生物化学--酶通论--课件

第八章第八章 酶通论酶通论一、酶催化作用的特点一、酶催化作用的特点二、酶的化学本质及其组成二、酶的化学本质及其组成三、酶的命名和分类三、酶的命名和分类四、酶的专一性四、酶的专一性五、酶的活力测定和分离纯化五、酶的活力测定和分离纯化六、核酶六、核酶七、抗体酶七、抗体酶八、酶工程简介八、酶工程简介1ppt课件一、酶催化作用的特点一、酶催化作用的特点酶酶是是一一类类具具有有高高效效率率、高高度度专专一一性性、活活性性可可调调节节的的高高分分子生物催化剂。子生物催化剂。1857 Pasteur1857 Pasteur提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。18971897BuchnerBuchner兄兄弟弟证证明明发发酵酵与与细细胞胞的的活活动动无无关关，不不含含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。19131913MichaelisMichaelis和和MentenMenten提出米氏方程。提出米氏方程。19261926SumnerSumner首首次次从从刀刀豆豆中中提提出出脲脲酶酶结结晶晶，并并证证明明具具有有蛋白质性质。蛋白质性质。19691969MerrifieldMerrifield人工合成核糖核酸酶。人工合成核糖核酸酶。1967-19701967-1970从从E.coliE.coli中中发发现现第第I I、第第IIII类类限限制制性性核核酸酸内内切酶。切酶。2ppt课件19821982CechCech和和 AltmanAltman发发 现现 四四 膜膜 虫虫 细细 胞胞 大大 核核 期期 间间26S26SrRNArRNA前前体体具具有有自自我我剪剪接接功功能能。并并于于19861986年年证证明明其内含子其内含子L-19 IVSL-19 IVS具有多种催化功能。具有多种催化功能。19861986 SchultzSchultz与与LernerLerner研制成功抗体酶。研制成功抗体酶。BoyerBoyer和和WaklerWakler阐阐明明ATPATP合合成成酶酶合合成成与与分分解解ATPATP的的分子机制。分子机制。3ppt课件（一）酶和一般催化剂的比较（一）酶和一般催化剂的比较酶与非生物催化剂相比的几点共性：酶与非生物催化剂相比的几点共性：催化效率高，用量少（细胞中含量低）。催化效率高，用量少（细胞中含量低）。加快反应速度但不改变化学反应平衡点。加快反应速度但不改变化学反应平衡点。降低反应活化能。降低反应活化能。反应前后自身结构不变。反应前后自身结构不变。催催化化剂剂改改变变了了化化学学反反应应的的途途径径，使使反反应应通通过过一一条条活活化化能能比比原原途途径径低低的的途途径径进进行行，催催化化剂剂的的效效应应只只反反映映在在动动力力学学上上（反反应应速速度度），不不影影响响反反应应的的热热力学（化学平衡）。力学（化学平衡）。4ppt课件5ppt课件（二）酶作为生物催化剂的特点（二）酶作为生物催化剂的特点（1 1）催催化化效效率率高高：酶酶催催化化反反应应速速度度是是相相应应的的无无催催化化反反应应的的10108 8-10-102020倍倍，并并且且至至少少高高出出非非酶酶催催化化反反应应速速度度几几个个数数量级。量级。（2 2）专专一一性性高高：酶酶对对反反应应的的底底物物和和产产物物都都有有极极高高的的专专一一性，几乎没有副反应发生。性，几乎没有副反应发生。（3 3）反反应应条条件件温温和和：温温度度低低于于100100，正正常常大大气气压压，中中性性pHpH环境。环境。（4 4）活活性性可可调调节节：根根据据据据生生物物体体的的需需要要，许许多多酶酶的的活活性性可可受受多多种种调调节节机机制制的的灵灵活活调调节节，包包括括：酶酶量量的的调调节节、激激素素调调节节、反反馈馈抑抑制制、别别构构调调节节、酶酶的的共共价价修修饰饰、酶酶的的合合成成、活化与降解等。活化与降解等。（5 5）酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子。酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子。6ppt课件（二）酶作为生物催化剂的特点（二）酶作为生物催化剂的特点酶的催化作用可使反应速度提高酶的催化作用可使反应速度提高1010 10101 1倍。倍。例如：过氧化氢分解例如：过氧化氢分解 2 2H H2 2O O2 2 2H 2H2 2O+OO+O2 2用用FeFe3+3+催催化化，效效率率为为6 61010-4-4 mol/mol/molmolS S，而而用用过过氧氧化化氢酶催化，效率为氢酶催化，效率为6 610106 6 mol/mol/molmolS S。转转换换数数（turnover turnover numbernumber）的的概概念念：每每秒秒钟钟每每个个酶酶分分子子能能催催化化底底物物发发生生变变化化的的微微摩摩尔尔数数，用用kcatkcat表表示示（mol/Smol/S ）。）。-淀淀粉粉酶酶催催化化淀淀粉粉水水解解，1 1克克结结晶晶酶酶在在6565 C C条条件件下下可可催催化化2 2吨淀粉水解。吨淀粉水解。1 1高效性高效性（酶具有极高的催化效率）（酶具有极高的催化效率）7ppt课件2 2专一性专一性 SpecificitySpecificity酶酶的的专专一一性性 SpecificitySpecificity又又称称为为特特异异性性，是是指指酶酶在在催催化化生生化化反反应应时时对对底底物物的的选选择择性性，即即一一种种酶酶只只能能作作用用于于某某一一类类或或某某一一种种特特定定的的物物质质。亦亦即即酶酶只只能能催催化化某某一一类类或某一种化学反应。或某一种化学反应。例例如如：蛋蛋白白酶酶催催化化蛋蛋白白质质的的水水解解；淀淀粉粉酶酶催催化化淀淀粉粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。的水解；核酸酶催化核酸的水解。8ppt课件3 3反应条件温和反应条件温和酶酶促促反反应应一一般般在在pH pH 5-8 5-8 水水溶溶液液中中进进行行，反反应应温温度度范范围围为为20-4020-40 C C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。酶易失活酶易失活凡凡能能使使蛋蛋白白质质变变性性的的因因素素如如强强酸酸、强强碱碱、高高温温等等条条件件都都能能使使酶酶破破坏坏而而完完全全失失去去活活性性。所所以以酶酶作作用用一一般般都都要要求求比比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸碱度。较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸碱度。9ppt课件.酶活力可调节控制酶活力可调节控制如如抑抑制制剂剂调调节节、共共价价修修饰饰调调节节、反反馈馈调调节节、酶酶原原激激活活及激素控制等。及激素控制等。.某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。关。10ppt课件二、酶的化学本质及其组成二、酶的化学本质及其组成（一）酶的化学本质（一）酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质。绝大多数酶是蛋白质。证据：（证据：（1 1）能被蛋白酶水解失活，酸水解的产物是氨基）能被蛋白酶水解失活，酸水解的产物是氨基酸；（酸；（2 2）具有蛋白质的一切共性，如凡是能使蛋白质变）具有蛋白质的一切共性，如凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性。性的因素都能使酶变性。少数酶是少数酶是RNARNA（核酶）。（核酶）。11ppt课件（二）酶的化学组成及类别（小结）（二）酶的化学组成及类别（小结）据酶分子据酶分子组成分类组成分类单纯蛋白质单纯蛋白质酶类酶类simple protein结合蛋白质结合蛋白质酶类酶类（缀合蛋白质）（缀合蛋白质）Conjugated protein酶蛋白酶蛋白质质(脱辅酶脱辅酶)apoprotein apoenzyme辅助因子辅助因子cofactor金属离子金属离子辅基辅基prosthetic g.辅酶辅酶coenzyme脱辅酶与脱辅酶与辅因子结合后所形成的复合物称为辅因子结合后所形成的复合物称为“全酶全酶”即：即：全酶全酶=脱辅酶脱辅酶+辅因子辅因子12ppt课件只有全酶才起催化作用只有全酶才起催化作用v辅酶辅酶是指与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物是指与脱辅酶结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。如辅酶质，通过透析方法可以除去。如辅酶和辅酶和辅酶等。等。v辅基辅基是以共价键和脱辅酶结合，不能通过透析除是以共价键和脱辅酶结合，不能通过透析除去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白质分开。去，需要经过一定的化学处理才能与蛋白质分开。如细胞色素氧化酶中的铁卟啉。如细胞色素氧化酶中的铁卟啉。脱辅酶部分脱辅酶部分决定酶的专一性；决定酶的专一性；辅酶（辅基）辅酶（辅基）在酶催化中通常起者电子、原子在酶催化中通常起者电子、原子或某些化学基团的传递作用或某些化学基团的传递作用13ppt课件单单体体酶酶-monomeric enzyme：一一般般由由一一条条肽肽链链组组成成，如如溶溶菌菌酶酶、胰胰蛋蛋白白酶酶、木木瓜瓜蛋蛋白白酶酶等等。但但有有的的单单体体酶酶有有多多条条肽肽链链组组成成，如如胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶由由3 3条条肽肽链链，链链间间由由二二硫硫键相连构成一个共价整体。键相连构成一个共价整体。寡寡聚聚酶酶-oligomeric enzyme：由由2 2个个或或2 2个个以以上上亚亚基基组组成成，亚亚基基间间可可以以相相同同也也可可不不同同。亚亚基基间间以以次次级级键键缔缔合合。如如3-3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶等。磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶等。多多酶酶体体系系-multienzyme system：由由几几种种酶酶靠靠非非共共价价键键彼彼此此嵌嵌合合而而成成。主主要要指指结结构构化化的的多多酶酶复复合合体体如如丙丙酮酮酸酸脱脱氢酶系、脂肪酸合成酶复合体等。氢酶系、脂肪酸合成酶复合体等。据酶蛋白据酶蛋白特征分类特征分类单体酶单体酶寡聚酶寡聚酶多酶复合体多酶复合体14ppt课件三、酶的命名和分类三、酶的命名和分类（一）（一）习惯命名习惯命名 19611961年以前使用的酶沿用习惯命名：年以前使用的酶沿用习惯命名：（1 1）依据底物来命名：）依据底物来命名：如如：催催化化蛋蛋白白质质水水解解的的酶酶称称蛋蛋白白酶酶。催催化化淀淀粉粉水水解解的的酶酶称称淀粉酶。淀粉酶。（2 2）依据催化反应的性质及类型命名：）依据催化反应的性质及类型命名：如：水解酶、转氨酶。如：水解酶、转氨酶。（3 3）结合上述两个原则命名）结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。，琥珀酸脱氢酶。（4 4）有有时时加加上上酶酶的的来来源源，如如：胃胃蛋蛋白白酶酶、牛牛胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶。酶。15ppt课件（二）（二）国际系统命名法国际系统命名法基基本本原原则则：明明确确标标明明酶酶的的底底物物及及催催化化反反应应的的性性质质（底底物物为水时可略去不写）。为水时可略去不写）。谷丙转氨酶的系统名称谷丙转氨酶的系统名称 ：丙氨酸丙氨酸:-:-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶16ppt课件 1.1.氧化还原酶氧化还原酶 2.2.转移酶类转移酶类 3.3.水解酶类水解酶类 4.4.裂合酶类裂合酶类 5.5.异构酶类异构酶类 6.6.合成（连接）酶类合成（连接）酶类国际酶学委员会国际酶学委员会（Enzyme CommsionEnzyme Commsion）将将酶分成六大类（酶分成六大类（根据各种酶所催化反应的根据各种酶所催化反应的类型）类型）：（三）国际系统分类法及酶的编号（三）国际系统分类法及酶的编号17ppt课件1 1、氧化还原酶类、氧化还原酶类OxidoreductaseOxidoreductasev氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。v主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase(Oxidase)。v如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。反应。18ppt课件v氧化酶类：氧化酶类：催化底物脱氢并生成催化底物脱氢并生成H H2 2O O2 2或或H H2 2O OA A2H+O2H+O2 2 A+H A+H2 2O O2 22A2A2H+O2H+O2 2 2A+2H 2A+2H2 2O Ov脱氢酶类：脱氢酶类：A A2H+B A+B2H+B A+B2H2H19ppt课件 习惯上可分为习惯上可分为4 4个亚类：个亚类：1.1.脱氢酶：脱氢酶：受体为受体为NADNAD或或NADPNADP，不需氧。，不需氧。2.2.氧化酶：氧化酶：以分子氧为受体，产物可为水或以分子氧为受体，产物可为水或H2O2H2O2，常需黄素辅基。，常需黄素辅基。3.3.过氧物酶：过氧物酶：以以H2O2H2O2为受体，常以黄素、血红为受体，常以黄素、血红素为辅基。素为辅基。氧合酶（加氧酶）：氧合酶（加氧酶）：催化氧原子掺入有机分催化氧原子掺入有机分子，又称羟化酶。按掺入氧原子个数可分为子，又称羟化酶。按掺入氧原子个数可分为单加氧酶和双加氧酶。单加氧酶和双加氧酶。20ppt课件2 2、转移酶类、转移酶类TransferaseTransferasev催化功能基团的转移反应。催化功能基团的转移反应。v如各种转氨酶和激酶分别催化转移如各种转氨酶和激酶分别催化转移氨基和磷酸基的反应。氨基和磷酸基的反应。例如，例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。应。AX+B A+BX21ppt课件可分为可分为8 8个亚类，较重要的有：个亚类，较重要的有：v羰基转移酶羰基转移酶 ：转移一碳单位，与核酸、蛋转移一碳单位，与核酸、蛋白质甲基化有关。白质甲基化有关。v磷酸基转移酶：磷酸基转移酶：常称为激酶，多以常称为激酶，多以ATPATP为供为供体。少数蛋白酶也称为激酶（如肠激酶）。体。少数蛋白酶也称为激酶（如肠激酶）。v糖苷转移酶：糖苷转移酶：与多糖代谢密切相关，如糖原与多糖代谢密切相关，如糖原磷酸化酶。磷酸化酶。22ppt课件3、水解酶类、水解酶类v 催化底物的水解反应。起降解作用，多位于胞催化底物的水解反应。起降解作用，多位于胞外或溶酶体中。外或溶酶体中。v如蛋白酶、脂肪酶等。如蛋白酶、脂肪酶等。v可分为水解酯键（如限制性内切酶）、糖苷键可分为水解酯键（如限制性内切酶）、糖苷键（如果胶酶、溶菌酶等）、肽键、碳氮键等（如果胶酶、溶菌酶等）、肽键、碳氮键等11亚类。亚类。例如：脂肪酶例如：脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：A-B+HOH AOH+BH23ppt课件4 4、裂合酶类、裂合酶类v催化从底物上移去一个小分子而留下双键催化从底物上移去一个小分子而留下双键的反应或其逆反应。的反应或其逆反应。v包括醛缩酶、水化酶、脱羧酶等。包括醛缩酶、水化酶、脱羧酶等。v共共7 7个亚类。个亚类。AB A+B24ppt课件v例如：例如：延胡索酸水合酶催化的反应延胡索酸水合酶催化的反应v醛缩酶催化反应醛缩酶催化反应 H0-C-HH-C-OHCH2OPO3H2C=O CH2OHH-C=OH-C-OHCH2OPO3H2醛缩酶1，6-二磷酸果糖二磷酸果糖磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛C=OCH2OPO3H2H-C-OH CH2OPO3H225ppt课件5 5、异构酶类、异构酶类 A Bv催化同分异构体之间的相互转化。催化同分异构体之间的相互转化。v包括消旋酶、异构酶、变位酶等。包括消旋酶、异构酶、变位酶等。v共共6 6个亚类个亚类26ppt课件v例如：葡萄糖异构酶催化的反应。例如：葡萄糖异构酶催化的反应。v葡萄糖葡萄糖6-磷酸异构酶催化反应磷酸异构酶催化反应6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖6-磷酸果糖磷酸果糖 CHO C-OHHOC-H H-C-OH H-C-OH C-2OPO3H2 CH2OH C=OHOC-H H-C-OH H-C-OH C-2OPO3H227ppt课件6 6、合成（连接）酶类、合成（连接）酶类v合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-C-O O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应键的形成反应。这类反应必须与必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H AA+B+ATP+H-O-H AB+ADP+PiB+ADP+Pi A+B+ATP+H-O-H AA+B+ATP+H-O-H AB+AMP+PPiB+AMP+PPi v例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸丙酮酸 +CO+CO2 2 草酰乙酸草酰乙酸28ppt课件（1 1）按按反反应应性性质质分分六六大大类类，用用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6表示。表示。（2 2）根根据据底底物物中中被被作作用用的的基基团团或或键键的的特特点点，将将每每一一大大类类分分为为若若干干个个亚亚类类，编编号号用用1 1、2 2、3 3、。（3 3）每每个个亚亚类类又又可可分分为为若若干干个个亚亚亚亚类类，用编号用编号1 1、2 2、3 3、（4 4）流水编号流水编号1 1、2 2、3 3、酶的编号酶的编号由由4 4个数字组成，中间以个数字组成，中间以“.”隔开。隔开。29ppt课件30ppt课件如：如：乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 EC1.1.1.1EC1.1.1.1乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC1.1.1.27 EC1.1.1.27 苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶 EC1.1.1.37EC1.1.1.37第一个数字表示第一个数字表示大类：大类：氧化还原氧化还原第二个数字表示第二个数字表示反应基团：醇基反应基团：醇基第三个数字表示第三个数字表示电子受体：电子受体：NADNAD+或或NADPNADP+第四个数字表示第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。苹果酸。31ppt课件国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异SODSOD：EC1.15.1.1EC1.15.1.1，只有一个名称和编号，只有一个名称和编号 2O2O2 2-+2H+2H+HH2 2O O2 2+O+O2 2 三类不同的三类不同的SODSOD：CuZnCuZn-SOD -SOD 真核生物细胞质中真核生物细胞质中MnMn-SOD -SOD 真核生物线粒体中真核生物线粒体中Fe-SODFe-SOD同是同是CuZnCuZn-SOD-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。构也有很大不同。在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。以说明。32ppt课件四、酶的专一性四、酶的专一性（一）酶的专一性（一）酶的专一性酶的专一性酶的专一性结构专一性结构专一性绝对专一性绝对专一性相对专一性相对专一性基团专一性基团专一性键专一性键专一性立体异构专一性立体异构专一性旋光异构专一性旋光异构专一性几何异构专一性几何异构专一性33ppt课件.结构专一性结构专一性（）绝对专一性（）绝对专一性（Absolute specificity)Absolute specificity)有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为底物。这种专一性称为绝对专一性绝对专一性。例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶及延胡索例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸酐酶及延胡索酸水化酶（只作用于反丁烯二酸）等。酸水化酶（只作用于反丁烯二酸）等。O O O O 脲酶脲酶脲酶脲酶 H2NH2NH2NH2NC C C CNH2 +H2O 2NH3+CO2NH2 +H2O 2NH3+CO2NH2 +H2O 2NH3+CO2NH2 +H2O 2NH3+CO234ppt课件（）相对专一性（）相对专一性(Relative Specificity)Relative Specificity)有有些些酶酶的的作作用用对对象象不不是是一一种种底底物物，而而是是一一类类化化合合物物或或一一类化学键。这种专一性称为类化学键。这种专一性称为相对专一性相对专一性。包括：包括：族族(group)group)专专一一性性（对对键键两两端端的的基基团团要要求求的的程程度度不不同同，只只对对其其中中一一个个基基团团要要求求严严格格）。如如-葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶，催催化化由由-葡葡萄萄糖糖所所构构成成的的糖糖苷苷水水解解，但但对对于于糖糖苷苷的的另另一一端端没没有有严严格要求。胰蛋白酶，水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键。格要求。胰蛋白酶，水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键。键键(Bond)Bond)专专一一性性。如如酯酯酶酶催催化化酯酯的的水水解解，对对于于酯酯两两端端的的基团没有严格的要求。基团没有严格的要求。35ppt课件.立体化学（异构）专一性立体化学（异构）专一性（）（）旋光异构旋光异构专一性专一性酶酶的的一一个个重重要要特特性性是是能能专专一一性性地地与与手手性性底底物物结结合合并并催催化化这这类类底底物物发发生生反反应应。即即当当底底物物具具有有旋旋光光异异构构体体时时，酶只能作用于其中的一种。酶只能作用于其中的一种。例例如如，淀淀粉粉酶酶只只能能选选择择性性地地水水解解D D葡葡萄萄糖糖形形成成的的1 1，4 4糖糖苷苷键键；L-L-氨氨基基酸酸氧氧化化酶酶只只能能催催化化L-L-氨氨基基酸酸氧氧化化；又如：又如：乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶只对只对L-L-乳酸是专一的。乳酸是专一的。36ppt课件（）（）几何异构专一性（几何异构专一性（geometrical specificitygeometrical specificity）有有些些酶酶只只能能选选择择性性催催化化某某种种几几何何异异构构体体底底物物的的反反应应，而而对另一种构型则无催化作用。对另一种构型则无催化作用。如如延延胡胡索索酸酸水水合合酶酶只只能能催催化化延延胡胡索索酸酸即即反反丁丁烯烯二二酸酸水水合合生生成成苹苹果果酸酸，对对马马来来酸酸（顺顺丁丁烯烯二二酸酸）则则不不起起作作用用；又如：又如：丁二酸（琥珀酸）脱氢酶。丁二酸（琥珀酸）脱氢酶。琥珀酸琥珀酸延胡索酸延胡索酸37ppt课件（二）关于酶作用专一性的假说（二）关于酶作用专一性的假说锁钥学说锁钥学说(18941894年年Emil FischerEmil Fischer lock and key thoerylock and key thoery)：认认为为整整个个酶酶分分子子的的天天然然构构象象是是具具有有刚刚性性结结构构的的，酶酶表表面面具具有有特特定定的的形形状状。酶酶与与底底物物的的结结合合如如同同一一把把钥钥匙匙对对一一把把锁锁一一样样。将将酶酶的的活活性性中中心心比比喻喻作作锁锁孔孔，底底物物分分子子象象钥钥匙匙，底物能专一性地插入到酶的活性中心。底物能专一性地插入到酶的活性中心。38ppt课件（但但如如何何解解释释酶酶的的多多底底物物现现象象、酶酶对正反方向的催化、相对专一性）对正反方向的催化、相对专一性）39ppt课件诱诱导导契契合合学学说说(19581958年年 D.KoshlandD.Koshlandinduced-fit induced-fit hypothesis)hypothesis)：酶酶的的活活性性中中心心在在结结构构上上具具柔柔性性，底底物物接接近近活活性性中中心心时时，可可诱诱导导酶酶蛋蛋白白构构象象发发生生变变化化，这这样样就就使使酶酶活活性性中中心心有有关关基基团团正正确确排排列列和和定定向向，使使之之与与底底物物成互补形状有机的结合而催化反应进行。成互补形状有机的结合而催化反应进行。40ppt课件诱导契合学说的要点诱导契合学说的要点A.A.酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板B.B.底底物物能能诱诱导导酶酶蛋蛋白白的的形形状状发发生生一一定定变变化化（专专一一性性结结合）合）C.C.当当酶酶的的形形状状发发生生变变化化后后，就就使使得得其其中中的的催催化化基基团团形形成正确的排列。成正确的排列。D.D.在在酶酶反反应应过过程程中中，酶酶活活性性中中心心构构象象的的变变化化是是可可逆逆的的。即即酶酶与与底底物物结结合合时时，产产生生一一种种诱诱导导构构象象，反反应应结结束束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。41ppt课件ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物底物 羧羧羧羧肽肽肽肽酶酶酶酶结结结结合合合合底底底底物物物物前前前前后后后后构构构构象象象象变变变变化化化化42ppt课件五、酶的活力测定和分离纯化五、酶的活力测定和分离纯化（一）酶活力测定（一）酶活力测定酶酶的的含含量量不不能能直直接接用用重重量量和和摩摩尔尔数数表表示示（不不纯纯、失失活活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示。分子量不知），而采用酶的活力单位表示。1.1.酶活力酶活力酶酶活活力力：用用在在一一定定条条件件下下，酶酶催催化化某某一一反反应应的的反反应应速速度度表示。反应速度快，活力就越高。表示。反应速度快，活力就越高。酶量酶量酶活力酶活力反应速度反应速度 43ppt课件酶酶促促反反应应速速度度的的表表示示方方法法：单单位位时时间间、单单位位体体积积中中底底物物的减少量或产物的增加量。的减少量或产物的增加量。研研究究酶酶促促反反应应速速度度，以以酶酶促促反反应应的的初初速速度度为为准准。因因为为底底物物 浓浓 度度 降降 低低、酶酶 部部 分分 失失 活活、产产物物抑抑制制和和逆逆反反应应等等因因素素，会会使使反反应应速速度度随随反反应应时时间间的的延长而下降。延长而下降。44ppt课件2.2.酶的活力单位酶的活力单位 习惯单位（习惯单位（U U）:底物底物(或产物或产物)变化量变化量 /单位时间单位时间 国际单位（国际单位（IUIU）:1moL:1moL变化量变化量 /分钟分钟 KatalKatal（KatKat）：）：1moL1moL变化量变化量 /秒秒3.3.酶的比活力酶的比活力比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)mg蛋白蛋白45ppt课件4.4.酶活力的测定方法酶活力的测定方法终点法终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法动力学法:连续测定反应过程中产物、底物或辅酶的变连续测定反应过程中产物、底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。化量，直接测定出酶反应的初速度。46ppt课件（1 1）分分光光光光度度法法（spectrophotometryspectrophotometry）：多多利利用用产产物物在在紫紫外外或或可可见见光光部部分分的的光光吸吸收收性性质质，选选择择适适当当波波长长，测测定定反反应应过过程程的的进进行行情情况况。简简便便、节节约约时时间间和和样样品品，可可以以检测检测nmolnmol/L/L水平的变化。水平的变化。（2 2）荧荧光光法法(fluorometry(fluorometry)：主主要要利利用用底底物物或或产产物物的的荧荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。光性质。灵敏度高，但易受到干扰。（3 3）同同位位素素测测定定法法：同同位位素素标标记记底底物物，反反应应后后经经分分离离，检检测测产产物物的的脉脉冲冲数数，即即可可换换算算成成酶酶的的活活力力单单位位。灵灵敏敏度度最高。最高。（4 4）电化学方法：）电化学方法：pHpH计、计、氧电极法氧电极法 47ppt课件（二）酶的分离和纯化（二）酶的分离和纯化酶酶的的分分离离提提纯纯方方法法，也也就就是是常常用用来来分分离离提提纯纯蛋蛋白白质质的的方法。方法。（1 1）把很大体积的酶制剂浓缩到较小体积）把很大体积的酶制剂浓缩到较小体积;（2 2）把把酶酶制制剂剂中中大大量量的的杂杂质质蛋蛋白白和和其其它它大大分分子子物物质质分分离出去。离出去。判判断断分分离离提提纯纯方方法法的的优优劣劣，用用总总活活力力的的回回收收和和比比活活力力提高的倍数提高的倍数来衡量。来衡量。过过程程：选选材材；破破碎碎；抽抽提提；分分离离及及纯纯化化；结晶；结晶；保存。保存。48ppt课件六、核六、核 酶酶(ribozyme(ribozyme)*RibozymeRibozyme是一种是一种RNARNA生物催化剂生物催化剂RibozymeRibozyme的的发发现现：RNARNA具具有有酶酶的的催催化化功功能能是是由由CechCech T.RT.R于于19821982年年提提出出的的。19811981年年，发发现现四四膜膜虫虫（tetrahymena tetrahymena thermophilathermophila）的的26S 26S rRNArRNA前前体体在在成成熟熟过过程程中中，其其居居间间序序列列通通过过剪剪接接反反应应被被除除去去。并并证证明明四四膜膜虫虫rRNArRNA前前体体的的居居间间序序列列核核糖糖核核酸酸（L-19RNAL-19RNA）具具有有多多种种催催化化功功能能，将将这这种种具具有有催催化化活活性性的的RNARNA称称为为 RibozymeRibozyme (ribonucleic(ribonucleic acid enzyme)acid enzyme)。获得。获得19891989年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。49ppt课件rRNArRNA基基因因的的转转录录产产物物即即rRNArRNA前前体体（大大约约64006400个个核核苷苷酸酸残残基基）很很不不稳稳定定，在在鸟鸟苷苷和和MgMg2+2+存存在在下下切切除除自自身身的的内内含含子子（intronintron或或intervening intervening sequence,IVSsequence,IVS-居居间间序序列列或或间间插插序序列列），使使两两个个外外显显子子(exon(exon)拼拼接接起起来来，形形成成成成熟熟的的rRNArRNA此此过过程程没没有有任任何何蛋蛋白白质质酶酶参参与与，称称为为自自我我剪剪接接（self-splicingself-splicing）,并证明并证明RNARNA具有催化活性。具有催化活性。50ppt课件51ppt课件RibozymeRibozyme在一定条件下，高度专一地催化下列反应，具在一定条件下，高度专一地催化下列反应，具有相应酶的活性（底物专一、符合米氏方程、对竞争性有相应酶的活性（底物专一、符合米氏方程、对竞争性抑制剂敏感抑制剂敏感）1.1.核苷酸转移酶活性核苷酸转移酶活性 2CpCpCpCpC2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC 2.2.磷酸二酯酶活性磷酸二酯酶活性 CpCpCpCpCCpCpCpCpC CpCpCpC+CpCpCpCpC+Cp 3.3.磷酸转移酶活性磷酸转移酶活性 CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC+UpCpUpCpCpCpCpCpC+UpCpUp 4.RNA 4.RNA限制性内切酶活性限制性内切酶活性另外，另外，19971997年，年，ZhangZhang和和CechCech证明了人工合成的证明了人工合成的RNARNA分子分子具有肽基转移酶活性。具有肽基转移酶活性。52ppt课件RibozymeRibozyme发现的重大意义：发现的重大意义：RNARNA具具有有酶酶的的催催化化活活性性，向向酶酶的的化化学学本本质质是是蛋蛋白白质质这这一一传统概念提出了挑战。传统概念提出了挑战。在在理理论论上上，对对于于生生物物起起源源和和生生命命进进化化的的研研究究具具有有重重要要启示。启示。生物催化分子进化的可能性：生物催化分子进化的可能性：RNA RNA RNARNA-蛋蛋白白质质 蛋蛋白白质质-RNA-RNA 蛋蛋白白质质-辅酶或辅基辅酶或辅基 蛋白质蛋白质 在在实实践践上上，由由于于RibozymeRibozyme的的内内切切酶酶活活性性，可可定定点点切切割割mRNAmRNA，破破坏坏mRNAmRNA，抑抑制制基基因因表表达达，为为基基因因、病病毒毒和和肿肿瘤治疗提供了可行途径。瘤治疗提供了可行途径。53ppt课件七、抗体酶七、抗体酶（abzymeabzyme）抗抗体体酶酶指指具具有有催催化化活活性性的的免免疫疫球球蛋蛋白白，即即在在其其高高可可变变区区赋赋予予了了酶酶的的属属性性。是是抗抗体体的的高高度度选选择择性性与与酶酶的的高高效效催催化化性相结合的产物。性相结合的产物。抗抗体体与与酶酶相相似似，都都是是蛋蛋白白质质分分子子，酶酶与与底底物物的的结结合合及及抗抗体体与与抗抗原原的的结结合合都都是是高高度度专专一一性性的的，但但这这两两种种结结合合的的基基本本区区别别在在于于酶酶与与高高能能的的过过渡渡态态分分子子相相结结合合，而而抗抗体体则则与与抗抗原原（基基态态分分子子）相相结结合合。利利用用抗抗体体能能与与抗抗原原特特异异结结合合的的原原理理可可用用过过度度态态类类似似物物作作为为半半抗抗原原来来诱诱发发抗抗体体，这这样样产产生生的的抗抗体体便便能能特特异异地地识识别别反反应应过过程程中中真真正正的的过过渡渡分分子子，从从而而降降低低反反应应的的活活化化能能。达达到到催催化化反反应应的的目目的的，这这种种具具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。54ppt课件 O C A.酯酶的底酯酶的底物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设设计计的的磷磷酸酸酯酯类类似似物物,作作为为抗抗原原去去免免疫疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的单克隆作用的单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体诱导法制备具有酯酶活性的抗体55ppt课件抗体酶的筛选抗体酶的筛选在在抗抗体体酶酶研研究究中中，一一个个不不可可少少的的步步骤骤是是在在细细胞胞融融合合后后筛筛选选到到能能分分泌泌催催化化抗抗体体的的细细胞胞克克隆隆。一一般般的的方方法法是是先先筛筛选选其其抗抗体体能能结结合合特特异异抗抗原原的的细细胞胞克克隆隆，再再从从纯纯化化的的抗抗体体中中筛筛选选出出有有催催化化能能力力的的单单抗抗。主主要要筛筛选选方方法法有有生生物物学学筛筛选选法和纯化学筛选法。法和纯化学筛选法。56ppt课件抗体酶的研究和应用前景抗体酶的研究和应用前景催催化化抗抗体体的的出出现现不不仅仅为为人人们们开开创创了了一一条条人人工工设设计计酶酶的的新新方方法法，也也使使人人们们对对催催化化过过程程中中催催化化剂剂的的作作用用机机理理和和催催化化剂和底物的相互识别有了进一步认识。剂和底物的相互识别有了进一步认识。目目前前已已经经发发现现具具有有催催化化作作用用的的自自身身抗抗体体在在生生物物体体内内的的存存在在，其其不不仅仅和和疾疾病病相相关关，可可能能还还参参与与了了生生物物体体内内的的某某些些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。充充分分利利用用抗抗体体的的种种类类繁繁多多以以及及抗抗体体酶酶的的可可诱诱导导、可可改改造造的的特特点点，可可望望制制备备出出具具有有治治疗疗和和辅辅助助治治疗疗某某些些疾疾病病或或催催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。化某类具有特殊意义反应的抗体酶。抗抗体体酶酶的的研研究究无无疑疑会会对对化化学学、生生物物学学、医医学学等等领领域域产产生生深远影响。深远影响。57ppt课件八、酶工程简介八、酶工程简介19711971年年第第一一届届国国际际酶酶工工程程会会议议上上得得到到命命名名。主主要要研研究究：酶酶的的生生产产、纯纯化化、固固定定化化技技术术、酶酶分分子子结结构构的的修修饰饰和和改改造及其在工、农、医药等领域的应用。造及其在工、农、医药等领域的应用。（一）酶工程的概念（一）酶工程的概念天然酶在开发和应用方面受到限制：天然酶在开发和应用方面受到限制：1.1.酶的不稳定性酶的不稳定性 2.2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵目前在酶的应用方面所采取的一般方法：目前在酶的应用方面所采取的一般方法：1.1.化化学学方方法法：通通过过对对酶酶的的化化学学修修饰饰或或固固定定化化处处理理，改改善善酶酶的的性性质质以以提提高高酶酶的的效效率率和和降降低低成成本本，或或通通过过化化学学合成法制造人工酶。合成法制造人工酶。2.2.利利用用基基因因重重组组技技术术生生产产酶酶以以及及对对酶酶基基因因进进行行修修饰饰或或设设计计新新基基因因，生生产产出出性性能能稳稳定定、具具有有新新的的生生物物活活性性以以及催化效率更高的酶。及催化效率更高的酶。58ppt课件（二）化学酶工程（二）化学酶工程化化学学酶酶工工程程亦亦称称初初级级酶酶工工程程，指指天天然然酶酶、化化学学修修饰饰酶酶、固固定定化酶及人工模拟酶的研究和应用。化酶及人工模拟酶的研究和应用。1.1.天天然然酶酶：主主要要指指工工业业用用酶酶，从从微微生生物物发发酵酵得得到到的的酶酶。如如：洗洗涤涤剂剂、皮皮革革生生产产中中用用的的蛋蛋白白酶酶；纸纸张张制制造造用用的的淀淀粉粉酶酶；乳乳制品用的凝乳酶等。制品用的凝乳酶等。2.2.化化 学学 修修 饰饰 酶酶：用用 于于 医医 药药 及及 研研 究究 工工 作作。通通 过过（1 1）化化学学修修饰饰酶酶的的功功能能基基 ；（2 2）通通过过交交联联反反应应；（3 3）大大分分子子修修饰饰作作用用（用用葡葡萄萄糖糖修修饰饰SODSOD增增加加其其半半寿寿期期，提提高高耐耐热热性性、耐耐酸酸碱性等。用葡萄糖和聚乙二醇修饰尿激酶等）。碱性等。用葡萄糖和聚乙二醇修饰尿激酶等）。3.3.固固定定化化酶酶(immobilized(immobilized enzyme)enzyme)：将将水水溶溶性性酶酶用用物物理理或或化化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。4.4.人人工工模模拟拟酶酶化化学学法法合合成成酶酶（已已知知酶酶的的活活性性中中心心和和作作 用用机理）。机理）。59ppt课件3.3.固定化酶固定化酶19711971年年在在第第一一届届国国际际酶酶工工程程会会议议上上正正式式采采用用固固定定化化酶酶名称名称酶的固定化方法：酶的固定化方法：物理法：吸附法和包埋法物理法：吸附法和包埋法 化学法：共价偶联法和交联法化学法：共价偶联法和交联法目前，我国利用固定化氨基酰化酶拆分目前，我国利用固定化氨基酰化酶拆分DL-AADL-AA；固定化的葡萄糖异构酶生产高果糖玉米糖浆；固定化的葡萄糖异构酶生产高果糖玉米糖浆；60ppt课件（三）生物酶工程（三）生物酶工程生生物物酶酶工工程程亦亦称称高高级级酶酶工工程程，是是酶酶学学和和以以DNADNA重重组组技技术术为为主的现代分子生物学技术相结合的产物。主的现代分子生物学技术相结合的产物。生物酶工程的主要内容：生物酶工程的主要内容：克克隆隆酶酶用用基基因因工工程程技技术术大大量量生生产产酶酶（-淀淀粉粉酶酶，青青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）突变酶突变酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（改改变变酶酶的的催催化化活活性性、底底物物专专一一性性、最最适适pHpH、改改变变酶酶的的别构调节能力、改变酶对辅酶的要求、提高酶的稳定性）别构调节能力、改变酶对辅酶的要求、提高酶的稳定性）制造新酶制造新酶设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶61ppt课件