生物技术课件——02基因工程常用工具酶

生物技术课件02基因工程常用工具酶.ppt基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可少的工具。取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶限制性核酸内切酶将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶DNA连接酶。目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分子克隆操作，拓宽了基因工程的研究领域。世界大型工具酶生产厂商：（1）Novo Nordisk（诺和诺德公司，丹麦）（2）Gist Broccdes（荷兰）（3）Cultot（科特公司，芬兰）（4）Genencor International（杰能科公司，美国）（5）Solvay（苏尔威公司，比利时）（6）Clr Hansen（汉森公司，丹麦）（7）Rhone Ponlene（罗兰，普朗克公司，法国）（8）Quest（荷兰）限制性核酸内切酶（restriction endonucleases）：简称工具酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离出来。仅II型限制型核酸内切酶已有2000多种，可以识别200多个不同的DNA序列。2.1.1.1 细菌的限制菌的限制修修饰作用作用1952年，Luria和Human，1953年，Bertani和Weigle发现细菌的限制（restriction）现象：E.coli kPhage（k）E.coli BE.coli B 限制限制（k）感染不感染噬菌体侵染细菌仍有少量phage (K)可在E.coli B中生存，是因为这些phage对自身进行了修饰。大肠杆菌K大肠杆菌B普通的phage (K)修饰的phage (K)10-4（限制作用）11细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制修饰系统(R-M Restriction-modification system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶1978 W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。根据限制性核酸内切酶的限制修饰活性、相对分子量大小、酶蛋白结构、切割位点及限制作用所需的辅助因子等，将限制性核酸内切酶分为三类：I型酶，II型酶，III型酶。特性型型型限制和修限制和修饰活性饰活性单一功能单一功能单一功能单一功能双功能双功能识别与切识别与切割位点割位点分别，随机切分别，随机切割，相距较远割，相距较远同一位点同一位点相距相距5-10bp5-10bp对基因工对基因工程中意义程中意义无用无用非常有用非常有用意义不大意义不大EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若若种种名名头头2 2个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和第三个字母。和第三个字母。2.1.3 限制性核酸内切酶的命名50L Buffer中，含1g底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇100g BSA/ml（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白）在在DNA分子双分子双链的特异性的特异性识别序列部位，序列部位，切割切割DNA分子，分子，产生生链的断裂。的断裂。2个个单链断裂部位在断裂部位在DNA分子上的分布，通分子上的分布，通常不是彼此直接相常不是彼此直接相对。断裂。断裂结果形成的果形成的DNA片段，具有互片段，具有互补的的单链延伸末端。延伸末端。绝大多数的型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。A B C C B AA B C C B AA B N B AA B N B A或EcoR 5 G A A T T C 33 C T T A A G 5不同核酸内切酶的特异识别位点Pst5 C T G C A G33 G A C G T C.5A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用平平齐末端（末端（如如Sma、Alu、Hae）5粘性末端（粘性末端（如如EcoR）3粘性末端（粘性末端（如如Pst）5-GG-CC-33-CC-GG-55-GG CC-33-CC GG-55-GAATTC-33-CTTAAG-55-G-AATTC-33-CTTAA-G-5同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。如：Hpa和Msp均可切割C CGG。同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。5-GGATCC-33-CCTAGG-5BamH5-TGATCA-33-ACTAGT-5Bcl5-AGATCT-33-TCTAGA-5BglBamH Bcl Bgl三种酶可产生相同的5GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。限制性内切酶识别特异性放宽。EcoR在正常情况下识别GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点发生松动，可在AATT处发生切割，EcoR这种特殊的识别能力叫做星活性，用EcoR*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。影响因素：甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。重组DNA前的切割构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。甲基化酶分两类：维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。用甲基化酶进行甲基化的作用封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点能够催化DNA中相邻的3-羟基和5-磷酸基团末端之间形成3,5-磷酸二酯键的酶。T4 DNA连接酶：可连接带匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的双链DNA分子相互连接。大肠杆菌DNA连接酶：只能连接带匹配粘末端的DNA分子。DNA连接酶需要在一条DNA链的3末端具有游离羟基（OH），另一条链5末端具有磷酸基（P）时才可发挥作用。3OH和5P需彼此相邻，且各自位于与互补链上互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端。DN连接酶不能连接单链DNA分子，只能连接双螺旋DNA分子的一部分。DNA连接酶只能封闭失去一个磷酸二酯键所出现的单链切口（nick），不能封闭失去一个或数个核苷酸所形成的缺口（gap）。DNA连接酶反应时需要能量（NAD或ATP）。切口：失去磷酸二酯键缺口：失去核苷酸533553352.3.3.1 T4噬菌体DNA连接酶由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，分子量68KD，需ATP。可以连接互补的粘性末端。如：5ACGOH pAATTCGT3 T4DNA连接酶 3TGCTTAAp HO GCA5 Mg2，ATP5ACGAATTCGT3 3TGCTTAAGCA5反应系统：ATP，TrisHCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP，pH7.5，415也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反应速度较慢。5CGAOH PCGTA3 T4DNA连接酶 3GCTP HOGCAT5 Mg2，ATP5CGACGTA3 3GCTGCAT5可以实现分子间或分子内连接。AATTC GG CTTAAAATTC GG CTTAA5555(1)(2)AATTC GG CTTAAAATTC G G CTTAA55AATTC GG CTTAA55(a)分子间连接(b)分子内连接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶2.3.3.2 大肠杆菌DNA连接酶只催化有匹配粘性末端的DNA分子需有NAD（氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）做能源辅助因子。反应缓冲体系：TrisHCl，MgCl2，EDTA，DTE（二硫赤藓糖醇），NAD，BSA，pH8.0，415。定义：在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3-OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。DNA聚合酶主要有三类：聚合酶(pol)、聚合酶(pol)，聚合酶(pol)。其中聚合酶参与DNA修复，聚合酶参与DNA复制。聚合酶是基因工程中的常用酶。DNA聚合酶在DNA复制过程中的作用大肠杆菌DNA聚合酶(全酶)Klenow片段TDNA聚合酶(TPhage感染的E.coli)修饰的TDNA聚合酶(测序酶)TaqDNA聚合酶(耐热)反转录酶有大肠杆菌polA基因编码的一种单链多肽蛋白质，MW=109，000 D，约有1000个氨基酸，分子中含有一个双硫键，一个硫氢键，还含有锌离子，椭圆型结构。2.4.1.1 DNA聚合酶I催化合成DNA互补链的条件：（1）四种脱氧核苷酸dNTPs和Mg2离子；（2）带有3OH游离基团的引物；（3）单链或双链模板(DNA或RNA)；2.4.1.2 DNA聚合酶I 具有三种酶活性：（1）53聚合酶活性；（2）53外切酶活性；（3）35外切外切酶活性。（1）53聚合酶活性：以单链DNA为模板，在DNA引物3-OH末端聚合上脱氧核苷三磷酸。CCG 3GGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG（2）53外切酶活性 以双链DNA或RNA和DNA杂交体为底物，从5端降解双链DNA或RNA和DNA杂交体的RNA部分。只对DNA配对部分即双链的磷酸二酯键有切割作用。GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+pC，pT5（3）35外切酶活性从3OH端降解DNA。TCGATAGCCAGCTATE.coli DNApolIMg 2+TCGATAAGCTAT+pC，pG5TCGATAAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg 2+pC，pG，pA5 DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过DNA切口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。此时，DNA聚合酶的5-3核酸外切酶活性和5-3聚合酶活性同时发生。5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 5-3外切酶活性5-3聚合酶活性5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 3 5 未经标记的核苷酸经标记的核苷酸53355335533553355335*(a)(b)(c)(d)(e)(a)双链的DNA分子(b)带有3-OH末端的单链缺口(c)pol从5-P移去一个核苷酸(d)pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链p探针：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。p标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。p分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）p来源：E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970DNApol枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C 端端(76kd)+N 端（端（36kd）Klenow5 3聚合3 5外切5 3外切用途填补限制酶的5-粘性末端为平齐末端3-末端标记 Klenow 在无底物时只进行3 5外切；有底物存在时则聚合。可用32PdNTP对3凹端进行标记。在cDNA 克隆中，合成cDNA第二条链应用Sanger双脱氧法进行DNA测序。5CC3GGAATT5CCTTAA33GGAATT5Klenow来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种结构：单亚基MW=94000d。活性：聚合最适温度为75-80，不具35外切酶活性，具53外切活性。用途：PCR反应。测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。定义：以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶。用途：（1）逆转录；（2）对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。结构：MW=60，000d.活性（1）催化dNTP掺入DNA 3-OH末端。当反应混合物中只有一种dNTP时，可以形成同聚物尾。（2）反应不需模板DNA，需Co 2+用途：克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。末端标记磷酸酶：催化核酸分子脱掉5磷酸基团，将5P末端转化为5OH。磷酸激酶：催化磷酸从ATP分子转移到DNA或RNA分子的5OH末端。PNKasePMase 5HO A T T A G C C C G5HO A T T A G C C C G T A A T C G G G C OH 5 T A A T C G G G C OH 5多核苷酸激酶多核苷酸激酶磷酸酶磷酸酶 5p A T T A G C C C G5p A T T A G C C C G T A A T C G G G C p 5 T A A T C G G G C p 5Bal31 核酸酶（1）从DNA末端同时降解两条链。（2）用于基因表达调控序列的研究。S1 核酸酶（1）降解单链核酸。（2）用于把具粘性末端的DNA变为平齐末端的DNA。（3）在DNA部分变性条件下，能在富含AT区切断DNA。（4）打开在从mRNA合成双链cDNA时产生的发卡结构。具有酶活性的RNA片段。是真核生物转录产物的内含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催化内含子剪切。1981 Cech和Altman首次发现，并因此获得1989年的诺贝尔奖。核酶可以作为RNA的限制性内切酶用于基因操作。