免疫组织化学技术课件

免疫组化实验 1 1免疫组化实验 1参考书目参考书目1 1 实用生物组织学技术实用生物组织学技术 刘世新刘世新 科学出版社科学出版社2 2 组织病理技术组织病理技术 李甘地李甘地 人民卫生出版社人民卫生出版社2 2参考书目2Z形态学的研究方法包括形态学的研究方法包括生活观察生活观察(组织培养和细胞培养组织培养和细胞培养)死后观察死后观察(大体解剖技术、组织学技术、电镜技术、免大体解剖技术、组织学技术、电镜技术、免疫组织化学技术和细胞凋亡检测疫组织化学技术和细胞凋亡检测)Z 有利于课题设计和研究工作的开展有利于课题设计和研究工作的开展Z方法简单，实验过程成熟，实验仪器简单。方法简单，实验过程成熟，实验仪器简单。前言前言3 3形态学的研究方法包括前言3例子：例子：1 文章题目文章题目 重度妊高征胎盘组织细胞凋亡与重度妊高征胎盘组织细胞凋亡与重度妊高征胎盘组织细胞凋亡与重度妊高征胎盘组织细胞凋亡与HSP70HSP70，baxbax的表达的表达的表达的表达4 4例子：1 文章题目 重度妊高征胎盘组织细胞凋亡与HS1 12 2 方法方法1 12 21 1 标本收集标本收集 胎盘娩出后，立即从母体面随机选取胎盘娩出后，立即从母体面随机选取2 2块大块大小约为小约为3cm x 2cm xlcm3cm x 2cm xlcm的组织的组织(避开钙化灶避开钙化灶)生理盐水冲洗后，生理盐水冲洗后，每块标本切取约每块标本切取约1cm xlcm xlcm1cm xlcm xlcm的组织，的组织，40g/LPBS40g/LPBS甲醛溶液固定甲醛溶液固定用于电镜检查的组织放入用于电镜检查的组织放入25g/L25g/L的戊二醛液中固定其余部分立即的戊二醛液中固定其余部分立即置入置入7070冻存前者常规石蜡包埋，冻存前者常规石蜡包埋，4um4um连续切片备染连续切片备染1 12 22 2 光镜、电镜检查光镜、电镜检查 所有的标本均行光镜检查切片用苏所有的标本均行光镜检查切片用苏木精木精伊红染色，分别由两人观察，每张切片观察伊红染色，分别由两人观察，每张切片观察1010个高倍视野，个高倍视野，蜕膜组织细胞不计数在内使用透射电镜各检查蜕膜组织细胞不计数在内使用透射电镜各检查4 4例例SPIHSPIH及正常胎及正常胎盘组织所检标本与相对应的光镜检查切片取自同一胎盘组织块盘组织所检标本与相对应的光镜检查切片取自同一胎盘组织块1 12 23 3 免疫组化免疫组化 切片脱蜡后行抗原修复，分别滴加切片脱蜡后行抗原修复，分别滴加 HSP70HSP70及及baxbax抗体抗体4 4 过夜；过夜；DAKOEnvisionnDAKOEnvisionn加入后温育加入后温育1h1h，DABDAB显色苏显色苏木精复染，脱水封片光镜观察阳性结果为细胞内有棕黄色颗木精复染，脱水封片光镜观察阳性结果为细胞内有棕黄色颗粒出现，依显色程度分粒出现，依显色程度分3 3级：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐级：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐色为强阳性色为强阳性5 512 方法5 免疫组织化学免疫组织化学？6 66主要内容主要内容7 7主要内容石蜡切片技术免疫组化技术 图像采集与分析实验动物71 1 实验动物的处死实验动物的处死一一 实验动物实验动物2 2 取材方法及注意事项取材方法及注意事项3 3 标本的固定标本的固定8 81 实验动物的处死一 实验动物2 取材方法及注意事项3 标9 991010101 动物处死动物处死1 1、空气栓塞致死法、空气栓塞致死法:取取50-100ml50-100ml注射器注射器,从兔的耳静脉从兔的耳静脉或大动物的腹股沟的股静脉迅速注入或大动物的腹股沟的股静脉迅速注入.兔和猫的致死空兔和猫的致死空气量为气量为20-40ml.20-40ml.此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。2 2、脑、脊髓破坏法：用金属探针经枕骨大孔入，蛙类、脑、脊髓破坏法：用金属探针经枕骨大孔入，蛙类3 3、断椎发：大白鼠和小白鼠、断椎发：大白鼠和小白鼠4 4、麻醉后处死法：试剂：乙醚或氯仿、麻醉后处死法：试剂：乙醚或氯仿5-20ml5-20ml吸入麻醉法：适用于小白鼠、大白鼠、豚鼠及兔吸入麻醉法：适用于小白鼠、大白鼠、豚鼠及兔 注射麻醉法：适用于狗、猴等较大动物。注射麻醉法：适用于狗、猴等较大动物。5 5、急性大失血处死法：、急性大失血处死法：（1 1）眼球摘除放血：适用于小白鼠、大白鼠）眼球摘除放血：适用于小白鼠、大白鼠（2 2）血管切开放血：狗、猴及兔）血管切开放血：狗、猴及兔 11111 动物处死1、空气栓塞致死法:取50-100ml注射器121212取材方法取材方法 (3)(3)取材时严禁机械损伤，取材时严禁机械损伤，(4)(4)尽量注意脏器的完整性尽量注意脏器的完整性;管状或囊状组织不应管状或囊状组织不应斜切：剪开铺在硬纸板上，黏膜面朝上斜切：剪开铺在硬纸板上，黏膜面朝上(1)(1)取材的先后：消化管，肝脏、脾脏等多血器官及神取材的先后：消化管，肝脏、脾脏等多血器官及神经组织，其他脏器。经组织，其他脏器。(2)(2)取材的大小：一般取材的大小：一般2cm1.5cm0.3cm,2cm1.5cm0.3cm,较小的组织较小的组织如淋巴结、脑垂体应整个固定。如淋巴结、脑垂体应整个固定。脑组织较柔软，最好用纱布包裹后在固定，脑组织较柔软，最好用纱布包裹后在固定，1313取材方法(3)取材时严禁机械损伤，(1)取材的先后：消化管取材*准确，快速，完整，有代表性准确，快速，完整，有代表性准确，快速，完整，有代表性准确，快速，完整，有代表性n n动物标本：动物标本：动物标本：动物标本：-大型动物：快大型动物：快大型动物：快大型动物：快-小型动物：灌注固定小型动物：灌注固定小型动物：灌注固定小型动物：灌注固定-手术标本：尽量包括病灶部位手术标本：尽量包括病灶部位手术标本：尽量包括病灶部位手术标本：尽量包括病灶部位/病灶与正常组织病灶与正常组织病灶与正常组织病灶与正常组织交界处交界处交界处交界处/病灶周围正常组织病灶周围正常组织病灶周围正常组织病灶周围正常组织n n体外培养的细胞标本：体外培养的细胞标本：体外培养的细胞标本：体外培养的细胞标本：-贴壁生长细胞：爬片贴壁生长细胞：爬片贴壁生长细胞：爬片贴壁生长细胞：爬片-悬浮生长细胞：离心沉淀涂片悬浮生长细胞：离心沉淀涂片悬浮生长细胞：离心沉淀涂片悬浮生长细胞：离心沉淀涂片1414取材*准确，快速，完整，有代表性14标本固定标本固定目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。(1)(1)常用的固定液：常用的固定液：(3)Bouin(3)Bouin液液甲醛：甲醛：10ml10ml苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液(0.9)(0.9)75ml75ml蒸馏水：蒸馏水：90ml 90ml 甲醛甲醛 25ml 25ml 冰醋酸冰醋酸 5ml5ml(2)(2)中性缓冲甲醛固定液：中性缓冲甲醛固定液：多聚甲醛：多聚甲醛：g g蒸馏水：蒸馏水：100ml100mlNaHNaH2 2POPO4 4.H.H2 2O:4gO:4gNaNa2 2HPOHPO4:4:6.5g 6.5g1515标本固定目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不标本固定标本固定目的：目的：防止细胞、组织溶解及腐败，以保持细防止细胞、组织溶解及腐败，以保持细胞与生活时的形态相似。胞与生活时的形态相似。物质定位在原有部位。物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。同亲和力，利于着色。固定剂还有硬化作用。固定剂还有硬化作用。对象：蛋白质对象：蛋白质 1616标本固定目的：16标本固定标本固定目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。生不同折光率，及对染料的不同亲和力，利于着色。(2)(2)中性缓冲甲醛固中性缓冲甲醛固定液：定液：多聚甲醛：多聚甲醛：g g蒸馏水：蒸馏水：100ml100mlNaHNaH2 2POPO4 4.H.H2 2O:4gO:4gNaNa2 2HPOHPO4:4:6.5g 6.5g(1)(1)10%10%甲醛固定液：甲醛固定液：甲醛甲醛（市售含量为（市售含量为36-40%36-40%）10ml10ml蒸馏水：蒸馏水：90ml90ml(3)Bouin(3)Bouin液液苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液(0.9%-(0.9%-1.2%)1.2%)75ml75ml甲醛甲醛 25ml25ml 冰醋酸冰醋酸 5ml5ml1717标本固定目的：防止细胞自溶，物质定位在原有部位。经固定产生不固定注意事项固定注意事项1 1固定时间要快固定时间要快 2 2固定液的用量为组织块体积的固定液的用量为组织块体积的15-2015-20倍倍3 3固定时间固定时间4 4固定液避光，以免发生化学变化固定液避光，以免发生化学变化1818固定注意事项18二二 石蜡切片石蜡切片1 1 石蜡切片组织固定后的处理石蜡切片组织固定后的处理n n组织块的修整组织块的修整 n n洗涤洗涤:目的把组织中的固定液彻底洗掉，自来水目的把组织中的固定液彻底洗掉，自来水流水冲洗。流水冲洗。（1 1）各种以水配置的固定液，必须的。）各种以水配置的固定液，必须的。（2 2）固定液为酒精或酒精混合液，不需要。）固定液为酒精或酒精混合液，不需要。1919二 石蜡切片1 石蜡切片组织固定后的处理19脱水：脱水：常用脱水剂：常用脱水剂：（1 1）非石蜡溶剂的脱水剂：酒精）非石蜡溶剂的脱水剂：酒精 70%70%酒精开始逐渐过度到无水已醇酒精开始逐渐过度到无水已醇 入入 二甲苯二甲苯 （70%-80%70%-80%70%-80%70%-80%酒精可以作为组织的长久保存液）酒精可以作为组织的长久保存液）酒精可以作为组织的长久保存液）酒精可以作为组织的长久保存液）（2 2）脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇、叔丁醇）脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：正丁醇、叔丁醇每次更换新的脱水剂，把每次更换新的脱水剂，把组织放到吸水纸上吸干，组织放到吸水纸上吸干，装组织的容器，装组织的容器，也要控感水分，也要控感水分，呦呦2020每次更换新的脱水剂，把组织放到吸水纸上吸干，装组织的容器，也二二 石蜡切片石蜡切片透明透明 当组织浸入当组织浸入当组织浸入当组织浸入透明液立即透明液立即透明液立即透明液立即变浑浊，表变浑浊，表变浑浊，表变浑浊，表面像蒙了一面像蒙了一面像蒙了一面像蒙了一层薄雾一样层薄雾一样层薄雾一样层薄雾一样不透明，脱不透明，脱不透明，脱不透明，脱水不净水不净水不净水不净光线基本光线基本能透过组能透过组织，组织织，组织呈透明或呈透明或半透明立半透明立即取出，即取出，避免时间避免时间过长过长咋算咋算透明透明达到达到效果，效果，啊？啊？2121二 石蜡切片透明 当组织浸入透明液立即变浑浊，表面像蒙了一二二 石蜡切片石蜡切片浸蜡和包埋：浸蜡和包埋：注意事项：注意事项：n n浸蜡温度浸蜡温度60 60 横温箱中横温箱中2 2个小时，注意温度和时间个小时，注意温度和时间n n包埋：包埋：n n切面向下切面向下n n包埋面必须平整，太细小的组织可以在脱水、透包埋面必须平整，太细小的组织可以在脱水、透明时就开始用伊红染料稍微染色或用擦镜纸包埋明时就开始用伊红染料稍微染色或用擦镜纸包埋n n包埋温度与浸蜡温度一致包埋温度与浸蜡温度一致n n包埋速度要快包埋速度要快2222二 石蜡切片浸蜡和包埋：22二二 石蜡切片石蜡切片1 1 1 1切片前准备切片前准备2 2 2 2 3 3 3 3 磨磨刀刀载玻片擦洗干载玻片擦洗干净，表面涂上净，表面涂上蛋白甘油蛋白甘油2323二 石蜡切片切片前准备磨刀载玻片擦洗干净，表面涂上蛋白甘油切片中容易切片中容易出现的问题出现的问题 解决办法？解决办法？2424切片中容易出现的问题24染色染色2525染色25 H EH E染色染色2626 H E染色26 镀银染色镀银染色 应用硝酸银、氯化金等金属盐染色法可显应用硝酸银、氯化金等金属盐染色法可显示组织和细胞的一些特殊结构。镀银染色染示组织和细胞的一些特殊结构。镀银染色染色是组织学常用的一种方法，可用来显示神色是组织学常用的一种方法，可用来显示神经元纤维、突触、神经末梢、网状纤维等。经元纤维、突触、神经末梢、网状纤维等。2727 镀银染色 应用硝酸银、氯化金等金属盐染色法可显示组织和细282828 兔肝兔肝 PASPAS染色染色 猫气管猫气管 阿利新蓝染色阿利新蓝染色 碳水化合物组织化学染色碳水化合物组织化学染色 2929 兔肝 PAS染色 猫气管 阿利新蓝染色 碳水化合物组织脂类组织化学染色脂类组织化学染色用苏丹红染兔皮下脂肪组织内的脂滴呈鲜红色3030脂类组织化学染色用苏丹红染兔皮下脂肪组织内的脂滴呈鲜红色30313131免疫组织化学与免疫细胞化学技术Immunohistochemistry and Immunohistochemistry and immunocytochemistryimmunocytochemistry3232免疫组织化学与免疫细胞化学技术Immunohistoc概述n n免疫组织化学，又称免疫细胞化学免疫组织化学，又称免疫细胞化学免疫组织化学，又称免疫细胞化学免疫组织化学，又称免疫细胞化学 带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗原抗原抗原-抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。进行定性、定位、定量测定的一项新技术。进行定性、定位、定量测定的一项新技术。进行定性、定位、定量测定的一项新技术。将血清学将血清学将血清学将血清学抗原、抗体特异性结合和显微镜示踪抗原、抗体特异性结合和显微镜示踪抗原、抗体特异性结合和显微镜示踪抗原、抗体特异性结合和显微镜示踪法相结合的一种技术方法；将免疫反应的特异性、组法相结合的一种技术方法；将免疫反应的特异性、组法相结合的一种技术方法；将免疫反应的特异性、组法相结合的一种技术方法；将免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括包括包括包括荧光显微镜、电子显微镜荧光显微镜、电子显微镜荧光显微镜、电子显微镜荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细的显像和放大作用，在细的显像和放大作用，在细的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质胞、亚细胞水平检测各种抗原物质胞、亚细胞水平检测各种抗原物质胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、如蛋白质、多肽、如蛋白质、多肽、如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等酶、激素、病原体以及受体等酶、激素、病原体以及受体等酶、激素、病原体以及受体等)。3333概述免疫组织化学，又称免疫细胞化学33特点及优点n n特点:特异性强,灵敏度高n n优点:n n 将形态学改变与功能和代谢结合起来n n 保存形态学观察的优点n n 克服免疫学只能定量和定性不能定位的缺点3434特点及优点特点:特异性强,灵敏度高34发 展 简 史时间时间时间时间人物人物人物人物技术技术技术技术19411941年年 CoonsCoons荧光素标记抗体荧光素标记抗体19681968年年 中根一穗中根一穗(Nakane)(Nakane)酶标记抗体酶标记抗体19741974年年 SternbergerSternberger辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶-抗氧化物酶抗氧化物酶(PAP)(PAP)技术技术19751975年年 Koehler and Koehler and MilsteinMilstein单克隆抗体单克隆抗体19811981年年 许世明许世明(Hsu)(Hsu)亲合组织化学技术亲合组织化学技术-(ABC)-(ABC)法法随后随后相继出现相继出现免疫金银染色法免疫金银染色法免疫电镜技术免疫电镜技术原位杂交技术原位杂交技术3535发 展 简 史时间人物技术1941年Coons荧光素标记抗体-抗原的提取与纯化；-制备特异性抗体以及抗体的纯化；-标记抗体；-标本的制备；-免疫细胞化学染色；-观察结果。内 容3636-抗原的提取与纯化；内 容36抗原(antigen,Ag)n n抗原抗原(antigen,Ag)在适当的条件下，能剌在适当的条件下，能剌激机体的免疫系统发生免疫应答，产生激机体的免疫系统发生免疫应答，产生抗抗原受体（抗体或致敏淋巴细胞）原受体（抗体或致敏淋巴细胞）,并能与相并能与相应受体在体内或体外特异性结合的物质。应受体在体内或体外特异性结合的物质。3737抗原(antigen,Ag)抗原(antigen,Ag)在适抗原(antigen,Ag)特性：特性：特性：特性：-免疫原性：能诱导机体产生抗体，由免疫原性：能诱导机体产生抗体，由免疫原性：能诱导机体产生抗体，由免疫原性：能诱导机体产生抗体，由抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇决定决定决定决定-反应原性：能特异性地与抗体结合的能力反应原性：能特异性地与抗体结合的能力反应原性：能特异性地与抗体结合的能力反应原性：能特异性地与抗体结合的能力*抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇抗原决定簇（antigenic determinant):antigenic determinant):抗原分子表面抗原分子表面抗原分子表面抗原分子表面的一些特殊的化学活性基团区域，是抗原与抗体特异的一些特殊的化学活性基团区域，是抗原与抗体特异的一些特殊的化学活性基团区域，是抗原与抗体特异的一些特殊的化学活性基团区域，是抗原与抗体特异结合的基本单位，不同种属的动物结合的基本单位，不同种属的动物结合的基本单位，不同种属的动物结合的基本单位，不同种属的动物抗原决定簇完全或抗原决定簇完全或抗原决定簇完全或抗原决定簇完全或部分相同，因此从一种动物提取的某一抗原制备的抗部分相同，因此从一种动物提取的某一抗原制备的抗部分相同，因此从一种动物提取的某一抗原制备的抗部分相同，因此从一种动物提取的某一抗原制备的抗体可在多种动物中进行相同抗原检测。体可在多种动物中进行相同抗原检测。体可在多种动物中进行相同抗原检测。体可在多种动物中进行相同抗原检测。分类：分类：分类：分类：-蛋白质抗原蛋白质抗原蛋白质抗原蛋白质抗原/多糖抗原多糖抗原多糖抗原多糖抗原/核酸抗原核酸抗原核酸抗原核酸抗原/低分子量物质抗原低分子量物质抗原低分子量物质抗原低分子量物质抗原/氨氨氨氨基酸抗原基酸抗原基酸抗原基酸抗原3838抗原(antigen,Ag)特性：38抗体（antibody,Ab)n n免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig)为机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞（浆细胞）分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白 包括：IgGIgAIgMIgDIgE3939抗体（antibody,Ab)免疫球蛋白（immunoglo抗体（antibody,Ab)n n 结构：结构：-两条重链（两条重链（H H链）链）-两条轻链（两条轻链（L L链）链）可变区（可变区（variable region,Vvariable region,V区）：区）：L L链链1/21/2及及H H链链1/41/4区域内的氨基区域内的氨基酸排列顺序可变。酸排列顺序可变。决定抗体的特异性决定抗体的特异性 是识别并与抗原决定簇结合的部位是识别并与抗原决定簇结合的部位恒定区（恒定区（constant region,Cconstant region,C区）：同一种属动物区）：同一种属动物同一型同一型IgIg的氨基酸排列顺序相同的氨基酸排列顺序相同 这是制备二抗，应用间接法标记信号放大的理这是制备二抗，应用间接法标记信号放大的理论基础论基础4040抗体（antibody,Ab)结构：40抗体（antibody,Ab)种类：种类：-多克隆抗体（多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb):polyclonal antibody,PcAb):血清抗体血清抗体-单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody,McAbmonoclonal antibody,McAb-基因工程抗体：采用基因工程抗体：采用DNADNA重组技术所生产的抗体重组技术所生产的抗体4141抗体（antibody,Ab)种类：41-多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。免疫后，从血清中分离提纯的抗体。免疫后，从血清中分离提纯的抗体。免疫后，从血清中分离提纯的抗体。-单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体:Kohler:Kohler和和和和MilsteinMilstein在在在在7070年代初发明，年代初发明，年代初发明，年代初发明，将抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人将抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人将抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人将抗原免疫小鼠后，用小鼠脾脏淋巴细胞与体外培养的人骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活骨髓瘤细胞株在一定的条件下融合，形成具有长期存活并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后形成单个并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后形成单个并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后形成单个并能分泌抗体的杂交瘤细胞，将其分离培养后形成单个瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔瘤细胞的克隆。培养上清或将杂交瘤细胞注入裸鼠腹腔产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的产生的腹水中都含有瘤细胞分泌的Ig,Ig,即即即即McAbMcAb 具有高特异性和高稳定性具有高特异性和高稳定性具有高特异性和高稳定性具有高特异性和高稳定性4242-多克隆抗体（血清抗体）：机体接受抗原的主动或被动免疫后，从抗体的标记抗原-抗体复合物（不可见）+标记物=发光或显色（可见）标记物特点：1）与抗体形成牢固共价键2）不影响抗原与抗体的结合3）放大的效益高4）原位显示4343抗体的标记抗原-抗体复合物（不可见）+标记物=发光或显色（可抗体的标记标记物的种类：/荧光素*（免疫荧光组织化学技术）/酶*（酶标抗体法,免疫酶组织化学技术）/生物素*（亲合免疫组织化学技术）/铁蛋白/胶体金*（免疫金银标记技术）/葡萄球菌A蛋白/放射性核素4444抗体的标记标记物的种类：44免疫荧光组织化学技术 免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的免疫荧光细胞化学技术是采用荧光素标记的已知抗体已知抗体已知抗体已知抗体(或抗原或抗原或抗原或抗原)作为探针，检测待测组织、细作为探针，检测待测组织、细作为探针，检测待测组织、细作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原胞标本中的靶抗原胞标本中的靶抗原胞标本中的靶抗原(或抗体或抗体或抗体或抗体)，形成的抗原抗体复，形成的抗原抗体复，形成的抗原抗体复，形成的抗原抗体复合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压合物带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原这样就可以分辨出抗原这样就可以分辨出抗原这样就可以分辨出抗原(或抗体或抗体或抗体或抗体)的所在位置及其的所在位置及其的所在位置及其的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。4545免疫荧光组织化学技术 免疫荧光细胞化学技术是将已知的抗原或抗体标记上荧光素将已知的抗原或抗体标记上荧光素,荧光素受激发光的照荧光素受激发光的照射，由低能状态进入射，由低能状态进入 高能状态，电子越迁后，辐射光量高能状态，电子越迁后，辐射光量子释放能量回到原来的低能态。这时发出明亮的荧光。子释放能量回到原来的低能态。这时发出明亮的荧光。被荧光显微镜扑捉，从而对抗原进行定位、定量。被荧光显微镜扑捉，从而对抗原进行定位、定量。免疫荧光组织化学技术一一 原理原理4646将已知的抗原或抗体标记上荧光素,荧光素受激发光的照射，由低能荧光标记物n n异硫氰酸荧光素（Fluorenscein isothiocyanate,FITC)-性状：分子量为389D黄色结晶粉末-吸收光谱：490495nm-发射光谱：520530nm，明亮黄绿色荧光-1个IgG最多可结合15-20个FITC分子4747荧光标记物47荧光标记物n n四甲基异硫氰酸罗丹明（四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TMRITC)rhodamine isothiocyanate,TMRITC)-性状：紫红色粉末性状：紫红色粉末-吸收光谱：吸收光谱：550nm550nm-发射光谱：发射光谱：620nm620nm，橙红色荧光，橙红色荧光4848荧光标记物四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rh 免疫荧光组织化学技术二二 实验方法实验方法 1 1直接法直接法又称一步法，又称一步法，又称一步法，又称一步法，荧光标记已知特异性抗体荧光标记已知特异性抗体(抗原抗原)直接用于细胞或组织抗原直接用于细胞或组织抗原(抗体抗体)的检测的检测 特点：特异性高，敏感性差，不方便特点：特异性高，敏感性差，不方便特点：特异性高，敏感性差，不方便特点：特异性高，敏感性差，不方便4949 免疫荧光组织化学技术BACK二 实验方法 1直接法又称 免疫荧光组织化学技术二二 实验方法实验方法间接法间接法 又称又称sandwith method,sandwith method,夹心法）夹心法）抗原抗原+一抗一抗+带荧光素二抗带荧光素二抗(抗种属特异性的抗种属特异性的IgGIgG荧光抗体荧光抗体)已知抗原已知抗原+待测血清待测血清+带荧光素二抗带荧光素二抗(抗种属特异性的抗种属特异性的IgGIgG荧光抗体荧光抗体)特点：特点：-不必标记一抗，多种一抗可使用相同二抗不必标记一抗，多种一抗可使用相同二抗 -敏感性高，但特异差敏感性高，但特异差二抗二抗5050 免疫荧光组织化学技术BACK二 实验方法间接法 又称s 免疫荧光组织化学技术二二 实验方法实验方法编号编号 品种品种 价格价格BA1101 BA1101 羊抗小鼠羊抗小鼠IgGFITC 140IgGFITC 140元元/0.1ml/0.1mlBA1108 BA1108 兔抗大鼠兔抗大鼠IgGFITC 160IgGFITC 160元元/0.1ml/0.1ml二抗二抗5151 免疫荧光组织化学技术BACK二 实验方法编号 品种 免疫荧光组织化学技术二二 实验方法实验方法3 3 双重免疫荧光组织化学标记方法双重免疫荧光组织化学标记方法在同一组织标本上同时检查两种抗原,如分别用如分别用FITCFITC标记的抗鼠标记的抗鼠IgGIgG及及CY3CY3标记的抗兔标记的抗兔IgGIgG染标染标本本.可以明确显示两种抗原的定位可以明确显示两种抗原的定位.5252 免疫荧光组织化学技术BACK二 实验方法3 双重免疫荧光免疫荧光组织化学染色方法（一）标本制作（一）标本制作一般使用冰冻切片、细胞涂片，以冷丙酮固定一般使用冰冻切片、细胞涂片，以冷丙酮固定（二）荧光抗体染色方法（二）荧光抗体染色方法切片或涂片固定后，置于染色湿盒内切片或涂片固定后，置于染色湿盒内滴加未标记的特异性抗原作用切片于滴加未标记的特异性抗原作用切片于3737，30min30minPBSPBS水洗水洗2 2次，每次次，每次5min,5min,吹干吹干滴加特异性荧光抗体在切片上滴加特异性荧光抗体在切片上3737，30min30minPBSPBS水洗水洗2 2次，每次次，每次5min,5min,吹干吹干缓冲甘油封固，镜检缓冲甘油封固，镜检。5353免疫荧光组织化学染色方法（一）标本制作53荧光标记抗体优、缺点：-随着免疫酶标抗体的出现而应用减少-仍用：能对活细胞染色，用于培养细胞、肾炎、皮肤免疫性疾病的研究及诊断，病原体及自身抗体的检测。-新用：流式细胞术（FCM）/荧光激活细胞分类器（FACS）/激光扫描共焦显微镜（LSCM）5454荧光标记抗体优、缺点：BACK54免疫酶组织化学技术n n用酶用酶(如辣根过氧化物酶如辣根过氧化物酶)标记已知抗体标记已知抗体(或抗原或抗原)，然后与组织标本在一定条件，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原下反应，如果组织中含有相应抗原(或或抗体抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原这样就可以识别出标本抗原(抗体抗体)分布分布的位置和性质，通过图像分析并可达到的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的定量的目的5555免疫酶组织化学技术用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗一一 酶标记抗体酶标记抗体理想的标记酶：理想的标记酶：-活性高且稳定活性高且稳定-终产物稳定，不扩散终产物稳定，不扩散-不影响抗原、抗体反应不影响抗原、抗体反应-组织及体内无内源性酶及底物组织及体内无内源性酶及底物*没有完全满足条件的酶没有完全满足条件的酶免疫酶组织化学技术5656一 酶标记抗体理想的标记酶：免疫酶组织化学技术56n n（一（一（一（一 ）辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（horseredish horseredish peroxidase,HRP)peroxidase,HRP)n n特点：特点：特点：特点：n n-分子量：分子量：分子量：分子量：40000D40000D，穿透性好，穿透性好，穿透性好，穿透性好n n-PH3.512-PH3.512范围内稳定范围内稳定范围内稳定范围内稳定n n-底物：底物：底物：底物：H2O2H2O2n n-反应式：反应式：反应式：反应式：HRP+H2O2=HRP.H2O2HRP+H2O2=HRP.H2O2n n HRP.H2O2+DH2 HRP+D+2H2O HRP.H2O2+DH2 HRP+D+2H2On n-D=-D=供氢体供氢体供氢体供氢体,常用常用常用常用3,3-3,3-二氨基联苯胺二氨基联苯胺二氨基联苯胺二氨基联苯胺(3,3-(3,3-diaminobezidine,DAB),diaminobezidine,DAB),注意注意注意注意:有毒有毒有毒有毒,避光避光避光避光n n-反应式反应式反应式反应式:DAB:DAB 吲达氨聚合体吲达氨聚合体吲达氨聚合体吲达氨聚合体DABDAB棕棕棕棕(棕色颗粒棕色颗粒棕色颗粒棕色颗粒)n n n n HRP HRP催化脱氢聚合催化脱氢聚合催化脱氢聚合催化脱氢聚合 氧化氧化氧化氧化 5757（一）辣根过氧化物酶（horseredish pero辣根过氧化物酶标记抗体n n优点优点:-稳定稳定-反应效率高反应效率高,25,25分钟形成反应产物分钟形成反应产物n n问题问题:-内源性过氧化物酶存在内源性过氧化物酶存在(如粒细胞如粒细胞 骨髓造血干细骨髓造血干细胞中胞中)对策对策:用用3%3%过氧化氢溶液或过氧化氢溶液或1%1%过氧化氢过氧化氢-甲醇液甲醇液处理切片处理切片,尤其冰冻切片尤其冰冻切片)-DAB-DAB有毒有毒对策对策:戴手套戴手套5858辣根过氧化物酶标记抗体优点:58二 碱性磷酸酶n n(alkaline phosphatase,AP)-分子量:80000D-PH值:8.9-催化反应:-萘酚磷酸酯萘酚磷酸酯+H+H2 2O O 萘酚萘酚+磷酸盐磷酸盐 萘酚萘酚+偶氮染料偶氮染料(快红与快兰快红与快兰)红色或兰色沉淀红色或兰色沉淀 APAP APAP采用戊二醛标记在抗体上采用戊二醛标记在抗体上,可以用于可以用于Western BlottingWestern Blotting免疫细免疫细胞化学胞化学ELISAELISA5959二 碱性磷酸酶(alkaline phosphataseAP标记抗体问题:-内源性AP的广泛存在(如肝胎盘小肠绒毛骨基质肾小管上皮)对策:在孵育液中加入左旋咪唑抑制内源性AP或用石蜡包埋-适用于血细胞及骨髓切片的免疫组化染色(HRP强)6060AP标记抗体问题:60染色程序n n免疫酶组化技术:/酶标记法:将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体 /非标记抗体技术，将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应6161染色程序免疫酶组化技术:61染色程序1 1 直接法：直接法：n n石蜡切片按免疫组化常规处理，石蜡切片按免疫组化常规处理，PBSPBS洗洗5min5minn n0.3%H0.3%H2 2O O2 2室温室温10min 10min n n10%10%正常羊血清封闭，室温正常羊血清封闭，室温15min15minn n滴加适当稀释的酶标一抗，滴加适当稀释的酶标一抗，3737，30min30min n nPBSPBS水洗水洗2 2次，每次次，每次5min,5min,n n加酶的底物溶液（加酶的底物溶液（DABDAB或或 -萘酚磷酸酯萘酚磷酸酯）孵育）孵育10min10minpp镜下观察特异性染色清晰，封片。镜下观察特异性染色清晰，封片。6262染色程序1 直接法：62二 酶标记抗体染色程序1 1 间接法：间接法：间接法：间接法：n n石蜡切片按免疫组化常规处理，石蜡切片按免疫组化常规处理，石蜡切片按免疫组化常规处理，石蜡切片按免疫组化常规处理，PBSPBS洗洗洗洗5min5minn n0.3%H0.3%H2 2OO2 2室温室温室温室温10min 10min n n10%10%正常羊血清封闭，室温正常羊血清封闭，室温正常羊血清封闭，室温正常羊血清封闭，室温15min15minn n滴加适当稀释的特异性抗体滴加适当稀释的特异性抗体滴加适当稀释的特异性抗体滴加适当稀释的特异性抗体(一抗一抗一抗一抗)，3737，30min30min n nPBSPBS水洗水洗水洗水洗2 2次，每次次，每次次，每次次，每次5min,5min,n n滴加适当稀释的酶标二抗孵育滴加适当稀释的酶标二抗孵育滴加适当稀释的酶标二抗孵育滴加适当稀释的酶标二抗孵育3737，30min30min n n加酶的底物溶液（加酶的底物溶液（加酶的底物溶液（加酶的底物溶液（DABDAB或或或或 -萘酚磷酸酯）孵育萘酚磷酸酯）孵育萘酚磷酸酯）孵育萘酚磷酸酯）孵育10min10minl l镜下观察特异性染色清晰，封片。镜下观察特异性染色清晰，封片。镜下观察特异性染色清晰，封片。镜下观察特异性染色清晰，封片。6363二 酶标记抗体染色程序1 间接法：63n n亲和组织化学（affinity histochemistry):利用某些亲和物质对之间的高度亲和特性，将酶、荧光素等标记物与亲合物质连接，对抗原或者其他靶物质进行定位和定量的方法。亲和物质对：生物素/亲和素、激素/受体、植物凝集素/糖类、葡萄球菌A蛋白/IgG亲和免疫组化技术6464亲和组织化学（affinity histochemistryn n生物素（生物素（biotin)biotin)又称维生素又称维生素H H或辅酶或辅酶R R -性质：分子式性质：分子式 C C1010H H1616C C3 3N N2 2S S；分子量；分子量244244 -作用：羧化酶的辅酶，作用：羧化酶的辅酶，n n亲和素（亲和素（avidin),avidin),又称卵白素或抗生物素：又称卵白素或抗生物素：-性质：分子量性质：分子量68kD68kD碱性蛋白，由碱性蛋白，由4 4个个128128个氨个氨基酸组成的亚基构成基酸组成的亚基构成n n结合：结合：-方式：非共价键结合，不可逆方式：非共价键结合，不可逆 -1-1分子亲和素：分子亲和素：4 4分子生物素分子生物素 -PH1.5-PH1.5时可完全分离时可完全分离生物素-亲和素系统6565生物素（biotin)又称维生素H或辅酶R生物素-亲和素系统生物素-亲和素系统优点-生物素分子量小,1个抗体:150个生物素分子-不影响抗原抗体结合的能力-酶与生物素结合,不影响催化活性-亲合素也可与荧光素酶等标记物偶联-灵敏度高特异性强稳定性好无放射性污染方便快速6666生物素-亲和素系统优点-生物素分子量小,1个抗体:150个生亲和素-生物素方法n nABC法特点：-敏感性高-背景清晰-适用于单克隆抗体ABC复合物ABCABC复合物复合物6767亲和素-生物素方法ABC法特点：ABC复合物ABC复合物67分类：分类：n n亲和素亲和素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术（过氧化酶复合物技术（avidin avidin biotin-peroxidase complex technique,ABC)biotin-peroxidase complex technique,ABC)SABC(StrepAvidin biotin-peroxidase complex)SABC(StrepAvidin biotin-peroxidase complex)(链霉亲和素链霉亲和素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术)n n酶标亲和素酶标亲和素-生物素技术生物素技术(labeled avidin-biotin(labeled avidin-biotin technique,LABtechnique,LAB技术）技术）6868分类：68SABC和LAB(SP)方法染色程序材料材料:冰冻切片或石蜡切片材料冰冻切片或石蜡切片材料:冰冻切片或石蜡切片冰冻切片或石蜡切片阻断内源性酶阻断内源性酶 阻断内源性酶阻断内源性酶10%10%正常羊血清正常羊血清,室温室温15min 15min 10%10%正常羊血清正常羊血清,室温室温15min15min适当稀释的一抗适当稀释的一抗,室温室温30min 30min 适当稀释的一抗适当稀释的一抗,室温室温30min30minPBSPBS洗洗3 3次次,每次每次5min 5min PBSPBS洗洗3 3次次,每次每次5min5min 加生物素标记的二抗加生物素标记的二抗,30min,30min 加加25-50ug/ml25-50ug/ml生物素标记的二抗生物素标记的二抗,60min,60minPBSPBS洗洗3 3次次,每次每次5min PBS5min PBS洗洗3 3次次,每次每次5min5min 加加ABCABC复合物复合物,室温室温30min 30min 加加25-50ug/mlHRP25-50ug/mlHRP标记的亲合素标记的亲合素,60min,60minPBSPBS洗洗3 3次次,每次每次5min PBS5min PBS洗洗3 3次次,每次每次5min5min加底物显色加底物显色,封片封片.加底物显色加底物显色,封片封片6969SABC和LAB(SP)方法染色程序材料:冰冻切片或石蜡切片双重免疫组化染色n n阻断法：先染第一种抗原，显色后用酸洗去已标记的Ag-Ab复合物，再进行第二重染色。*如：第一重染色用过氧化物酶标记的亲和素-生物素系统显示第一种抗原/第二重染色用碱性磷酸酶标记的亲和素-生物素系统显示第二种抗原7070双重免疫组化染色阻断法：先染第一种抗原，显色后用酸洗去已标记免疫组化染色选择原则-specificity,特异性-sensitivity,敏感性-simplicity,简便性-safely,安全性-save of time and money,省时省钱7171免疫组化染色选择原则-specificity,特异性71非特异性染色n n非特异性染色（非特异性染色（non-specific staining),non-specific staining),也称背景也称背景染色染色原因：原因：-组织自发荧光组织自发荧光-内源性酶内源性酶-内源性生物素内源性生物素-抗体或酶不纯抗体或酶不纯-标记过量标记过量7272非特异性染色非特异性染色（non-specific stai非特异性染色n n解决方法：解决方法：例：例：-一抗前用二抗同种动物血清封闭组织中一抗前用二抗同种动物血清封闭组织中FCFC受体及电受体及电荷，避免其与第二抗体的非特异性结合荷，避免其与第二抗体的非特异性结合-3%H-3%H2 2O O2 2封闭内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶-0.010.05%-0.010.05%伊文思蓝稀释荧光抗体，将背景染成伊文思蓝稀释荧光抗体，将背景染成红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成对比。红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成对比。-10%-10%牛血清白蛋白封闭法，消除游离醛基与牛血清白蛋白封闭法，消除游离醛基与IgGIgG产产生非特异性染色，提高特异性染色生非特异性染色，提高特异性染色7373非特异性染色解决方法：73抗体的保存n n方法：-长期不用：冻存，密封，有效期可长达数年-短期内频繁使用：4 ，可保存数周-稀释抗体：一周内用完7474抗体的保存方法：74抗体的浓度n n可按推荐浓度，或自行测定稀释度可按推荐浓度，或自行测定稀释度n n用用0.01mol/L PBS0.01mol/L PBS缓冲液稀释抗体缓冲液稀释抗体(如稀释抗体需如稀释抗体需长期保存长期保存,可在可在100ml 0.05mol/L PH 7.4 TBS 100ml 0.05mol/L PH 7.4 TBS 加牛加牛血清白蛋白血清白蛋白1g,NaN1g,NaN3 3 0.2g,0.2g,明胶明胶0.1g,0.1g,稀释抗体稀释抗体)*前带效应前带效应(prozone effect):(prozone effect):抗体浓度过高抗体浓度过高,阳性反应阳性反应反而减弱或呈假阴性的现象反而减弱或呈假阴性的现象,可能是由于一抗分子可能是由于一抗分子过多过多,竟争抗原结合位点竟争抗原结合位点,导致抗原导致抗原-抗体结合不稳抗体结合不稳及脱落。及脱落。7575抗体的浓度可按推荐浓度，或自行测定稀释度75染色结果判断标准：标准：-阳性颗粒分布于胞质内、膜上或核内，阳性颗粒分布于胞质内、膜上或核内，细胞边界和核结构清晰细胞边界和核结构清晰-细胞间抗原含量不同，染色强度应有细胞间抗原含量不同，染色强度应有区别区别,如相同，可能是非特异性染色如相同，可能是非特异性染色*边缘效应：在石蜡切片的组织周围常边缘效应：在石蜡切片的组织周围常见有深染区，向中心区逐渐变淡，称见有深染区，向中心区逐渐变淡，称边缘效应。为非特异染色，也可在刀边缘效应。为非特异染色，也可在刀痕、折叠及坏死与受挤压的部位出现痕、折叠及坏死与受挤压的部位出现7676染色结果判断标准：76777777787878对照实验n n阳性对照：-用已知抗原为阳性的标本与待检测标本同时进行染色n n阴性对照：-与上述相反 -不加一抗7979对照实验阳性对照：79组织细胞的标本制备n n原则：尽可能多地保存抗原和尽可能多地保存组织与细胞的形态学8080组织细胞的标本制备原则：尽可能多地保存抗原和尽可能多地保存组常用固定剂n n4%多聚甲醛缓冲液多聚甲醛缓冲液-配法：取多聚甲醛配法：取多聚甲醛40g，溶于，溶于0.1mol/L pH7.4 PBS 500ml,搅拌均匀，加热至搅拌均匀，加热至60 ，滴加，滴加1N NaOH至溶液清澈，补至溶液清澈，补PBS至至1000ml,4 保存。保存。-应用：光镜免疫组化应用：光镜免疫组化-时间：温和，可长期保存组织时间：温和，可长期保存组织8181常用固定剂4%多聚甲醛缓冲液81常用固定剂n n戊二醛戊二醛-多聚甲醛缓冲液多聚甲醛缓冲液-在上液中加入在上液中加入0.25%1%戊二醛戊二醛-应用：光、电镜免疫组织化学研究应用：光、电镜免疫组织化学研究8282常用固定剂戊二醛-多聚甲醛缓冲液82常用固定剂n n丙酮及醇类固定剂丙酮及醇类固定剂-原理：使组织中的蛋白质和糖沉淀原理：使组织中的蛋白质和糖沉淀-特点：穿透性好，但小分子蛋白及多肽保存特点：穿透性好，但小分子蛋白及多肽保存差差8383常用固定剂丙酮及醇类固定剂83包埋n n石蜡包埋：优点：组织结构好，抗原定位好注意：-尽量在低温环境进行-组织块尽量小-用低温蜡8484包埋石蜡包埋：84包埋n n冰冻包埋：冰冻包埋：优点：抗原性保存好，快优点：抗原性保存好，快注意：注意：*冰晶冰晶-用高渗（用高渗（2030%蔗糖缓冲液，蔗糖缓冲液，4 过夜）过夜）溶液渗泡后加包埋剂溶液渗泡后加包埋剂-速冻：液氮法速冻：液氮法/干冰丙酮法干冰丙酮法8585包埋冰冻包埋：85抗原修复n n抗原修复（抗原修复（antigen retrieval,AR)原因：甲醛固定造成抗原失活原因：甲醛固定造成抗原失活-由于甲醛所致由于甲醛所致蛋白质的交联，反应产物的水解过程受某蛋白质的交联，反应产物的水解过程受某些侧链的限制。些侧链的限制。解决方法：解决方法：可在高温及强碱的条件下恢复可在高温及强碱的条件下恢复8686抗原修复抗原修复（antigen retrieval,AR加热AR法要点：要点：-玻片需用粘片剂处理，玻片需用粘片剂处理，AR前切片置前切片置60 至至少少1h-加热保证切片完全浸于水溶液中（加大容器加热保证切片完全浸于水溶液中（加大容器或分两次处理）或分两次处理）-容器应洗净容器应洗净-AR处理前用蒸馏水洗切片，以防处理前用蒸馏水洗切片，以防AR液与其液与其他缓冲液反应他缓冲液反应8787加热AR法要点：87推荐加热AR法步骤：-切片脱蜡后，水洗，置AR液（常用：0.01mol/L枸橼酸缓冲液PH6.0)中-置微波炉中，加热5min，补加AR液，再加热5min，时间共计10-20min。-加热后切片置室温15min降温，蒸馏水洗，染色8888推荐加热AR法步骤：88免疫酶组织化学技术8989免疫酶组织化学技术89亲和免疫组织化学技术n nABC法9090亲和免疫组织化学技术ABC法90亲和免疫组织化学技术9191亲和免疫组织化学技术91免疫电镜技术 免疫电镜技术免疫电镜技术(Immune electron microscopy(Immune electron microscopy，IEM):IEM):n n抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法法n n特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结金等标记后，使