特殊毒性及其试验与评价方法--课件

第八章 特殊毒性试验及其评价第一节第一节 致突变作用及其试验方法与评价致突变作用及其试验方法与评价第二节第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价生殖发育毒性作用及其试验与评价第三节第三节 致癌作用及其试验方法与评价致癌作用及其试验方法与评价1PPT课件第一节第一节 致突变作用及其试验与评价方法致突变作用及其试验与评价方法一、一、基本概念基本概念二、突变类型二、突变类型三、突变的发生与修复机制三、突变的发生与修复机制四、致突变试验与致突变作用评价四、致突变试验与致突变作用评价2PPT课件 1DNA与基因与基因DNA由脱氧核糖、磷酸及碱由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构苷酸，形成双螺旋结构。遗传学基础3PPT课件 基因（基因（gene）：）：DNA分子中最小的完整功分子中最小的完整功能单位，是生物遗传信息的携带者能单位，是生物遗传信息的携带者基因组（基因组（genome）：细胞或生物体的一套完）：细胞或生物体的一套完整单体的遗传物质整单体的遗传物质4PPT课件 2、染色质与染色体、染色质与染色体 在间期细胞的细胞核中，通在间期细胞的细胞核中，通过光镜可见一种能被碱性染料着过光镜可见一种能被碱性染料着色的物质，即染色质。色的物质，即染色质。它由它由DNA、组蛋白、非组蛋、组蛋白、非组蛋白及少量的白及少量的RNA组成，形似串珠组成，形似串珠状的复合体。状的复合体。5PPT课件在间期细胞核中，一般没有在间期细胞核中，一般没有染色体结构，只有在细胞分染色体结构，只有在细胞分裂时，染色质才螺旋化并折裂时，染色质才螺旋化并折叠成染色体，故染色质与染叠成染色体，故染色质与染色体是由相同物质组成的；色体是由相同物质组成的；染色体存在于细胞中，通常染色体存在于细胞中，通常只有在细胞分裂时经过特殊只有在细胞分裂时经过特殊染色才能清楚地看到。染色才能清楚地看到。6PPT课件2009-6-30 染色体与基因有着平行的关系染色体与基因有着平行的关系染色体与基因有着平行的关系染色体与基因有着平行的关系染色体可以在显微镜下看到。染色体可以在显微镜下看到。染色体成对存在，基因也成对存染色体成对存在，基因也成对存在。在。个体中成对的基因一个来自母本，个体中成对的基因一个来自母本，另一个来自父本。另一个来自父本。不同对基因形成配子时的分离与不同对基因形成配子时的分离与不同对染色体在减数分裂期的分离，不同对染色体在减数分裂期的分离，都是独立分配的。都是独立分配的。7PPT课件3、基因型与表型、基因型与表型 基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗基因型指控制生物性状的基因组成，它是生物体的遗传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。传组成。基因型是性状发育的内因，是表型形成的根据。表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表型指在发育过程中由基因所控制的生物性状的具体表现。表现。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。外界环境是基因型转变成具体表型的必要条件。8PPT课件细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。了所经历的过程。G0：DNA合成前期；合成前期；G1：DNA合成期；合成期；S：完成：完成DNA复制；复制；G2：为有丝分裂做准备；：为有丝分裂做准备；M：有丝分裂期：有丝分裂期 4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂、细胞周期、有丝分裂与减数分裂 9PPT课件 有丝分裂过程有丝分裂过程有丝分裂指细胞核分裂的过程，有丝分裂指细胞核分裂的过程，一个细胞由此生成两个子细胞，一个细胞由此生成两个子细胞，每个子细胞各具有与亲代细胞每个子细胞各具有与亲代细胞完全相同的染色体。完全相同的染色体。10PPT课件减数分裂过程11PPT课件12PPT课件生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过生物物种可以通过各种繁殖方式来保证世代间生命的延续，这个过程称为程称为遗传遗传。遗传的稳定是相对的。遗传的稳定是相对的。在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为在亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变变异。异。一、基本概念13PPT课件造成生物变异的原因有：造成生物变异的原因有：亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；亲代个体杂交产生子体，由于重组而发生；由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；由于基因突变而发生，它是新基因产生的根本来源；由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。由于生物的染色体组成或细胞质发生变化而产生。14PPT课件自发突变自发突变(spontaneous mutation)是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变。特点：自发突变的发生过程长，频率极低特点：自发突变的发生过程长，频率极低,与物种的进化有关。与物种的进化有关。诱发突变诱发突变(induced mutation)是指人为的造成突变是指人为的造成突变。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选。它已被农、林、牧、渔业和园艺学家利用来培育和选择新种或良种。择新种或良种。特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。特点：发生过程短，频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害。遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生遗传物质发生变化引起遗传信息的改变，并发生新的表型效应称为突变。新的表型效应称为突变。15PPT课件突变的分类突变的分类基因突变基因突变(gene mutation)：一个或几个一个或几个DNA 碱基对的改变。用光学碱基对的改变。用光学显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。显微镜观察不到，必须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。染色体畸变染色体畸变(chromosome aberration)：染色体的结构及数目改变，可染色体的结构及数目改变，可用光学显微镜进行观察。用光学显微镜进行观察。染色体结构改变染色体结构改变染色体数目改变染色体数目改变16PPT课件二、突变类型遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤：遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤：基因突变基因突变 染色体畸变染色体畸变17PPT课件基因突变基因突变一个或几个一个或几个DNADNA碱基对的改变。碱基对的改变。染色体畸变染色体畸变染色体的结构及数目改变。染色体的结构及数目改变。端粒端粒姊姊妹妹染染色色单单体体着丝粒着丝粒组组 蛋蛋 白白双双 螺螺 旋旋碱基对碱基对端粒端粒18PPT课件这些损伤多因这些损伤多因DNA受损所致，也可能因受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损所以外的靶组织受损所致。致。基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本质是相同的，其区别在于受损程度。别在于受损程度。19PPT课件通常以光学显微镜的分辨率通常以光学显微镜的分辨率0.2 m来区分基因突变和染来区分基因突变和染色体畸变。色体畸变。基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发基因突变是用光学显微镜观察不到的，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可育、生化、形态等表型改变来判断，而染色体畸变可用光学显微镜进行观察。用光学显微镜进行观察。20PPT课件1.基因突变基因突变指基因中基因突变指基因中DNA序列的变化。序列的变化。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。因基因突变限制在一特定的部位，故称为点突变。21PPT课件碱基置换碱基置换 指指DNA序列上的某个碱基被其他碱基取代。首序列上的某个碱基被其他碱基取代。首先在先在DNA复制时会使互补链的相应位点配上一个复制时会使互补链的相应位点配上一个错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的错误的碱基，即发生错误配对。这一错误配上的碱基在下一次碱基在下一次DNA复制时却能按正常规律配对，复制时却能按正常规律配对，于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即于是一对错误的碱基置换了原来的碱基对，亦即最终产生碱基对置换或简称碱基置换。最终产生碱基对置换或简称碱基置换。22PPT课件23PPT课件移码突变移码突变 移码是移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。的倍数的碱基对所造成的突变。24PPT课件整码突变整码突变 指指在在DNA中中增增加加或或减减少少的的碱碱基基对对为为一一个或几个密码子。个或几个密码子。片断突变片断突变 指基因中某些小片断核苷酸序列发生指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。排。25PPT课件2.染色体畸变指染色体的指染色体的结构异常和数目异常结构异常和数目异常，它是，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。体来发现。26PPT课件（1）染色体结构异常）染色体结构异常 有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些有些畸变是稳定的，可通过重复细胞分裂传给子代。这些畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，畸变如缺失、倒位、重复及平衡易位等，多数为染色体重排，可在机体或细胞群传递。可在机体或细胞群传递。27PPT课件容易观察到的畸变有容易观察到的畸变有染色单体断裂、染染色单体断裂、染色体断裂、无中心粒片段、染色单体交色体断裂、无中心粒片段、染色单体交换、双中心粒染色体、环状染色体及某换、双中心粒染色体、环状染色体及某些相互易位些相互易位。28PPT课件染色体畸变染色体畸变裂裂隙隙(gap)断断裂裂(break)断断片片(fragment)和和缺缺失失(deletion)微微小小体体(minute body)无无着着丝丝点点环环环环状状染染色色体体 双双着着丝丝点点染染色色体体 倒倒位位(inversion)易易位位(translocation)插插入入(insertion)和和重重复复(duplication)辐辐射射体体 29PPT课件染色体结构变异类型染色体结构变异类型染色体染色体缺失缺失,如果蝇的缺刻翅如果蝇的缺刻翅染色体染色体重复重复,如果蝇的棒状眼如果蝇的棒状眼染色体染色体倒位倒位染色体染色体易位易位,如夜来香的变异如夜来香的变异 30PPT课件在在染染色色体体上上出出现现无无染染色色质质的的区区域域，但但该该区区域域两两端端的的染色体仍保持线状连接者为裂隙。染色体仍保持线状连接者为裂隙。指指染染色色体体上上狭狭窄窄的的非非染染色色带带，无无线线状状连连接接者者为为断断裂裂。带带宽宽超超过过染色单体宽度。染色单体宽度。裂隙裂隙（gap）和）和断裂断裂（break）31PPT课件一一个个染染色色体体发发生生一一次次或或多多次次断断裂裂而而不不重重接接，并并且且这这些些已已断断裂裂的的节节段段远远远远分分开开，常常将将无无着着丝丝粒粒断断片片简简称称为为断断片片。有有着着丝丝粒粒的的部部分分称称为为缺缺失失，缺缺失失有有末末端端缺缺失和中间缺失。失和中间缺失。无着丝粒断片无着丝粒断片（fragment）、）、缺失缺失（deletion）32PPT课件染染色色体体两两臂臂各各发发生生一一次次断断裂裂，其其带带有有着着丝丝粒粒的的节节段段的的两两断断端端连连接接形形成成一一个个环环时时，称称为为环环状染色体。状染色体。环状染色体环状染色体（ring chromosome）33PPT课件当当某某一一染染色色体体发发生生两两次次断断裂裂后后，其其中中间间节节段段倒倒转转180 再再重重接接，称称为为 倒位。倒位。倒位倒位（inversion）34PPT课件当当一一个个染染色色体体发发生生三三处处断断裂裂，带带有有两两断断端端的的断断片片插插入入到到另另一一臂臂的的断断裂裂处处或或另另一一染染色色体体的的断断裂裂处处重重接接起起来来，称称为为插插入入。如如果果此此时时有有缺缺失失的的染染色色体体和和插插入入的的染染色色体体是是同同源源染染色色体体，且且分分别别有有一一处处断断裂裂发发生生于于同同一一位位点点，则则插插入入将将使使该该染染色色体体连连续续出出现现两两段段完完全全相同的节段，此时称为重复。相同的节段，此时称为重复。插入插入（insertion）和）和重复重复（duplication）35PPT课件两两个个非非同同源源染染色色体体断断裂裂后后，从从某某个个染染色色体体断断下下的的节段接到另一染色体上称为易位。节段接到另一染色体上称为易位。易位易位（translocation）36PPT课件（2）染色体数目异常染色体数目异常 整倍性畸变：整倍性畸变：单、三、四、多倍体单、三、四、多倍体 非整倍性畸变：非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或倍体多一条或少一条或多多条或少多条少多条 2n-1,2n-2,2n+1,2n+2,37PPT课件类型类型公式公式染色体组染色体组整倍体整倍体单倍体单倍体n(ABCD)二倍体二倍体2n(ABCD)(ABCD)三倍体三倍体3n(ABCD)(ABCD)(ABCD)四倍体四倍体4n(ABCD)(ABCD)(ABCD)(ABCD)非整倍体非整倍体单体单体2n-1(ABCD)(ABC)三体三体 2n+1(ABCD)(ABCD)(A)四体四体2n+2(ABCD)(ABCD)(AA)双三体双三体2n+1+1(ABCD)(ABCD)(AB)缺体缺体2n-2(ABC)(ABC)染色体数目异常的基本类型染色体数目异常的基本类型注：A、B、C、D代表非同源染色体38PPT课件DNA修复修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复三、突变的发生与修复机制三、突变的发生与修复机制 外外源源化化学学物物引引起起基基因因突突变变和和染染色色体体突突变变的的靶靶部部位位主主要要是是DNA，而而导导致致染染色色体体数数目目异异常常的的靶靶部部位位主主要要是是有有丝丝分分裂裂和和减减数数分分裂裂器器，如纺锤丝。如纺锤丝。39PPT课件致突变作用致突变作用（mutagenesis）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞）：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。而传递。致突变物致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。因子，又称诱变剂。又称为遗传毒物。四、致突变试验与致突变作用评价40PPT课件观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的：观察化学毒物致突变作用一般通过致突变试验来进行。主要目的：检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性；检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性。的遗传危害性。41PPT课件观察项目的选择观察项目的选择基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学物的致突变性，是评价化学物致突变性唯一可靠方法。学物致突变性唯一可靠方法。但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变但是还有许多试验所观察到的现象并不直接反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察和染色体分离异常，仅反映致突变过程中发生的其他事件。将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点遗传学终点(genetic mdpoint)。42PPT课件正常正常DNADNA损伤损伤DNA修复过程修复过程未修复的未修复的DNA损伤表达损伤表达断裂的断裂的DNA分子分子染色体结染色体结构异常构异常基因基因突变突变细胞细胞死亡死亡 非整倍体非整倍体 多倍体多倍体重组事件重组事件 SCE 有丝分裂性交换有丝分裂性交换染色体分染色体分离异常离异常细胞屏障细胞屏障遗传毒物遗传毒物无误无误修复修复易错易错修复修复细胞分裂细胞分裂突变发生中的事件及遗传学终点的关系突变发生中的事件及遗传学终点的关系43PPT课件常用的致突变试验1、细菌回复突变试验（、细菌回复突变试验（Ames试验）试验）2、哺乳动物细胞基因突变试验、哺乳动物细胞基因突变试验3、果蝇伴性隐性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验4、染色体畸变分析、染色体畸变分析 5、微核试验、微核试验 6、姐妹染色单体交换试验、姐妹染色单体交换试验 7、显性致死试验、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验、小鼠可遗传易位试验9、细菌、细菌DNA修复试验修复试验10、程序外、程序外DNA合成实验合成实验11、精子畸形试验、精子畸形试验12、小鼠特异基因座试验、小鼠特异基因座试验44PPT课件45PPT课件致突变试验组合的原则致突变试验组合的原则一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。如细菌回复突变试如细菌回复突变试验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验验、微核试验、染色体畸变分析和姐妹染色单体交换试验，这一组试验包括主要类型遗传学终点。包括主要类型遗传学终点。体内试验与体外试验配合。体内试验与体外试验配合。一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应一般体内试验和体外试验各有其优缺点，应取长补短，综合考虑。取长补短，综合考虑。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。配套实验应包括多种进化程度不同的物种。如原核细胞、低等和高等真如原核细胞、低等和高等真核细胞，这样更加具有说服力。核细胞，这样更加具有说服力。46PPT课件以以营营养养缺缺陷陷的的突突变变体体菌菌株株为为试试验验系系统统，观观察察受受试物引起其回复突变的作用。试物引起其回复突变的作用。试验菌株：试验菌株：鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌Ames试验试验 大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌回复试验大肠杆菌回复试验 1、细菌回复突变试验、细菌回复突变试验47PPT课件Ames试验原理：试验原理：检检测测受受试试物物诱诱发发鼠鼠伤伤寒寒沙沙门门氏氏菌菌组组氨氨酸酸营营养养缺缺陷陷型型突突变变株株(his-)回回复复突突变变成成野野生生型型(his+)的的能力。能力。试试验验菌菌株株都都有有组组氨氨酸酸突突变变(his-)，不不能能自自行行合合成成组组氨氨酸酸，在在不不含含组组氨氨酸酸的的最最低低营营养养琼琼脂脂平平板上不能生长。板上不能生长。48PPT课件鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺陷型组氨酸营养缺陷型突变株突变株(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物49PPT课件有点试验和掺入试验两种。应分别进行不加及加代谢活化系统的试验，常用为S9混合液，即用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆经9000g离心得到的上清液，再加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子。50PPT课件Ames试试验验标标准准试试验验菌菌株株有有四四种种：TA97和和TA98检检测测移移码码突突变变，TA100检检测测碱碱基基置置换换突突变变，TA102对对醛醛、过过氧氧化化物物和和DNA交交联联剂剂较较敏敏感。感。这这四四个个试试验验菌菌株株除除了了含含有有his-突突变变，还还有有一一些些附附加加突突变变，检检测测时时提提高试验敏感性。高试验敏感性。Ames试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。试验的方法有平板掺入法，点试法及预培养法等。51PPT课件 突突变变型型试试验验菌菌株株可可被被各各种种诱诱变变因因素素诱诱导导，回回复复突突变变成成野野生生型型(his+)，即即恢恢复复了了合合成成组组氨氨酸酸的的能能力力，可可在在此平板上生长成可见菌落。此平板上生长成可见菌落。如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照如果受试物处理组回变菌落数显著超过阴性对照组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙组；并有剂量反应关系，即可判定受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。门菌的致突变物。52PPT课件结果判断只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是只要一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。致突变物。仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致仅四种菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。突变物。不加不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。突变物。加加S9混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致混合液才得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。突变物。53PPT课件哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培哺乳动物细胞基因突变试验是利用啮齿类和人体外培养细胞的基因正向突变试验。养细胞的基因正向突变试验。常用细胞株常用细胞株 选用的基因座选用的基因座 小鼠淋巴瘤细胞（小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y）TK、HPRT 中国仓鼠卵巢组织细胞（中国仓鼠卵巢组织细胞（CHO）HPRT 中国仓鼠肺组织细胞（中国仓鼠肺组织细胞（V79）HPRT 人淋巴细胞人淋巴细胞 HPRT 2.哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验(mammalian cell gene mutation assay)54PPT课件TK：胸胸苷苷激激酶酶，催催化化胸胸腺腺嘧嘧啶啶脱脱氧氧核核苷苷ATP 胸苷酸。胸苷酸。存存在在嘧嘧啶啶类类似似物物5-溴溴脱脱氧氧尿尿苷苷时时，产产生生异常核苷酸使细胞死亡。异常核苷酸使细胞死亡。受受试试物物存存在在时时若若细细胞胞不不死死亡亡说说明明TK发发生突变。生突变。（1）TK基因座基因座55PPT课件次次黄黄嘌嘌呤呤、鸟鸟嘌嘌呤呤转转磷磷酸酸核核糖糖基基酶酶：催催化化次次黄黄嘌嘌呤呤鸟鸟嘌嘌呤呤磷磷酸酸核核糖糖焦焦磷磷酸酸 核核苷苷-5-单单磷磷酸酸（NMP），补补充充途途径径。如如存存在在碱碱基基类类似似物物，生生成成相相应应的的NMP，掺掺入入到到DNA中可致死。中可致死。加加入入受受试试物物后后能能存存活活的的细细胞胞表表示示发发生生基基因突变因突变HPRT-。（2）HPRT基因座基因座56PPT课件制制备备细细胞胞分分裂裂中中期期相相染染色色体体标标本本，在在光光镜镜下下可可直直接接观观察察染染色色体体的的数数目目和和形形态态的的改改变变。染染色色体体畸畸变变试试验验也也常常称称为为细细胞胞遗遗传传学学试试验验(cytogenetic assay)。染染色色体体畸畸变变试试验验可可为为体体外外试试验验，也也可可为为体体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。3.染色体畸变试验染色体畸变试验57PPT课件体体内内试试验验：多多观观察察骨骨髓髓细细胞胞，其其分分裂裂旺旺盛盛、易易于于获获得得和和制制备备，优优势势在在于于可可体体现现哺哺乳乳动动物物的的代代谢谢过过程程、DNA修修复复和和药药物物动动力力学学特特征征。但但应应注注意意受受试试物物或或其其活活性性代代谢谢产产物物有有可可能能不不易易在在骨骨髓髓中中达达到到足足够够的浓度。的浓度。58PPT课件体外试验体外试验：常用：常用中国仓鼠肺细胞中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵巢细胞以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和和V79等细胞等细胞系系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞。代或早代细胞。59PPT课件2009-6-30 上一内容上一内容回主目录回主目录返回返回下一内容下一内容返回返回 上一内容上一内容下一内容下一内容回主目录回主目录60PPT课件试验步骤染毒：健康成年染毒：健康成年ICR小鼠，实验前小鼠，实验前24小时予环磷酰胺小时予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。体重腹腔注射。收获细胞：处死动物前收获细胞：处死动物前24h，秋水仙碱，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸剪去两端骨垢，用注射器吸NS约约5 ml插入骨髓腔内，将骨髓冲插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500 r/min离心离心10min，弃上清液。弃上清液。低渗：打散沉淀物，加入预温低渗：打散沉淀物，加入预温37的的 0.075 mol/L KCl约约6ml，混匀，于，混匀，于37低渗低渗1520min，再加固定液，再加固定液 l2 ml混匀，立即混匀，立即以以1000r/min离心离心10min，弃上清液。，弃上清液。61PPT课件固定：重悬细胞，加入固定液固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温混匀，放置室温1020min，然后，然后1000r/min离心离心10min，去上清液。同样方法再固定一，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约次，弃上清液，留约0.5ml。制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片载波片1015Cm高处滴片，干燥，用高处滴片，干燥，用10Giemesa染色液染色染色液染色1020min，轻微冲洗，自然晾干。，轻微冲洗，自然晾干。阅片计数。阅片计数。62PPT课件染色体数目改变包括：染色体数目改变包括：整倍体变异：原先整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如的染色体变为多倍体如3n或或4n等。等。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。染色体结构改变包括：裂隙染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂、断裂(B)、碎片、碎片(F)、环、环形形(r)、交换、交换(E)以及复合性断裂等。以及复合性断裂等。小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为体数为40条，大鼠的染色体数为条，大鼠的染色体数为42条。条。读片时每张标本片至少要分析读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。个中期分裂细胞。63PPT课件64PPT课件染染色色体体的的断断片片或或迟迟滞滞的的染染色色体体在在细细胞胞分分裂裂后后期期，由由于于不不能能进进入入子子细细胞胞的的核核中中而而在在间间期期的的子子细细胞胞胞胞浆浆内内形形成成的的游游离离团团块块物物质质，它它与与细细胞胞主主核核着着色色一一致致，圆圆形形或或椭椭圆形。圆形。4、微核（、微核（micronucleus）试验）试验65PPT课件66PPT课件无核细胞无核细胞红细胞红细胞有核细胞中有核细胞中微核难与正常核分叶微核难与正常核分叶及核突出物区别及核突出物区别微微核核试试验验67PPT课件常常用用啮啮齿齿类类动动物物骨骨髓髓嗜嗜多多染染红红细细胞胞(PCE)或或外周血细胞外周血细胞进行微核试验。进行微核试验。PCE是是红红细细胞胞成成熟熟的的一一个个阶阶段段，此此时时红红细细胞胞的的主主核核已已排排出出，微微核核容容易易辩辩认认，PCE胞胞质质含含RNA染染色色与与成成熟熟红红细细胞胞易易于于区区别别，故故为骨髓微核试验的首选细胞群。为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后一般采用多次染毒后24 h采样。采样。68PPT课件红细胞的分化成熟过程69PPT课件70PPT课件71PPT课件MNNCEIllustration of a binuclear human lymphocyte containing a micronucleus(arrow).Nuclear material appears in yellow,cytoplasm in red.Acridin-Orange staining,fluorescence microscopy,enlargement 1000 fold 72PPT课件试验步骤试验步骤健康成年健康成年ICR小鼠，实验前小鼠，实验前24 h予环磷酰胺予环磷酰胺40 mg/kg腹腹腔注射染毒。腔注射染毒。小鼠颈椎脱臼处死，取小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨双侧后肢股骨，纱布擦去多余，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。髓团块混匀。以以 1000r/min速度离心速度离心 10 min，弃上清液，留下约，弃上清液，留下约0.5 ml沉淀物混匀后，滴片两张，推片。沉淀物混匀后，滴片两张，推片。将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。，取出晾干。将固定晾干后的骨髓片，用将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色应用液染色1015min，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。干。显微镜观察并计数微核率。显微镜观察并计数微核率。73PPT课件PCE呈灰蓝色，成熟呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，呈粉红色，NC呈蓝紫色。呈蓝紫色。PCE中含有的微核大小为细胞直径的中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数数1000个个PCE中含微核的中含微核的PCE数。数。微核率（微核率（）=含微核含微核PCEPCE细胞数细胞数PCEPCE细胞总数细胞总数100074PPT课件Giemsa染色染色PCE胞质内含有核糖体，染色呈灰蓝色；MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。NCE PCE&MCN75PPT课件结果分析与评价本试验中只计数本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE为评价细胞毒性的指标：为评价细胞毒性的指标：F正常正常PCE/NCE比值约为比值约为l（正常范围为（正常范围为0.61.2）；）；F如如PCE/NCE0.1，则表示，则表示PCE形成受到严重抑形成受到严重抑制；制；F如如PCE/NCE0.05，则表示受试化学毒物的剂，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。量过大，试验结果不可靠。76PPT课件77结果示小鼠骨髓嗜多染红细示小鼠骨髓嗜多染红细胞中一个微核（胞中一个微核（MN）示小鼠骨髓正常嗜多示小鼠骨髓正常嗜多染红细胞（染红细胞（NCE）77PPT课件78示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核（MN）78PPT课件79示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核（MN）79PPT课件 显显性性致致死死指指发发育育中中的的精精子子或或卵卵子子细细胞胞发发生生遗遗传传学学损损伤伤，导导致致受受精精卵卵或或发发育育中中的的胚胚胎胎死死亡亡。一一般般认认为为显显性性致致死死主主要要是是由由于于染染色色体体损损伤伤的的结结果果。显显性性致致死死试试验验以以胚胚胎胎死死亡亡为为观观察察终终点点，用用于于检检测测受受试试物物对对动动物物性性细细胞的染色体损伤作用。胞的染色体损伤作用。一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。以评价。5.显性致死试验显性致死试验(dominant lethal assay)80PPT课件6.程程序序外外DNA合合成成试试验验(unscheduled DNA synthesis test，UDS)当当DNA受受损损后后，DNA的的修修复复合合成成可可发发生生在在正正常常复复制制合合成成期期(S期期)以以外外的的其其他他时时期期，称称为为程程序序外外DNA合合成成。用用同同步步培培养养将将细细胞胞阻阻断断于于Gl期期，并并将将正正常常的的DNA半半保保留留复复制制阻阻断断，然然后后用用受受试试物物处处理理细细胞胞，并并在在加加有有3H-胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷的的培培养养液液中中进进行行培培养养。利利用用放放射射自自显显影影法法或或液液闪闪计计数数法法测测定定掺掺入入DNA的的放放射射活性，检测活性，检测DNA修复合成，从而间接反映修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。的损伤程度。81PPT课件 精精子子畸畸形形指指精精子子形形态态发发生生异异常常改改变变。可可导导致致生生育育能能力力的的改改变变。用用于于检检测测外外源源化化学学物物对对精精子子生生成成和和发发育育的的影影响响，也也可可用用于于评评价价化化学学物物对对生生殖殖细细胞的致突变作用。胞的致突变作用。常常用用68周周的的小小鼠鼠，连连续续5天天染染毒毒。在在染染毒毒后后不不同同时时间间（1、4、10周周）处处死死，取取样样检检查查精精子子形形态。态。7.小鼠精子畸形试验小鼠精子畸形试验82PPT课件 精子形态83PPT课件五、致突变试验中的一些问题1、阴性、阳性对照的设立、阴性、阳性对照的设立（1）阴性对照）阴性对照 即未处理对照或溶剂对照。即未处理对照或溶剂对照。（2）阳性对照）阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。2、体外试验的活化系统、体外试验的活化系统 许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物 3、致突变试验与致癌试验的关系、致突变试验与致癌试验的关系84PPT课件遗传毒性和致癌性分类：遗传毒性和致癌性分类：致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，致突变试验仅可检出遗传毒性致癌物和非遗传毒性非致癌物，有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌有可能出现假阳性如遗传毒性非致癌物和假阴性如非遗传毒性致癌物。物。85PPT课件我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序(2003)中对遗传毒理学试验中对遗传毒理学试验的要求是：的要求是：考虑原核细胞与真核细胞、体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则。考虑原核细胞与真核细胞、体外和体内试验以及体细胞和生殖细胞的原则。从从Ames试验或试验或V79/HGPRT基因突变试验基因突变试验、骨髓细胞微核试验或哺乳骨髓细胞微核试验或哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验、动物骨髓细胞染色体畸变试验、TK基因突变试验、小鼠精子畸形分析或基因突变试验、小鼠精子畸形分析或睾丸染色体畸变分析睾丸染色体畸变分析选一项。选一项。其他备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、非程序其他备选遗传毒性试验：显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验、非程序性性DNA合成试验。合成试验。86PPT课件1.如三项试验中，体内、体外各有一项或以上试验阳性，则表示该受试如三项试验中，体内、体外各有一项或以上试验阳性，则表示该受试物很可能具有遗传毒性和致癌作用，放弃。物很可能具有遗传毒性和致癌作用，放弃。2.如三项试验中一项体内试验阳性或两项体外试验阳性，则再选两项备如三项试验中一项体内试验阳性或两项体外试验阳性，则再选两项备选试验（至少一项体内试验）。如再选的试验均为阴性，则可继续将进选试验（至少一项体内试验）。如再选的试验均为阴性，则可继续将进行下一步的毒性试验；如其中有一项试验阳性，则结合其它试验结果，行下一步的毒性试验；如其中有一项试验阳性，则结合其它试验结果，经专家讨论决定，再做其它备选试验或进入下一步的毒性试验。经专家讨论决定，再做其它备选试验或进入下一步的毒性试验。3.如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。如三项试验均为阴性，则可继续进行下一步的毒性试验。87PPT课件