左手螺旋左手螺旋Z-DNA：常存在于基因的调控区域，可能与基因：常存在于基因的调控区域，可能与基因 的表达调控有关。的表达调控有关。DNA双螺旋结构的多样性双螺旋结构的多样性421.右手螺旋右手螺旋 DNA双螺旋双螺旋结结构的多构的多样样性性42431972年 Pohl et al 发现 poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变；1979年 Wang A.H-J(王 惠 君),A.Rich对 d(CGCGCG)单晶作X衍射分析提出ZDNA模型（二）（二）Z型型DNA构象构象 u1.Z-DNA的发现：的发现：431972年年 Pohl et al 发现发现 poly(dG43（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。（3）G的糖苷键呈顺式，使G残基位于分子表面。（4）分子外形呈波形。（5）无大小沟区分，沟窄而深。（6）每个螺旋有12bp。u2.Z-DNA的结构特点的结构特点(要求要求)（1）糖磷骨架呈）糖磷骨架呈“之之”字形（字形（Zigzag）走向。）走向。2.Z-D44u3.ZDNA存在的条件：(1)高盐：NaCl2Mol/L,MgCl20.7 Mol/L (2)嘌呤-嘧啶相间排列：现认为在适当的离子存在条件下，任何不少于6个bp的嘌呤-嘧啶交替排列序列都能形成Z-DNA (3)在活细胞中如果m5C（甲基化胞嘧啶）存在，则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下即可产生Z型。(4)在体内多胺化合物，如和亚胺及亚精胺和阳离 子一样，可和磷酸基因结合，减少负电荷的静电排斥作用，使B-DNA转变成 Z-DNA。(5)某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度和微环境，也是活细胞中形成Z-DNA的原因之一。(6)负超螺旋的存在3.ZDNA存在的条件：存在的条件：(1)高高盐盐：NaCl2M45u4.Z-DNA的生物学意义（要求）的生物学意义（要求）(1)可能提供某些调节蛋白的识别位点。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在。(2)在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大大核核有转录活性，小小核核和繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录有关。4.Z-DNA的生物学意的生物学意义义（要求）（要求）(1)可能提供某些可能提供某些调节调节蛋蛋46471957年年G.Felsenfeld等发现在基因的调控区或等发现在基因的调控区或染色质的重组部位有染色质的重组部位有DNA的三螺旋结构的三螺旋结构（三）其它（三）其它DNA二级结构二级结构 u1.三链三链DNA471957年年G.Felsenfeld等等发现发现在基因的在基因的调调控区控区4748u三链三链DNA（triple-strandedDNA）是DNA的一种特殊结构，由第三条寡核苷酸链通过Hoogsteen碱基配对和双螺旋中的一条链以特殊的氢键相连，形成三螺旋结构，又称三链体DNA（triplex DNA）。uHoogsteen碱基配对：1963年K.Hoogsteen发现三链DNA中的碱基能以不同于Watson-Crick配对的构象连接，即A的6-NH2和N-7分别与T的4-O和H-1形成氢键，G与C的配对要求C的N-1是质子化的，G的6-O和N-7分别与C的4-NH2和质子化的N-1形成氢键。u应用：三螺旋DNA的形成可能伴随于DNA转录、复制和重组等过程。如在E.coli重组酶RecA作用中产生三链中间体，又称R-DNA。48三三链链DNA（triple-stranded DNA）48分子分子遗传遗传学学课课件件4950u生物学功能：生物学功能：可能参与端粒可能参与端粒DNA的复制的复制（三）其它（三）其它DNA二级结构二级结构 u2.四链体四链体DNA 是富含是富含G序列的四链序列的四链DNA所形成的一种结构。所形成的一种结构。端粒的单链富含端粒的单链富含G的的3突出端即能形成鸟嘌呤四连体。突出端即能形成鸟嘌呤四连体。u发现：发现：1989年年J.R.Williamson等用等用X射线在射线在体外分析了哺乳动物端粒序列末端的一段体外分析了哺乳动物端粒序列末端的一段150-200nt的单链富含的单链富含G重复序列的晶体，发现其可重复序列的晶体，发现其可形成特殊的四链结构，特别是在具有形成特殊的四链结构，特别是在具有Na+和和K+存存在的情况下。在的情况下。50生物学功能：可能参与端粒生物学功能：可能参与端粒DNA的复制的复制（三）其它（三）其它DNA二二50分子分子遗传遗传学学课课件件51所所谓谓DNA的的三三级级结结构构，是是指指在在一一二二结结构构基基础础上上的的多多聚聚核核苷苷酸酸链链上上的的卷卷曲曲。在在一一定定意意义义上上，DNA双螺旋进一步扭曲盘绕则形成其三级结构。双螺旋进一步扭曲盘绕则形成其三级结构。三三级级结结构构包包括括链链的的扭扭结结和和超超螺螺旋旋或或者者是是单单链链形形成的环或是环状成的环或是环状DNA中的中的连环体。连环体。超螺旋超螺旋是是DNA三级结构的主要形式。三级结构的主要形式。四、四、DNA的三级结构的三级结构 u超螺旋的发现：超螺旋的发现：1965年年J.Vinograd等人在离心分离多瘤病毒的环等人在离心分离多瘤病毒的环形形DNA时，意外发现出现两条带，他认为一条时，意外发现出现两条带，他认为一条是松弛性是松弛性DNA，另一条可能是超螺旋，另一条可能是超螺旋DNA，从，从而发现了而发现了DNA的超螺旋。的超螺旋。所所谓谓DNA的三的三级结级结构，是指在一二构，是指在一二结结构基构基础础上的多聚核苷上的多聚核苷52 slide 53u各种生物DNA的超螺旋现现已已知知道道绝绝大大多多数数原原核核生生物物都都是是共共价价封封闭闭环环状状(covalentlyclosedcircle,CCC)DNA分分子子，这这种种双双螺螺旋旋环环状状分分子子再再度度螺螺旋旋化化成成为为超超螺螺旋旋结结构构(superhelix或或supercoil)。有有些些单单链链环环形形DNA(如如174)或或双双链链线线形形DNA(如如噬噬菌菌体体)，在在其其生生活活周周期期的的某某一一阶阶段段，也也必必将将其其变为变为超螺旋形式超螺旋形式。对对于于真真核核生生物物来来说说，虽虽然然其其染染色色体体多多为为线线形形分分子子但但其其DNA均均与与蛋蛋白白质质相相结结合合，两两个个结结合合点点之之间间的的DNA形形成成一一个个突突环环(loop)结结构构，类类似似于于CCC分分子子，同样具有超螺旋形式同样具有超螺旋形式。slide 53各种生物各种生物DNA的超螺旋的超螺旋 现现已知道已知道绝绝大多数原大多数原53 原原核核生生物物DNADNA的的三三级结构：级结构：绝绝大大多多数数原原核核生生物物的的DNADNA都都是是共共价价封封闭闭的的环环状状双双螺螺旋旋。如如果果再再进进一一步步盘盘绕绕则则形形成成麻麻花花状状的的超超螺螺旋旋三三级结构。级结构。原核生物原核生物DNA的三的三级结级结构：构：54u超螺旋结构的类型松驰型DNA（relax form DNA）超螺旋（Supercoiled DNA）超螺旋结构：正超螺旋 拧紧状态 负超螺旋 拧松状态（天然DNA主要以负超螺旋结构存在，以利于基因的表达）负负超超螺螺旋旋（NegativeSupercoiled）：是指顺时针右手螺旋的DNA双螺旋以相反方向绕它的轴扭转而成，通过这种方式，调节了DNA双螺旋本身的结构，松解了扭曲压力，使每个碱基对的旋转减少，甚至可打乱碱基配对。超螺旋超螺旋结结构的构的类类型松型松驰驰型型DNA（relax form DNA55 slide 56松驰结构松驰结构正超螺旋正超螺旋负超螺旋负超螺旋 slide 56松松驰结驰结构构 正超螺旋正超螺旋 负负超螺旋超螺旋5657 向左捻向左捻向右捻向右捻松弛型松弛型正超螺旋正超螺旋负超螺旋负超螺旋57 向左捻向右捻松弛型正超螺旋向左捻向右捻松弛型正超螺旋负负超螺旋超螺旋57 slide 58超螺旋概念的基本要点是：超螺旋概念的基本要点是：（）初级螺旋处于（）初级螺旋处于松缠或紧缠松缠或紧缠状态；状态；（）与松弛形式相比具有额外的自由能。（）与松弛形式相比具有额外的自由能。这这两两点点实实际际上上是是一一种种物物理理状状态态的的两两种种表表现现。所所有有的的生生物物的的DNA都具有负超螺旋，都具有负超螺旋，它与许多生命过程密切相关。它与许多生命过程密切相关。在在溶溶液液中中和和细细胞胞内内负负超超螺螺旋旋会会部部分分地地转转变变为为单单链链泡泡状状结结构构(下下图图)，这这种种单单链链泡泡状状结结构构也也是是解解除除松松缠缠作作用用造造成成的的胁胁变变的的一一种种途径。途径。slide 58超螺旋概念的基本要点是：超螺旋概念的基本要点是：58 slide 59单链泡状结构单链泡状结构 slide 59单链单链泡状泡状结结构构59 slide 60DNA超螺旋的产生机制超螺旋的产生机制在在原原核核生生物物中中，负负超超螺螺旋旋主主要要由由DNA旋旋转转酶酶(DNAgyrase)引引入入到到已已存存在在的的双双链链封封闭闭环环状状分分子子中中，此此酶酶沿沿拓拓扑扑异异构构复复制制叉叉进进行行移移动动，靠靠解解旋旋酶酶切切断断配配对对碱碱基基，逐逐步步解解开开DNA聚聚合合酶酶前前面面的的双双螺螺旋旋。这这一一过过程程需要水解需要水解ATP以提供能量。以提供能量。在在缺缺乏乏ATP时时，DNA旋旋转转酶酶也也可可使使负负超超螺螺旋旋松松弛弛，但但是是这这个个作作用用与与超超螺螺旋旋化化作作用用比比较较起起来来要要低低10倍倍以以上上。原原核核细细胞胞中中，这这一一过过程程是是由由拓拓扑扑异异构构酶酶I和和其其他他的的拓扑异构酶拓扑异构酶II来负责的。来负责的。slide 60DNA超螺旋的超螺旋的产产生机制生机制60 slide 61在真核生物中，染色體在真核生物中，染色體DNADNA負超螺旋結構被組蛋白負超螺旋結構被組蛋白所固定，細菌染色體所固定，細菌染色體DNADNA負超螺旋結構被類組蛋白負超螺旋結構被類組蛋白（HUHU，HDHD，NS1NS1，NS2 or DNA binding protein NS2 or DNA binding protein）固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合的固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌染色區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌染色體體DNADNA大部份爲鬆弛狀態，但它與大部份爲鬆弛狀態，但它與DNADNA結合蛋白作用結合蛋白作用卻可使卻可使DNADNA裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱古菌已裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱古菌已經找出多種分子量爲經找出多種分子量爲7 7、8 8、1010kDakDa的的DNADNA結合蛋白。結合蛋白。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase):拓扑拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。持物体不变的性质。拓扑异构酶拓扑异构酶：是一类可改变：是一类可改变DNA拓扑性质拓扑性质的酶。对的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。能连接磷酸二酯键。可松弛可松弛DNA超螺旋，超螺旋，有利于有利于DNA解链。解链。slide 61在真核生物中，染色體在真核生物中，染色體DNA負超螺旋結構被組負超螺旋結構被組61 slide 62拓扑异构酶拓扑异构酶I（topoI）:又称切刻又称切刻-封闭酶封闭酶(enicking-closingnzyme)。n在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 蛋白。蛋白。n主要作用是切开主要作用是切开DNA双链中的双链中的单链单链(每次只作用每次只作用一条链一条链)，使，使DNA解链旋转中不打结，解链旋转中不打结，DNA变为变为松弛状态再封闭切口，不需能量因子松弛状态再封闭切口，不需能量因子ATP或或NAD。拓扑异构酶拓扑异构酶IIII（topo II topo II）:n在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶(gyrase)gyrase)。n能切断能切断DNADNA双链双链，使螺旋松弛。在，使螺旋松弛。在ATPATP参与下，参与下，松弛的松弛的DNADNA进入负超螺旋，再连接进入负超螺旋，再连接双链双链断端。断端。slide 62 拓扑异构拓扑异构酶酶I（topo I）:又称又称62 slide 63 slide 6363uDNA超螺旋的产生机制超螺旋的产生机制p在真核细胞中，在真核细胞中，DNA的负超螺旋则主要是染色质的负超螺旋则主要是染色质的的结构造成的。因为结构造成的。因为DNA在组蛋白八聚体外面在组蛋白八聚体外面缠绕的方向有利于缠绕的方向有利于DNA向松缠方向转变。在核小向松缠方向转变。在核小体组装过程中，也肯定有体组装过程中，也肯定有DNA拓扑异构酶参加。拓扑异构酶参加。在许多真核生物中部发现了拓扑异构酶在许多真核生物中部发现了拓扑异构酶和拓扑异和拓扑异构酶构酶II。DNA超螺旋的超螺旋的产产生机制生机制64 slide 65常见的DNA分子形式一一般般以以相相同同核核苷苷酸酸的的线线形形双双螺螺旋旋DNA分分子子的的沉沉降降常常数数作为作为1，其他各种分子取相对值。，其他各种分子取相对值。沉降常数与电泳迁移率之间并不完全一致。沉降常数与电泳迁移率之间并不完全一致。I形形DNA：具具有有负负超超螺螺旋旋或或正正超超螺螺旋旋的的双双链链封封闭闭环环状状分子分子。相对沉降常数。相对沉降常数1.4l。I0形形DNA：没没有有超超螺螺旋旋的的双双链链封封闭闭环环状状分分子子，也也就就是是松弛形式松弛形式(relaxedform)，相对沉降常数，相对沉降常数1.14。II形形DNA：在在一一条条链链上上或或两两条条链链上上有有一一个个或或几几个个切切刻刻的的双双链链环环状状分分子子，又又称称为为切切刻刻环环(nickedcirle)，相相对对沉降常数沉降常数1.14。形形DNA：线形双螺旋分子。相对沉降常数线形双螺旋分子。相对沉降常数1.00。slide 65常常见见的的DNA分子形式一般以相同核苷酸的分子形式一般以相同核苷酸的线线形形65坍坍缩缩DNA(collapsedDNA)：当当I形形成成I0形形DNA在在碱碱变变性性或或热热变变性性时时，其其氢氢键键断断裂裂，而而两两条条链链无无法法分分离离，结结果果生生成成两两条条链链紧紧密密缠缠结结的的分分子子。坍坍缩缩DNA具具有有异异常高的沉降常数，相对沉降常数约常高的沉降常数，相对沉降常数约3.0。单链环状单链环状DNA：相对沉降常数大约为相对沉降常数大约为1.14。线性单链线性单链DNA：相对沉降常数为相对沉降常数为1.30。环环连连DNA(catenatedDNAcatenane):这这是是在在DNA复复制制过过程程中中的的产产物物或或由由DNA旋旋转转酶酶催催化化生生成成，由由两两个个以上以上T形形DNA分子环连而成。分子环连而成。以以上上八八种种DNA分分子子形形式式的的转转变变表表示示于于下下图图，其其中中前前四四种种仍仍标标以以I、I0、II、后后四四种种则则分分别别以以(5)、(6)、(7)、(8)表示。表示。坍坍缩缩DNA(collapsed DNA)：当：当I形成形成I0形形DN66 slide 67 slide 6767分子分子遗传遗传学学课课件件68第三节DNA的变性与复性变性变性（denaturation）或解链解链（melting）将双链DNA缓慢地加温，使其氢键断裂，双链解开，产生单链DNA分子的过程。复性复性（renaturation）或退火退火（annealing）核酸分子在变性后，分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双连的过程。第三第三节节 DNA的的变变性与复性性与复性变变性（性（denaturation691.下列因素可导致DNA变性：高温、酸、碱、尿素、甲酰胺常用的方法是热变性法和碱变性法。常用的方法是热变性法和碱变性法。2.DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为 增色效应增色效应（hyperchromic effect）。3.增色效应(hyperchromicity)由于DNA变性而引起的光吸收的增加称为增色效应。双链DNA的A260=1.00（浓度为50g/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）；单链DNA的A260=1.37；游离碱基或核苷酸的A260=1.60。一、变性一、变性1.下列因素可下列因素可导导致致DNA变变性：一、性：一、变变性性704.4.DNADNA的熔解曲线的熔解曲线解链温度解链温度（melting temperature,Tm）或熔点：是A260的升高达到极大值一半时（一般约为1.185）的温度。即是变性温度范围的中点。是鉴定DNA的参量。nDNA的熔解曲线：缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（一般0.1/min），记录各个温度下的A260数据，即可绘制DNA熔解曲线。从中可测出Tmn影响变性的因素：外部条件：如温度和正离子的浓度。浓度低于0.4mol/L，单价阳离子增高10倍，Tm增加16.6内部条件：GC含量及分子类型。当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4。马默多蒂马默多蒂（Marmur-Doty）关系式关系式：Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=69.3+0.41(G+C)%，或或 GC%=GC%=（Tm-69.3Tm-69.3）2.442.444.DNA的熔解曲的熔解曲线线71二、复性1.复性的条件：(1)有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；NaCl：0.15-0.5mol/L(2)有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键。一般比Tm低20-252.复性的过程：DNA的复性对片段有两个要求：(1)互补顺序的碰撞和排列；(2)碱基的正确配对和氢键的形成。具体过程分为：(1)成核作用：一般需10-20bp产生一个或几个双螺旋核心。(2)拉拉链作用。二、复性二、复性1.复性的条件：复性的条件：723.复性动力学 C 1 1 C0 2 1+KC0t1/2 C0：DNA初始浓度初始浓度C：复性时：复性时DNA浓度浓度t：复性时间：复性时间C0t：DNA浓度与时间的积，代表复性速度浓度与时间的积，代表复性速度C0t1/2：半数：半数DNA复性时，复性时，DNA浓度和复性时间的积浓度和复性时间的积各各个个不不同同的的DNA的的值值不不同同，K值值不不仅仅与与DNA分分子子大大小小有有关关，且与且与DNA分子序列的复杂性有关。分子序列的复杂性有关。由由公公式式可可知知：C0t1/2与与K成成反反比比，而而K是是和和DNA分分子子（N）的的大小成反比的，故大小成反比的，故C0t1/2与与DNA分子大小分子大小N成正比。成正比。复性进行一半时：=复性的分数C/C0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数。此函数可用于绘制出曲线即为C0t曲线。3.复性复性动动力学复性力学复性进进行一半行一半时时：=复性的分数复性的分数C/C0是是73根据复性动力学公式我们可以知道些什么？(1)单链浓度随着时间的增大而减小；(2）反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3)以反应浓度和COt1/2为座标可绘复性曲线；(4)通过COt1/2值可测原核生物基因组的大小；已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp,COt1/2=9M.Sec COt1/2（任何基因组DNA）/9M.sec =任何基因组大小/4.2X106bp(5)原核生物基因组大小不同，复性曲线也不同；(6)可用以区分真核生物和原核生物基因组。根据复性根据复性动动力学公式力学公式 我我们们可以知道些什么？可以知道些什么？74分子分子遗传遗传学学课课件件75单一顺序和重复顺序复性动力学曲线的区别真核生物的DNA有重复顺序，而原核 生物多为单一顺序。(1)单一顺序的复性曲线常只有一个拐点，而重复顺序常有多个拐点。(2)COt 比值变化范围。原核生物的COt值小于100,真核生物的COt值大于100单单一一顺顺序和重复序和重复顺顺序序 复性复性动动力学曲力学曲线线的区的区别别真核真核76分子分子遗传遗传学学课课件件77分子分子遗传遗传学学课课件件784.影响复性反应的因素(1)DNA片段的大小；(2)DNA的浓度；(3)DNA复杂性;(4)温度。最佳复性温度一般比Tm低25C。(5)盐的浓度：复性时要求盐的浓度达到足够高;4.影响复性反影响复性反应应的因素的因素(1)DNA片段的大小；片段的大小；795.在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢？可以通过哪些法来检测：(1)减色效应（hpochromic effcef）测定光密度，即OD值值（optical density），DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2)羟基磷灰石柱层析 羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢，不易 吸附单链5.在复性反在复性反应应中如何知道中如何知道单链单链已已经结经结合成双合成双链链了呢？可以通了呢？可以通过过哪些哪些80第四节分子杂交 分子杂交（molecular hybridization）互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程。应用：可用一已知带标记的DNA或RNA单链与另一被检测的DNA单链形成杂合双链，以测定靶序列是否存在。共同特点是：(1)都是应用复性动力学原理；(2)都必须有探针探针（probe）的存在。探针就是用同位素或非同位素如荧光染料生物素等标记的短片段特异DNA或RNA顺序。第四第四节节 分子分子杂杂交交 分子分子杂杂交（交（molecular hyb81常用的分子杂交方法一一.原位分子杂交（原位分子杂交（in situhybridization）以探针与组织切片或细胞内待测核酸进行杂交，经显影后在光镜或电镜下观察目的片段的存在与定位。二.斑点杂交斑点杂交（dot blotting）三三.萨瑟杂交萨瑟杂交（Southern blot）1975年Southern首先建立从琼脂糖凝胶电泳中分离的DNA转至纤维膜上，在与特定探针DNA片段进行杂交。四四.诺瑟杂交（诺瑟杂交（Northern hybridization）1977年Alwine用类似方法检测经琼脂糖电泳分离的RNA分子。五五.Westernblotting1979年Towbin再将方法扩展到特定的蛋白质分子的检测或分析上。六六.电镜观察电镜观察(1)异源双链定位法异源双链定位法（Heferoduplex mapping）(2)R-环定位法环定位法（R-loop mapping）常用的分子常用的分子杂杂交方法一交方法一.原位分子原位分子杂杂交（交（in situ hyb82分子分子遗传遗传学学课课件件83分子分子遗传遗传学学课课件件84