发光免疫分析技术的原理和特点课件

发光免疫分析技术的 原理和特点发光免疫分析技术的 原理和特点生物发光和化学发光生物发光和化学发光作为两个古老而又年轻的技术，近年来得到了很大的发展。尤其在生物医学领域得到了广泛应用，已成为现代生物技术的组成部分。发光免疫分析技术及荧光素酶报告基因的应用已形成了产业。近几年在某些关键技术如生物传感器、基因序列分析、活体细胞ATP测定等方面取得了突破，其应用的范围进一步扩大，涵盖了生物医学的各个领域。生物发光和化学发光生物发光和化学发光作为两个古老而又年轻的技生物发光所谓的生物发光，就是生物体内发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象。其特点为只消耗能量物质，不消耗发光物质萤火虫发光系统的量子效率，即产生光子数与消耗能量物质（ATP）分子数之比接近百分之百，这是至今为止发光效率的最高纪录。因为即使是目前最先进的节能灯，其发光效率仅为2030%左右。生物发光和化学发光均属于冷光范畴，即发光不是由于发光体温度升高所至，发射波长也与其温度无关。生物发光所谓的生物发光，就是生物体内发光蛋白通过消耗能量物质自从萤火虫发光系统被揭示以来，经过多年的努力，目前发现存在发光现象的生物细菌、真菌、昆虫、蠕虫、水母、乌贼、鱼类、虾类等共有700多个种类，涉及17个门，其中绝大多数生活在海洋、特别是深海，有报道说在海平面数百米以下的大部分物种多具有生物发光现象。这些发光生物大部分为自身表达发光蛋白，而某些鱼则利用共生菌发光。生物发光的波长几乎涵盖了所有的可见光区域。自从萤火虫发光系统被揭示以来，经过多年的努力，目前发现存在发发光对于动物的主要意义包括求偶、寻食、防御、进攻等。有人认为细菌发光可能也属于一种自身保护机制，目的在于消耗细胞内过多的氧化性物质。近年来，发现许多种发光强度、波长和闪了频率的变化尤其特定的含义，说明生物发光也许是生物个体间相互交换信息的一种手段。近年来，随着越来越多的发光蛋白被提纯，其编码基因序列被测定、表达。其发光底物被人工合成相关的基础研究和产品的商业化进程迅速，已经发现的发光蛋白及其结构、活性部位、催化机理已被人们所认识。发光对于动物的主要意义包括求偶、寻食、防御、进攻等。有人认为化学发光化学发光是由于化学反应，通常是氧化反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子，从而导致的发光现象，其特点为消耗发光剂，同时量子效率相对较低。化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。其中酶促化学分光包括辣根氧化物酶系统、碱性磷酸酶系统、黄嘌呤氧化酶系统等。其中，在碱性磷酸酶反应体系中，螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯及其衍生物可作为发光剂，又可作为氧化剂，即它可通过自身内氧化,启动发光反应而无需氧化剂。而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁鲁米诺系统等。化学发光化学发光是由于化学反应，通常是氧化反应产生电子能级处如果按发光持续时间分类，可分为闪光和辉光。闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测两个过程同步进行，同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如辣根过氧化物酶鲁米诺系统、碱性磷酸酶AMPPD系统、黄嘌呤氧化酶鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任一点测量单位时间的发光强度。如果按发光持续时间分类，可分为闪光和辉光。事实上，许多物质既是生物发光底物，同时又是化学发光底物，甚至是化学发光增强剂，因此生物发光和化学发光在分子和量子机理方面存在许多相似性。近年来在常见的化学发光底物特别是螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯类和吖啶酯类的发光机理研究中发现，大多数化学发光底物及其中间产物中均存在1，2-二氧四环结构，而且该结构的存在似乎对于生物发光底物也具有非常重要的意义。同时对于其化学发光过程中的量子机制，也提出了所谓的“化学起始的电子交换发光”学说。基于上述理论，人类模拟自然界生物发光底物的某些结构，已经合成了多个高效化学发光底物，其发光波长几乎覆盖了所有的可见光区域，量子效率也达到了空前水平，可以说，生物发光是人类推动化学发光技术进步的智慧源泉。事实上，许多物质既是生物发光底物，同时又是化学发光底物，甚至发光信号的检测 以往的光信号检测仪器大多采用光敏二极管、光敏电池、电荷耦合器，或者以光电流放大方式工作的常规光电倍增管作为检测器件。其原理为：通过光电转换器件激昂光信号转换为电压或电流信号，再加以放大。其主要特点为：结构简单、性能稳定、但灵敏度低、线性范围较窄。随着现代量子物理学的发展，以及人们对光的微观特性认识的逐步深入，一种被称为单光子计数器的新型高敏感度光电检测器在近期问世，其灵敏度及线性范围均大大超过其它常规技术。发光信号的检测 以往的光信号检测仪器大多采用光敏二极管、单光子计数器核心部件是一个光电倍增管他是一个超高度真空的玻璃容器，称为光阴极。而在内部还装有多个以特殊方式排列的电极，称为打拿极或加速极，其后部另有一个电极称为阳极，上述各个电极之间均有直流高压。当光子打到光阴极时，由于光电效应，其表面可以产生能量微弱的游离电子，称为光电子。该电子由于直流高压的作用离开光阴极再次打到第一打拿极上，由于其获得了直流高压提供的能量，因而在第一打拿级上又制造出了能量更大、能量更多的电子，就这样经过多个打拿极的反复放大单光子计数器核心部件是一个光电倍增管他是一个超高度真空的玻璃 最后使阳极产生了一个能量远远高于最初光子的电脉冲信号。该信号经前置放大器放大，在经过比较器去除噪声信号，最后由分频器换算出光子脉冲数。通常以相对发光单位即RLU为单位，一个RLU相当于10个光子。由于单光子计数器具有的卓越性能，它已成为现代光学仪器中最重要的部分之一，也是今后临床检验仪器发展的方向之一。事实上，正是由于它的发明及应用，使现代免疫及基因分析技术才能从放射性同位素的束缚中解放出来，真正步入安全化、非同位素化的新时代。最后使阳极产生了一个能量远远高于最初光子的电脉冲信号上述装置之所以称为单光子计数器，是因为仅用于单光子事件的测量，即待测物的辐射跃迁仅存在一种可能性，换句话说，其检测的光子能极是一样的。通常化学发光、生物发光、荧光等均属于单光子事件因此一般都用单光子计数器测量，而以往在放射性免疫分析中常用的液体或固体闪烁计数仪均使用多光子计数仪，其原因为放射性同位素导致的液体或固体闪烁为多光子事件，即辐射跃迁存在多种可能性。换句话说，其光子的能级是多样的，而且不同的同位素具有各自不同的多个能级和跃迁方式，因此其测量方式为多能级符合方式。所以在闪烁测定时，不同类型的放射性同位素要选择与之相应的通道。上述装置之所以称为单光子计数器，是因为仅用于单光子事件的测量上述装置之所以称之为单光子计数器，是因为它仅用于单光子事件的测量，即待测物的辐射跃迁仅存在一种可能性；换句话说，其检测的光子能级是一样的。通常化学发光、生物发光、荧光等均属单光子事件，因此一般都用单光子计数器测量。而以往在放射性免疫分析中常用的液体或固体闪烁计数仪均使用多光子计数器，其原因为放射性同位素导致的液体或固体闪烁为多光子事件，及辐射跃迁存在多种可能性。换句话说，其光子的能级是多样的，而且不同的同位素具有各自不同的多个能级和跃迁方式，因此其测量方式为多能级符合方式，所以在闪烁测定时，不同类型的放射性同位素要选择与之相应的通道。上述装置之所以称之为单光子计数器，是因为它仅用于单光子事件的值得一提的是，对于一般的酶促化学发光，如以过氧化物酶和碱性磷酸酶为催化剂的发光，由于其发光时间较长，又有较持久的坪区（发光信号稳定期），因此一般采取速率法测定，即在坪区任意时间点测定发光信号强度。而以吖啶酯和鲁米诺及其衍生物直接标记为代表的非酶促化学发光，由于其发光时间极短，且无稳定的坪区，因此一般采取时间积分的方式，即描记整个发光周期内的完整信号峰；此时一定要在发光分析系统中加入一套原位进样泵，并与检测器协同配合，以保证发光信号峰的完整描记，但其加工精度和控制技术要求很高值得一提的是，对于一般的酶促化学发光，如以过氧化物酶和碱性磷发光检测技术的特点与优势光生物学检测技术之所以在短短的十几年内的到了迅速的发展，原因在于其很多的显著优越性。例如：彻底消除了放射性等有害物对操作者和环境的危害；无半衰期限制；使试剂的稳定性和有效期大大延长；信号自行去除，容易实现连续动态重复测定；适合利用复合标记系统进行多指标并行测定；操作简便，反应速度快，容易实现自动化，灵敏度和线性范围超过以往技术等等。发光检测技术的特点与优势光生物学检测技术之所以在短短的十几年非放射性以往在生物分析的定量检测中使用最普遍的当属放射性同位素标记及检测技术，它存在诸多的不足包括：某些放射性同位素由于半衰期短不利于储存和运输；同时由于放射性物质的污染对工作人员的健康及环境造成一定危害需要特殊的防护及废物处理设备。因此人们一直在寻找非同位素标记的检测方法。光生物学技术由于其完全抛弃了放射性同位素，因此不仅消除了对环境和操作者的危害，而且也使试剂的非放射性以往在生物分析的定量检测中使用最普遍的当属放射性同位稳定性和有效期大大延长。同时由于发光信号可以在短时间内自行消失，因此非常容易实现连续、动态、重复测定，这一点特别适合于生物医学研究、法医鉴定等领域中的多标记、多指标并行测定；如果加上波长、延迟时间以及反应底物的差别，其分辨率更高。另外，由于其操作更加简单，反应速度更快，因此容易实现自动化事实上，正是由于光生物学技术的出现，才使得免疫分析真正做上自动化的道路。稳定性和有效期大大延长。同时由于发光信号可以在短时间内自行消高灵敏度通常酶联免疫技术的分析灵敏度可达到10mol/L,新型的微珠包被酶放大免疫技术的分析灵敏度可达到10mol/L；荧光免疫及采用沉降法的普通放免技术可达到10mol/L；固相放免技术可达到10mol/L。而发光免疫分析技术的分析灵敏度已经达到10mol/L。高灵敏度通常酶联免疫技术的分析灵敏度可达到10mol/L,新发光免疫分析技术的原理和特点课件如果以每次实验的加样量为50ul，按摩尔常数为6.0210 计算，此时样品中仅有几十个待测物分子。这个灵敏度已经接近了免疫检测技术的理论极限。在现有的实验模式下，试图检测更少的待测物分子是不现实的。因为更高的灵敏度，必须要求加入反应的样品中存在数量非常恒定的待测物分子，以保证其检测结果的稳定性；但由于分子运动的存在，这显然是一个很不确定的随机事件。因此即使存在这样的方法，其检测结果的可靠性也是根本无法接受的。所以除目前尚未应用于临床诊断的单分子检测技术以外，任何宣传采用常规加样方式的免疫分析技术能够在分析灵敏度上超越这一极限的论调，显然是荒谬的；因为溶液中分子的随机运动会毫不留情的扼杀这样的图谋。如果以每次实验的加样量为50ul，按摩尔常数为6.0210事实上，上述灵敏度只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用中，由于受抗体亲和力的限制以及干扰免疫反应的因素影响，免疫检测试剂的分析灵敏度往往无法达到上述指标。特别是对发光免疫分析技术来讲，提高其检测灵敏度的瓶颈在于抗体亲和力和干扰免疫反应的因素，而不是检测技术本身。目前，发光免疫分析技术不仅已经能够完全满足临床检验对于灵敏度的要求，而且正是由于发光免疫技术的出现，使得许多临床检验项目的检测灵敏度和线性范围大大提高，从而极大的拓宽了其临床应用价值和范围，甚至做出了具有划时代意义的贡献。事实上，上述灵敏度只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用宽线性范围所谓线性范围是指能够较为准确的检测的待测物浓度范围。在免疫分析中，有人用相关系数不低于0.99的参比品浓度范围表示；但该方法受拟合方式的影响且实际测定和计算过程比较麻烦。目前很多人建议用功能灵敏度作为其下限，而以测定变异不超过20%的最高待测物浓度为上限，这样的定义比较符合临床的实际需求。宽线性范围所谓线性范围是指能够较为准确的检测的待测物浓度范围通常，酶联免疫技术，包括新型的微珠包被酶放大免疫技术，由于受比色测量的线性关系只在稀溶液中成立的限制，加上反应杯及浑浊样品的散射吸收作用其线性范围不超过两个数量级，即1-10所谓散射吸收作用是浑浊样品中的微粒对光信号的多次随机反射和吸收。放免技术的线性范围可达到四个数量级，即1-10；其瓶颈为检测器性能和放化灭活作用。所谓放化灭活作用，是指在放射性标记过强时，射线能量作用与抗原、抗体分子，通过影响其结构稳定性使其生物活性下降的现象。因此，放化灭活现象的存在往往限制了放免技术灵敏度和线性范围的提高。通常，酶联免疫技术，包括新型的微珠包被酶放大免疫技术，由于受荧光免疫的线性范围可达到四个数量级即大于110；其瓶颈为浓度淬灭和荧光漂白作用。所谓浓度淬灭是指在高浓度荧光素条件下，由于靠近光源的荧光素大量吸收激发光能量，使得远离光源的荧光素可吸收的能量减少，从而造成荧光效率下降。而荧光漂白是在过强激发光作用下，由于荧光素结构的变化，使其暂时或永久失去发射荧光能力的现象。所以，上述两种现象的存在均造成了对荧光技术灵敏度和现行范围的限制而发光免疫分析技术，其线性范围已经达到了六个数量级，其瓶颈为检测器性能。因此，如果采用最新的双量程自动转换单光子计数器，其线性范围还可以达到八个数量级。荧光免疫的线性范围可达到四个数量级即大于110；其瓶颈为浓发光免疫分析技术的原理和特点课件事实上，上述线性范围只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用中，由于受抗体亲和力的限制以及干扰免疫反应的因素影响，免疫检测试剂的线性范围往往无法达到上述指标。例如：发光和荧光技术均会受到无辐射跃迁和散射吸收作用的影响。所谓无辐射跃迁是指处于激发状态的荧光或发光底物以不发射光子的方式回到基态的现象；其原因是能量通过产热被释放，或者将能量传递给了其他分子。上述两种现象在高浓度杂质存在时尤其明显，尤其在使用微粒包被时，散射吸收就会变得十分显著。特别是由于前滞效应的存在，某些采用一步发的免疫检测试剂线性范围更窄。通常抗体亲和力越强其检测灵敏度越高，但由于其结合反应更容易达到饱和，因此线性范围也就越窄事实上，上述线性范围只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应长有效期发光技术完全抛弃了放射性同位素，因此彻底摆脱了半衰期的限制，使试剂的稳定性和有效期大大延长。同时由于在发光液、抗体及标记物储存放免采取了玻璃化及抗氧化稳定剂等相关配套技术使试剂盒的有效期和稳定性远远超过以往的任何产品，达到了空前水平，有些产品的实际有效期甚至可达到常温保存18月。长有效期发光技术完全抛弃了放射性同位素，因此彻底摆脱了半衰期发光免疫分析技术的原理和特点课件低运行成本光生物学技术完全抛弃了放射性同位素，因此不仅省去了放射性实验室的基础建设投资和操作者的日常保健费用而且也降低了相关的储存、运输、防护及废物处理的成本。而按照国际通行标准上述费用相当于试剂盒本身价格的数倍所以采用发光免疫分析技术，可是整体运行成本大大降低适合于中小医院及基层边远地区应用。低运行成本光生物学技术完全抛弃了放射性同位素，因此不仅省去了发光免疫分析技术的原理和特点课件常见的商品化发光免疫技术及其分析比较目前在应用上已经实现商品化的发光免疫分析产品，基本上可分为：化学发光时间分辨荧光也称时间延迟光致发光电化学发光-也称场致发光常见的商品化发光免疫技术及其分析比较目前在应用上已经实现商一、化学发光化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两种类型酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶系统和碱性磷酸酶系统。分别以过氧化物酶、鲁米诺、氧化剂、增强剂以及螺旋金刚烷环氧化物和碱性磷酸酶未反应体系。其中在碱性磷酸酶反应体系中，螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯及其衍生物既可作为发光剂，又可作为氧化剂，一、化学发光化学发光按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促 即它可通过自身内氧化启动发光反应，而无需氧化剂。酶促发光的共同特点为：发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过量，因此发光信号强而稳定，且发光时间长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单，成本较低，以往认为酶作为大分子，在标记小分子抗原时可能会影响其分子运动，但近年来，由于各种新型长臂双功能基团用于标记，以及多种高效间接标记技术的发展，这些已经不是问题。而酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间飘漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。即它可通过自身内氧化启动发光反应，而无需氧化剂。非酶促化学发光系统主要以吖啶酯、过氧化氢为发光系统。其共同特点为：发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，及含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短，如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次测量，所以重复性较差。为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐较长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。非酶促化学发光系统主要以吖啶酯、过氧化氢为发光系统。其共同特二、时间分辨荧光时间分辨荧光免疫分析是将三价稀土离子铕、镝、钐等通过络合物标记到抗原或抗体分子上，并通过检测其荧光实现免疫分析。由于稀土离子荧光的激发光波长范围较宽，而发射光波长范围较窄，而且激发光和发射光之间的波长差距，即所谓Stokes位移较大，特别是荧光寿命大大长于常规荧光；因此采用了与常规荧光免疫不同的检测方式，即通过脉冲激光器间歇激发样品，同时检测器在其激发的间隙测定特定的荧光强度。这样不仅消除了杂散光的干扰，而且也大大减弱样品及反应杯中杂质所产生的背景荧光干扰。所以其检测灵敏度和现行范围大大高于常规荧光。二、时间分辨荧光时间分辨荧光免疫分析是将三价稀土离子铕、镝、由于稀土离子在水相中的荧光效率很低，因此需要将其包裹在一个非水相的环境中才能检测到理想的荧光强度。最常见的做法是：在检测前先用酸将稀土离子从标记抗原或抗体上解离出来，然后在用由一系列表面活性剂构成的微囊吸收并包裹稀土离子。这种方式称为解离增强时间分辨荧光免疫分析法，其中的酸和表面活性剂等被称为增强剂。由于至今为止，在所有的时间分辨荧光分析法中，这种方法的灵敏度是最高的，近年来得到了广泛应用，已经成为目前最常见的时间分辨分析技术。但由于该方法需要在常规免疫分析中的洗涤步骤后，还要进行荧光素的解离和增强操作，因此分析过程有些繁琐。由于稀土离子在水相中的荧光效率很低，因此需要将其包裹在一个非除上述方法外，还有一种固相时间分辨荧光法，它使用一种特殊的络合物将三价稀土离子标记到抗原或抗体上；同时该络合物还可以维持三价稀土离子周围的非水环境，因此也充当了增强剂的角色。该方法的特点是无需增强剂，故操作简单，但灵敏度地域上述的方法。除上述方法外，还有一种固相时间分辨荧光法，它使用一种特殊的络时间分辨荧光免疫分析最大的不足，是环境及样品中同类元素导致的本底干扰。作为稀土资源大国的中国，特别是北方地区尤为不容忽视。虽然可以通过实验用水和实验室环境的特殊净化杜绝一部分干扰，但会带来测试成本的增加。况且由于病人体内这类元素的积累而造成的临床标本污染根本无法消除。因此人们研究开发了另一种称为直接时间分辨荧光测量法的技术，也有人称之为后标记技术。他首先使用一种不含稀土元素的特殊络合物标记抗原或抗体，等常规免疫分析中的洗涤完成后，再加入稀土元素并进行测定；这样就基本掩蔽了同类元素导致的本底干扰。但其灵敏度低，目前不能与上述两种方法相抗衡。总之，时间分辨荧光技术的不足为测量方式复杂，仪器成本及维护费用高，环境及样品中同类元素可导致本底干扰等。时间分辨荧光免疫分析最大的不足，是环境及样品中同类元素导致的三、电化学发光电化学发光在原理上与上述化学发光有所不同，其差异在于氧化反应是通过电极上的电化学反应产生的，而不是由氧化剂或发光剂自身内氧化产生。其标记物为三联双吡啶钌及其衍生物，并以三丙胺为还原剂。为降低检测成本并保证测量结果的重复性，目前普遍采用流动池测量方式。因此在启动发光时，首先三、电化学发光电化学发光在原理上与上述化学发光有所不同，其差和TPA被泵入流动池，并在流动池的阳极表面发生氧化反应，形成【RU(bpy)33+和阳离子TPA，后者再形成自由基TPA,并将【RU(bpy)33+还原为激发态的【RU(bpy)32+，而激发态的【RU(bpy)32+通过能量跃迁发射出一个波长620nm的光子，并重新生成基态的【RU(bpy)32+。和TPA被泵入流动池，并在流动池的阳极表面发生氧化反应，形成电化学发光的特点是：发光过程中的标记物基本不被消耗，而反应体系中其它成分充分过量，一次发光信号强而稳定，且发光时间较长。其缺点为测量方式复杂，仪器成本及维护费用高；同时环境及样品中同类元素也存在较弱的本底干扰。另外，反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时同时繁琐较长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。电化学发光的特点是：发光过程中的标记物基本不被消耗，而反应体四、各种常见的光信号检测器以往的光信号检测仪器大多采用光敏二极管、光敏电池、电荷耦合器，或者以光电流放大方式工作的常规光电倍增管作为检测器件。其原理为：通过光电转换器件将光信号转换为电压或电流信号，再加以放大。其主要特点为：结构简单、性能稳定、但灵敏度低、线性范围窄。随着现代量子物理学的发展，以及人们对光的微观特性的逐步深入，一种被称为单光子计数器的新型高敏感度光电检检测器问世。其灵敏度及线性范围均大大超过其它的常规技术。四、各种常见的光信号检测器以往的光信号检测仪器大多采用光敏二目前较先进的发光检测器均使用单光子计数器，但在某些廉价的小型发光检测设备中，仍然使用CCD和光敏二极管阵列；其特点为体积小、测定速度快、甚至可以实现微孔板的成排测量；但灵敏度低、线性范围窄，因此基本无法满足高灵敏度免疫检测的要求。随着光电技术的发展，一种被称为电子轰炸电荷耦合器的高灵敏度半导体器件已经问世，其灵敏度虽然无法与单光子计数器相比，而且成本高，但在大量信号的平行批处理方面优势明显，因此目前被广泛应用的高档发光成像仪器中，如组织细胞的发光成像、生物芯片的阅读等。目前较先进的发光检测器均使用单光子计数器，但在某些廉价的小型另外一个值得注意的问题是：由于单光子计数灵敏度很高，使得它在检测较强信号时，往往达到甚至超出自己的工作范围，这可能会在一定程度上影响结果得准确性。换言之，单光子计数器有时显得灵敏度太高了。近年来，国际上有人提出了双量程自动转换单光子计数器的设计思想，即一个单光子光子计数器中同时存在两套检测电路，分别负责强心好喝弱信号的检测，二者在运行过程中可自动切换。这样，弱信号由高灵敏度检测器负责接收，从而充分保持了仪器的高灵敏度特性；同时，强信号由低灵敏度检测器负责接受，也就完全保证了仪器检测强信号时的可靠性。在这种情况下，不仅可以使检测灵敏度再提高半个数量级，即35倍，而且更可是线性范围达到110之多另外一个值得注意的问题是：由于单光子计数灵敏度很高，使得它在五、各种发光免疫 分析技术的性能比较通常，酶联免疫技术的分析灵敏度可达到10mol/L；新型的微珠包被放大免疫技术的分析灵敏度可达到10mol/L。其瓶颈是受比色测量的线性关系只在稀释液中成立的限制，以及反应杯透光率差差异和浑浊样品的散射吸收作用。普通放免技术的分析灵敏度可达10mol/L；固相放免技术可达到10mol/L。其瓶颈为检测器性能和放化灭活作用，所谓的放化灭活作用，是指在放射线标记过强时，射线能量作用五、各种发光免疫 分析技术的性能比较通常，酶联免疫技术的 于抗原、抗体分子通过影响其结构稳定性使其生物活性下降的现象。因此，放化灭活现象的存在往往限制了放免技术灵敏度和线性范围的提高。荧光免疫的分析灵敏度稍逊于放免，其瓶颈为浓度淬灭和荧光漂白作用。所谓的浓度淬灭是指在高浓度荧光素条件下，由于靠近光源的荧光素大量吸收激发光能量，使得远离光源的荧光素可吸收的能量减弱，从而造成荧光效率下降。而荧光漂白是在过强的激发光作用下，由于荧光素结构的变化，使其暂时或永久失去发射荧光能力的现象。所以，上述两种现象的存在军造成了对荧光技术灵敏度和线性范围的限制。于抗原、抗体分子通过影响其结构稳定性使其生物活性下降的现事实上，发光和荧光技术均会受到无辐射跃迁和散射吸收作用的影响。所谓无辐射跃迁是指处于激发态的荧光或发光底物以不发射光子的方式回到基态的现象；其原因是能量通过产热被释放，或者将能量传递给了其它物质。而散射吸收作用是浑浊样品中的微粒对光信号的多次随机反射和吸收。上述两种现象在使用磁性或非磁性微粒，或者存在高浓度杂质时尤其明显。事实上，发光和荧光技术均会受到无辐射跃迁和散射吸收作用的影响因此，灵敏度只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用中，由于受抗体亲和力的限制以及干扰免疫反应的因素影响，免疫检测试剂的分析灵敏度往往无法达到上述指标。特别是对发光免疫分析技术来讲，提高其检测灵敏度的瓶颈在于抗体亲和力和干扰免疫反应的因素，而不是检测技术本身。例如，电化学发光TSH分析技术的灵敏度为0.005mIU/L，而第四代化学发光免疫TSH分析试剂的分析灵敏度为0.001mIU/L。其原因在于抗体的亲和力，而不是检测技术灵敏度的差异。因此，灵敏度只是各个检测技术所能达到的极限。在实际应用中，由对于现有的新型发光免疫分析技术来讲，片面的宣扬这些技术的灵敏度和线性范围谁强谁弱，不仅毫无意义，而且也是荒 的。真正影响其技术的瓶颈，恰恰是那些被有意无意的掩盖的问题。如抗体亲和力和特异性、干扰物质的作用、前滞效应的存在，以及企业的生产工艺和管理水平，乃至对用户进行技术服务的意识和能力；这些也是目前所有免疫分析产品所面临的共同问题。事实上，综观科学发展的历程，几乎所有的新技术最终所遇到的最大障碍，往往还是那些以往技术尚未解决的难题。所以，人们常说新技术最怕遇到老问题，免疫分析也不例外。对于现有的新型发光免疫分析技术来讲，片面的宣扬这些技术的灵敏现有发光免疫分析产品的特点由于发光免疫分析操作简单，反应速度快，比较容易实现自动化，因此目前大多采用全自动工作方式；而部分适合基层使用的普及型仪器，以及用于特定化验项目的小型仪器也采用微孔板或其他形式的半自动方式。无论采用哪种方式，整个实验过程均在12小时内完成。为进一步提高反应速度并增加灵敏度还有很多机型采用磁性或非磁性微粒包被，以增加表面积。此时反应时间可缩短至20分钟左右。由于检测试剂的稳定性提高，加上采用自动化仪器更使实验误差降低，故目前普遍使用厂家内建标准曲线加校正的方法产生工作曲线，从而减轻了工作量并降低运行成本。在闪光型化学发光或电化学发光试剂的配套仪器中，普遍采用流动池测定方式。现有发光免疫分析产品的特点由于发光免疫分析操作简单，反应速度应用发光免疫分析产品 存在的问题由于发光免疫的检测模式与放免不同，因此其测定结果和临床正常值都会有所差异。特别是这些产品采用单抗，因此交叉反应与多采用多抗的放免相比大大降低，所以其样品测定值往往比放免要低。即使是选用同一原理的发光免疫产品，不同厂家的产品之间测定结果都会有差异；其原因是抗体的特异性差异和参比品的系统误差。目前可用于免疫分析试剂的标准品较少或价格较贵，导致室内质控和室间质评工作不完善；加上试剂的标准化程度没有实现；所以不同产应用发光免疫分析产品 存在的问题由于发光免疫的检品间测定结果的系统误差几乎处于失控状态。例如国家药品生物制品鉴定所曾选送数份质控血清，在北京6家知名医院分别检测甲状腺素及三碘甲状腺素，这些医院均使用先进的进口仪器设备和试剂，涵盖了酶促及非酶促化学发光、时间分辨荧光、电化学发光等各种实验模式，但检测结果确发现其最高值和最低测定值的差异超过三倍。品间测定结果的系统误差几乎处于失控状态。例如国家药品生物制品事实上，由于抗体的交叉反应千差万别，加上个体间代谢状况的不同，即使通过设定参比标准使上述系统误差趋于一致，也无法保证临床标本的测定结果完全一致。例如对于激素测定的试剂，其抗体均或多或少地与激素前体或代谢物之间存在交叉，而这种交叉反应的强度在不同厂家选用的抗体间存在差异；因此个体差异代谢水平的差异必然导致交叉反应物质的差异，从而干扰检测结果的一致性。其中最常见的交叉反应有：胰岛素、胰岛素原之间的交叉反应、C-肽、TSH、FSH、LH、HCG之间的交叉反应；帯体激素之间及其前体和代谢物的交叉反应；甲状腺激素之间的交叉反应等。事实上，由于抗体的交叉反应千差万别，加上个体间代谢状况的不同目前普遍使用厂家内建标准曲线加校正的方法产生工作曲线；这虽然减轻了工作量并降低了运行成本，但其科学性和准确性值得探讨。遗憾的是，许多厂家均将校正方法视为技术秘密而没有公开，因此无从考证其合理性。甚至有些厂家为了保证质控品的测定结果稳定，让质控品参与曲线校正；即用户只要输入该质控品的标定值，则工作曲线将会随着该标定值移动。其结果是：虽然质控品测定结果每次都非常“完美”，但实验误差却被无情的掩盖了。还有部分仪器只向用户提供化验结果，而不显示原始数据，因此用户无法监控实验数据是否正确。甚至当试剂几乎失活导致信号很弱时，用户也根本无法察觉。目前普遍使用厂家内建标准曲线加校正的方法产生工作曲线；这虽然某些因素对发光或荧光存在干扰，但尚未引起注意。如温度的波动会影响发光反应和荧光效率。金属离子也会严重干扰发光反应和荧光效率。这对于使用磁珠的试剂更为重要。因为目前普遍使用聚合物包裹的磁珠，而磁珠的微小瑕疵和不当操作所造成的金属物泄露将导致严重后果。同时标本中常用的防腐剂和抗凝剂也会干扰免疫反应。或者通过抑制酶活性及发光或荧光效率干扰结果的稳定性。还有一些卟啉等内源性物质、浑浊杂质、氧化剂、还原剂等均会干扰结果的准确性。而且，由于上述测定仪器的灵敏度极高，因此过强的光线、磁场、电网波动等均会造成检测信号的扰动。而环境及样品中的稀土元素对时间分辨荧光及电化学发光的干扰也是一个值得注意的因素。某些因素对发光或荧光存在干扰，但尚未引起注意。如温度的波动会目前我国很多地方还在使用普通的放免。而该技术采用沉降法获得免疫复合物；而固相放免、化学发光、时间分辨荧光、电化学发光等均采用固相包被和洗涤法获得免疫复合物。因此使用竞争法测定小分子物质时，如果标本中存在可结合该物质的大分子蛋白，则该蛋白对于上述两类方法造成的干扰是不同的，其误差产生的方向恰恰相反；即其中一个方法的测定结果偏低时，另一种方法的结果却偏高。由于这种情况在测定甲状腺激素、貸体积素以及各种药物时非常常见，而这种差异有往往会导致临床上相互矛盾的解释，因此有必要认真加以对待。目前我国很多地方还在使用普通的放免。而该技术采用沉降法获得免使用发光免疫分析产品 必须做好的几个工作首先，应当在厂家提供的数据基础上，尽可能自行建立正常参考值系统，以消除试验室和人群差异。应当明确各个试剂盒的特异性及交叉反映情况，如小分子激素之间，以及与自身前体或代谢物之间的交叉；胰岛素与C-肽、胰岛素原之间的交叉等。应当充分利用现有国际参考品校正结果，而这些参考品可以从国家药品生物制品检定所或临床检验中心得到，但这些参考品多数仅适合放免，其中的防腐剂虽然对免疫反应没有影响，但可能会干扰发光或荧光，因此必须慎重选择使用发光免疫分析产品 必须做好的几个工作首先，应当在厂家提建议对每个检测项目自行建立23个点质控，其标定值尽可能分别接近正常值上下限；每次实验时随样品一起检测，以监控试验结果的稳定性和准确性。同时注意质控的保存条件和稳定性，如果需要假如防腐剂但必须保证其不会干扰发光或荧光。尽可能避免干扰因素，如采样时选用一次性清洁样品管，并注意塑料中的抗氧化剂干扰，保存标本时尽量不使用酶抑制剂和防腐剂，由于待测物的降解及其与血清蛋白结合状态的改变。某些化验项目的检测结果往往受标本存放时间及其储存条件的影响，因此，应当尽可能要求临床部门及时采样、送检，实验室也应尽可能及时完成化验。的确需要存放时，也必须严格按照相关试剂盒说明书进行。另外，试验室应恒温、避免强光和强磁场，操作人员严格按照操作规程工作，并对设备及时维护和维修。建议对每个检测项目自行建立23个点质控，其标定值尽可能分别