生物信息学与pcr课件

第九章第九章聚合酶链反应聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction.PCR）评价：评价：*PCR*PCR是现今生物生命学科最关注、最爱用、是现今生物生命学科最关注、最爱用、最欢迎的新技术。最欢迎的新技术。*被誉为：被誉为：2020世纪世纪8080年代出现的具有划时代年代出现的具有划时代 的、生命学科中革命性的新技术。的、生命学科中革命性的新技术。*PCR*PCR使生命学科发生变革，给生物医学的发使生命学科发生变革，给生物医学的发 展注入无限活力。展注入无限活力。*公认公认PCRPCR最具发展前景，最有生命力的一项最具发展前景，最有生命力的一项 新技术。新技术。*最短时间获诺贝尔奖（最短时间获诺贝尔奖（86-9386-93年）。年）。*多么高的评价都不过分。多么高的评价都不过分。一、问题提出一、问题提出 背景背景:分子生物学、遗传学的兴起，分子生物学、遗传学的兴起，反向生物学的诞生反向生物学的诞生 （核酸、遗传物质，基因型（核酸、遗传物质，基因型表型）。表型）。共同障碍：共同障碍：如何在短时间内如何在短时间内快速、获足够量、纯净的、快速、获足够量、纯净的、特异的目的特异的目的DNADNA片段片段/基因供使用，可检测。基因供使用，可检测。1 1基础理论研究的需要基础理论研究的需要 DNADNA重组、基因克隆、重组、基因克隆、HGPHGP测序，探针制备测序，探针制备 2 2实际应用的需要实际应用的需要 基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治 疗，基因预防等给人类带来希望。疗，基因预防等给人类带来希望。体内体内DNADNA的复制体系的复制体系DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶（I II IIII II IIII II IIII II III）拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶解旋酶类解旋酶类解旋酶类解旋酶类SSBSSBSSBSSB 引物引物引物引物dNTP MgdNTP MgdNTP MgdNTP Mg2+2+2+2+5 5 33Mullis的的PCR构思构思引物引物引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段二、二、PCRPCR的基本概念的基本概念概念概念 由一对引物介导，在体外对特定由一对引物介导，在体外对特定DNADNA片段进行片段进行 快速、酶促、扩增技术。快速、酶促、扩增技术。以拟扩增的以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与分子为模板，以一对分别与模板模板5 5末端和末端和3 3末端互补的寡核苷酸片段为引物，末端互补的寡核苷酸片段为引物，在在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过合成，重复这一过程，即可使目的程，即可使目的DNA片段得到扩增。片段得到扩增。PCR反应循环反应循环7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸前提：前提：人工合成一对特定引物作向导，人工合成一对特定引物作向导，始动始动DNADNA合成。合成。酶促：酶促：体外试管内进行酶促生化合成体外试管内进行酶促生化合成 （非化学合成）。（非化学合成）。靶子：靶子：特导扩增目的靶序列（目的）。特导扩增目的靶序列（目的）。高效：高效：极微量模板、百万倍扩增极微量模板、百万倍扩增快速：快速：短时高速完成实验。短时高速完成实验。内内 涵：涵：三、三、PCRPCR工作原理工作原理 PCRPCR的基本原理的基本原理变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制 PCRPCR过程：过程：3 3步曲步曲+1+1循环循环高温变性高温变性 90 909797 降温退火降温退火 45 455555 适温延伸适温延伸 72 72左右左右 反复循环反复循环 分四个阶段讲述其原理：分四个阶段讲述其原理：（一）高温模板变性（一）高温模板变性 制备好含有扩增靶序列制备好含有扩增靶序列/目的基因的样品目的基因的样品DNADNA （模板（模板DNADNA）。然后在高温下（）。然后在高温下（90-9590-95）使双）使双 键模板键模板DNADNA变性，解链，获得单链模板变性，解链，获得单链模板DNADNA，为，为DNADNA 合成作好准备。合成作好准备。（二）降温引物退火（二）降温引物退火 合成一对特导性引物，在合成一对特导性引物，在25-5525-55温度下，温度下，引物与模板配对结合。引物与模板配对结合。引物的作用有三：引物的作用有三：定位、定向、定大小定位、定向、定大小1 1定位：定位：一对引物分别位不同模板一对引物分别位不同模板 DNA DNA链上的靶序列的两端，链上的靶序列的两端，两条引物各自结合在不同两条引物各自结合在不同 的信息、非信息链上。的信息、非信息链上。引物是通过严格碱基互补发挥识别、引物是通过严格碱基互补发挥识别、结合和特异定位。结合和特异定位。2 2定向：定向：DNADNA链有方向性从链有方向性从55端到端到33端，引物端，引物 结合也有方向性。结合也有方向性。引物和模板引物和模板DNA 3DNA 3端结合，端结合，以引物为起点的新合成链，以引物为起点的新合成链，55端锁定。端锁定。遵循遵循DNADNA合成合成55端到端到33端的方向性，端的方向性，引物只能引物只能33端延伸，端延伸，两条引物两条引物33端均指向靶序列。端均指向靶序列。在在高高温温模模板板变变性性反反应应体体系系中中，加加入入过过量量（浓浓度度大大，引引物物数数量量多多）的的一一对对引引物物，在在较较低低温温下下（25 25-5050）大大量量的的引引物物分分别别与与各各自自相相对对应应的的单单链链模模板板DNADNA互互补补补补严严格格大大碱碱基基配配对对，由由于于引引物物量量大大，长长度度小小，其退火、结合的速度远高于模板单链其退火、结合的速度远高于模板单链DNADNA之间的结合。之间的结合。3 3定大小定大小 引物决定两条引物之间的靶序列长度，一对引引物决定两条引物之间的靶序列长度，一对引物一旦设计合成，其扩产物长短不再变化。物一旦设计合成，其扩产物长短不再变化。（三）适温引物延伸（三）适温引物延伸（适温新链合成）（适温新链合成）加入选定的加入选定的DNADNA聚合酶，在其适宜温度（聚合酶，在其适宜温度（Taq Taq 酶为酶为65-7265-72）进行）进行DNADNA酶促合成反应，反应体系中的酶促合成反应，反应体系中的4dNTP4dNTP（底物（底物A A、C C、G G、T T四种核酸），在引物四种核酸），在引物33端，端，在模板序列指导下，开始合成，即引物自在模板序列指导下，开始合成，即引物自5353端端延伸，合成一条与模板互补延伸，合成一条与模板互补 之新链。之新链。反反应应体体系系中中DNADNA产产量量增增加加一一倍倍，（原原模模板板+新新合合成成DNADNA，半半保保留留复复制制），若若以以此此产产物物DNADNA总总量量为为模模板板重重新新合合成成反反应应，新新反反应应体体系系中中模模板板量量实实际际将增加一倍。将增加一倍。（四）循环指数扩增（四）循环指数扩增 重复前三个步骤，重复前三个步骤，由于由于每次循环后产物可作为下一次反应模板，每次循环后产物可作为下一次反应模板，DNADNA总量和模板量均较上一次循环增加一倍，总量和模板量均较上一次循环增加一倍，反复多次累积呈指数增加，如一分子反复多次累积呈指数增加，如一分子DNADNA成单链成单链后两个模板，一次循环后变为后两个模板，一次循环后变为2 2分子分子DNADNA，变性后，变性后有有4 4个单链模板，个单链模板，3030次循环的次循环的 2 23030呈呈百万倍增加百万倍增加。PCRPCR原理原理模版模版目的扩增片段目的扩增片段5533PCRPCR原理原理高温模板变性高温模板变性目的扩增片段目的扩增片段3355PCRPCR原理原理2.2.降温引物退火降温引物退火上游引物：上游引物：下游引物：下游引物：5335PCRPCR原理原理3.3.适温引物延伸适温引物延伸PCRPCR原理原理4.4.循环指数扩增循环指数扩增)高温模板变性高温模板变性PCRPCR原理原理2)2)降温引物退火降温引物退火PCRPCR原理原理3)3)适温引物延伸适温引物延伸PCRPCR原理原理4)4)循环指数扩增循环指数扩增(1)(1)高温模板变性高温模板变性PCR原理(2)(2)降温引物退火降温引物退火PCRPCR原理原理(4)(4)循环指数扩增循环指数扩增(3)(3)适温引物延伸适温引物延伸 DNADNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n)，其中长片段以线性形式其中长片段以线性形式扩增扩增(2n+2)(2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。，最终主产物片段长度在两个引物之间。预变性预变性(92-95(92-95 C,2-5m)C,2-5m)变性变性(92-95(92-95 C,30s)C,30s)复性复性(40-60(40-60 C,30s)C,30s)延伸延伸(72(72 C,30-60s)C,30-60s)总延伸总延伸(72(72 C,7m)C,7m)(25-35)25-35)次次PCRPCR的一般过程：的一般过程：经过经过3030次的循环次的循环,扩增的扩增的DNADNA片段可达片段可达100100万倍以上。万倍以上。2402401625625611411452222282 20 00 0短片段（单链）短片段（单链）14121210108 864 42 2长片段（单链）长片段（单链）128128646432321616总片段（单链）总片段（单链）循环数循环数PCR循环循环第一步第一步加热变性加热变性靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533PCR PCR 循环循环-第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerasePCR PCR 循环循环-第三步第三步-引物延伸引物延伸靶序列 靶序列BiotinBiotin第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量 PCRPCR每次循环扩增一览表每次循环扩增一览表 (n0)(n0)循环循环 起始模板起始模板 5 5端锁定长链端锁定长链 短链靶序列短链靶序列 总拷贝数总拷贝数 0 20 2 0 0 0 0 2 2 1 1 2 2 2 2 0 0 4 4 2 2 2 2 4 4 2 8 2 8 3 3 2 2 6 6 8 8 16 16 4 4 2 2 8 8 22 22 32 32 20 20 2 2 40 40 10 105 5 2 220+120+1 n n 2 2 2n 2n 2 2n+1n+1-2n-2 2-2n-2 2n+1n+1 (恒定不变恒定不变)(线性增加线性增加)()(近似指数增加近似指数增加)()(指数增加指数增加)从表中可知，从表中可知，l 2020次次PCRPCR循循环环后后，反反应应产产物物DNADNA链链拷拷贝贝数数2 22020 起起始始模模板板可可略略去去不不计计，55端端长长链链数数4040个个，只只占总数占总数40/240/220203.510-5.3.510-5.比例相当小。比例相当小。l 当扩增当扩增3030次后，其占比例更小，产物中次后，其占比例更小，产物中 99.99%99.99%均为目的靶序列短链。均为目的靶序列短链。l可可能能合合成成少少量量小小于于靶靶序序列列的的短短小小片片段段。由由于于进进入入下下一一循循环环后后，引引物物结结合合不不止止，不不可可能能大大量扩增。量扩增。(二二)PCR)PCR操作流程操作流程加酶后参加酶后参数数时间时间温度温度变性变性30(30(1m1m）90-9590-95退火退火30-6030-6037-5537-55扩增扩增60-9060-9070-7570-75循环总次循环总次数数25-3025-30次次5 5、PCRPCR反应参数的设定（选择与优化）反应参数的设定（选择与优化）PCRPCR反应体系反应体系Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA多多聚聚酶酶PfuDNA多多聚聚酶酶引引物物和和或或和和*切记莫忘切记莫忘l 模板变性要充分，模板变性要充分，l 最好加酶前使模板充分变性最好加酶前使模板充分变性 变性成单链变性成单链*PCR*PCR 反应六要素反应六要素l引物引物l酶酶ldNTPl模板模板lMg2+l缓冲液缓冲液（四）结果检测（显示）（四）结果检测（显示）l一一般般采采用用琼琼脂脂矿矿凝凝胶胶电电泳泳-澳澳化化乙乙锭锭处处理理紫紫外灯下观察法、荧光显示（外灯下观察法、荧光显示（PCR-EBPCR-EB法）法）l注意设立严格对照：注意设立严格对照：DNA DNA分子量标准，分子量标准，阳性对照，阳性对照，阴性、空白对照阴性、空白对照l更精确的方法：更精确的方法：PCR-blot PCR-blot（转印后与已知探针、杂交）（转印后与已知探针、杂交）PCR-LP PCR-LP（产物标记后作探针、杂交）（产物标记后作探针、杂交）PCR-HPLC PCR-HPLC（分析吸收峰）（分析吸收峰）套式套式PCRPCR（另设计一对内引物、扩增更小片段）（另设计一对内引物、扩增更小片段）标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物五、五、PCRPCR两个最关键因素两个最关键因素引物、酶引物、酶（一）引物（一）引物l引物是引物是PCRPCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR PCR 产物的特异性取产物的特异性取决于引物与模板决于引物与模板DNADNA互补的程度。互补的程度。l理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNADNA序列，序列，就能按就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCRPCR就可将模就可将模板板DNADNA在体外大量扩增。在体外大量扩增。引物（引物（primerprimer）也称为寡核苷酸引物，常规的）也称为寡核苷酸引物，常规的PCRPCR反应需要反应需要两种引物，分别成为两种引物，分别成为55端引物和端引物和33端引物，或称为上游端引物，或称为上游/正向引物和下游正向引物和下游/反向引物。反向引物。通常通常DNADNA及及mRNAmRNA序列的写法为序列的写法为5353，所以，所以55端引物与目端引物与目的序列的的序列的55末端序列相同，而末端序列相同，而33端引物与目的序列的端引物与目的序列的33末端序列反向互补。末端序列反向互补。引物引物它们作为它们作为DNADNA扩增的起始部分，能限定待扩增扩增的起始部分，能限定待扩增DNADNA序列的长度。序列的长度。为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有至少有151518 18 bpbp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物*如何设计如何设计PCRPCR引物引物要素之一要素之一（A A）引物来源：）引物来源：（1)1)购买成套检测试剂盒，简单省力、购买成套检测试剂盒，简单省力、易出错、成本高易出错、成本高 （2)2)自己合成自己合成 1 1）查文献、查序列库（计算机）查文献、查序列库（计算机）直接查引物序列直接查引物序列合成；合成；查靶序列自己设计查靶序列自己设计 2 2）依）依PCRPCR目的，选定靶序列上的两侧翼序列如目的，选定靶序列上的两侧翼序列如 作检测，靶序列应保守、特异（种、属、作检测，靶序列应保守、特异（种、属、型特异）型特异）3 3）必必须须有有两两条条不不同同引引物物，扩扩增增两两条条不不同同链链，序序列列分分析析资资料料只只能能提提供供一一个个DNADNA链链顺顺序序。假假定定是信息链的资料。是信息链的资料。5 P2 33 P1 5l 信息链信息链5 35 3，已知该条信息链序列已知该条信息链序列/靶序列资料：靶序列资料：5-TATAAC5-TATAACATG ATG AAG AAG ACG ACG AGC AGC CAC/CAC/CAG CGG/CAG CGG/CAC CGA CTC CAT CAC CGA CTC CAT TAATAACGTACG-3CGTACG-3必须据此序列置设两个引物：必须据此序列置设两个引物：扩增信息链的引物扩增信息链的引物 扩增其互补链的引物扩增其互补链的引物 (知道知道DNADNA一条链序列，可依硷基互补一条链序列，可依硷基互补配对原则写出另一互补链序列配对原则写出另一互补链序列 ）（4 4）谁谁的的引引物物合合成成谁谁的的链链，但但必必须须以以对对方方链链为为模模板板，产产物物中中的的两两条条新新链链，一一条条是是信信息链，另一条为与互补的非信息链。息链，另一条为与互补的非信息链。（5 5）信息链引物的设计：）信息链引物的设计：按信息链顺序，在按信息链顺序，在55分端选定部位，按分端选定部位，按碱基排列顺序照抄碱基排列顺序照抄10-2010-20个碱基，即信息个碱基，即信息链引物。合成新的信息链。链引物。合成新的信息链。信息链引物：信息链引物：P1 P1 5ATGAAGACGAGCCAC5ATGAAGACGAGCCAC（5 35 3）见图）见图 （6 6）非信息链引物的设计）非信息链引物的设计 在在信信息息链链的的 33端端，选选10 10-2020碱碱基基，写写出出其其互互补补碱碱基基，即即为为非非信信息息链链引引物物，将将来来以以互互补补链链为为模模板板合合成成出出新新的的非非信信息息链链，考考虑虑到到方方向向性性。（5 5 33）l 非信息链引物：非信息链引物：P P2 2 5TTAATGGAGTCGGTG3 5TTAATGGAGTCGGTG3 即按即按5 35 3写出，（表面上与信息链顺序反向）写出，（表面上与信息链顺序反向）33 5P25P25TATAACATGAAGACGAGCCAC/5TATAACATGAAGACGAGCCAC/CACCGACTCCAGTTAACACCGACTCCAGTTAA333ATATTG3ATATTGTACTTCTGCTCGGTGTACTTCTGCTCGGTG/GTGGCTGAGGTAATT5GTGGCTGAGGTAATT5 P1 5 3 P1 5 3 P1 P1 5ATGAAGACGAGCCAC 3 5ATGAAGACGAGCCAC 3（5 35 3）P2 P2 5TTAATGGAGTCGGTG 3 5TTAATGGAGTCGGTG 3（5 35 3）（7 7）利用生物信息学）利用生物信息学 计算机网络分析计算机网络分析 DNAsis DNAsis 软件。软件。（配对情况及设计合理性）（配对情况及设计合理性）（8 8）合成与纯化）合成与纯化（B B）设计引物十大原则）设计引物十大原则l 引物的设计在引物的设计在PCRPCR中很重要。（三定作用）中很重要。（三定作用）l 总体考虑：总体考虑：特异性、高效扩增特异性、高效扩增和和自由度自由度广泛应用广泛应用 长度长度：15-35 15-35 碱基碱基(mer(mer，nt)nt)最好最好20-25 nt 20-25 nt。过短：特异性降低，结合不牢过短：特异性降低，结合不牢 过长：成本高，特异性反而降低过长：成本高，特异性反而降低 （不易结合）（不易结合）碱基组成：碱基组成：引引物物中中四四种种碱碱基基的的分分布布最最好好是是随随机机，G+CG+C含含量量50%50%或或与与目目的的片片段段相相当当。G+CG+C太太少少扩扩增增效效果果不不佳佳，G+CG+C过过多多易易出出现现非非特特异异条条带带。不不要要有有聚聚嘌嘌呤呤或或聚聚嘧嘧啶啶的的存存在在。尤尤其其33端端不不应应超超过过3 3个个连连续续的的G G或或C C，因因这这样样会会使引物在使引物在G+CG+C富集序列区错误引发。富集序列区错误引发。引引物物内内部部不不应应有有二二级级结结构构，避避开开产产物物的的二二级级结结构构区。影响配对。区。影响配对。引物之间特别是引物的两端之间不能有互补的序引物之间特别是引物的两端之间不能有互补的序列，减少引物形成列，减少引物形成“模板模板”，导致二聚体出现。一，导致二聚体出现。一对引物间对引物间不应多于不应多于4 4个连续碱基的同源性或互补性个连续碱基的同源性或互补性。引物引物33端端 必须确保严格与目的片段互补，不能必须确保严格与目的片段互补，不能进行任何修饰，不能发生错配。进行任何修饰，不能发生错配。特别是最末及倒特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致基不配对而导致PCRPCR失败失败 33端未位碱其少选端未位碱其少选A A。以以T.C.GT.C.G为好。减少错配，避免引物不能延伸。另为好。减少错配，避免引物不能延伸。另外外33端最好选保守的三个碱基序列（如保守的端最好选保守的三个碱基序列（如保守的aaaa密密码）码）引物与非特异扩增序列的同源性不要超过引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%70%或有或有连续连续8 8个互补碱基同源个互补碱基同源。扩增目的片段的长度。扩增目的片段的长度。引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以200-500bp200-500bp最好，最好，1kb1kb以以 下为宜。下为宜。3kb3kb3kb3kb效率大大下去降效率大大下去降,也能也能 扩增扩增10kb10kb以上（困难）以上（困难）所用引物浓度所用引物浓度 引物纯度最好达引物纯度最好达PAGEPAGE电泳纯、电泳纯、HPLCHPLC纯。纯。引物浓度引物浓度0.1-0.5-1mol/L0.1-0.5-1mol/L或或1010 100pmol 100pmol，以最低引物量产生所需要的结果，以最低引物量产生所需要的结果 为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性 扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 两引物浓度为两引物浓度为1:11:1引物引物55端具包容性端具包容性，可容忍不配对序列存在，可容忍不配对序列存在，据此可按需设计附加序列。据此可按需设计附加序列。此附加序列配对时开始此附加序列配对时开始55端游离，以后因端游离，以后因已进入产物序列，便可扩增，如插入酶切位点，已进入产物序列，便可扩增，如插入酶切位点，调控元件，等调控元件，等。密码子的简并密码子的简并 如扩增编码区域，引物如扩增编码区域，引物33端不端不要终止于密码子的第要终止于密码子的第3 3位，因密码子的第位，因密码子的第3 3位易位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。发生简并，会影响扩增特异性与效率。l综上所述我们可以归纳综上所述我们可以归纳十条十条PCRPCR引物的设计原则引物的设计原则：引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。产物不能形成二级结构。引物长度一般在引物长度一般在15-3015-30碱基之间。碱基之间。G+C G+C含量在含量在40%-60%40%-60%之间。之间。碱基要随机分布。碱基要随机分布。引物自身不能有连续引物自身不能有连续4 4个碱基的互补。个碱基的互补。引物之间不能有连续引物之间不能有连续4 4个碱基的互补。个碱基的互补。引物引物55端可以修饰。端可以修饰。引物引物33端不可修饰。端不可修饰。引物引物33端要避开密码子的第端要避开密码子的第3 3位。位。*酶及其浓度酶及其浓度要素之二：要素之二：DNADNA聚合酶聚合酶 酶酶是是PCRPCR成成功功与与否否的的另另一一关关键键因因素素(详详见见后后进进展展一一节节).).它决定了：它决定了：酶促反应能否进行；酶促反应能否进行；特异性催化特异性催化(反应、校对反应、校对)；效率效率 ；速度速度l常用的常用的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶从栖热水生杆菌中提纯的天然酶。从栖热水生杆菌中提纯的天然酶。l催化一典型的催化一典型的PCRPCR反应约需酶量反应约需酶量2.5U2.5U（指总反应体积为（指总反应体积为100ul100ul时）时）l浓度过高可引起非特异性扩增，浓度浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少过低则合成产物量减少*dNTPdNTP质量与浓度质量与浓度要素之三要素之三ldNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系扩增效率有密切关系ldNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失活粉呈颗粒状，如保存不当易变性失活ldNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或或1MTris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pH调节到调节到7.07.5，小量分装，小量分装，-20冰冻保存冰冻保存l多次冻融会使多次冻融会使dNTP降解降解l在在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为50200umol/L，尤，尤其是注意其是注意4种种dNTP的浓度要相等的浓度要相等(等摩尔配制等摩尔配制)，浓度过低又会降低浓度过低又会降低PCR产物的产量产物的产量ldNTP能与能与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度降低浓度降低*模板核酸模板核酸要素之四要素之四l模板核酸的量与纯化程度，是模板核酸的量与纯化程度，是PCRPCR成败与否的关成败与否的关键环节之一键环节之一l传统的传统的DNADNA纯化方法：纯化方法：采用采用SDSSDS和蛋白酶和蛋白酶K K来消化处理标本来消化处理标本用有机溶剂酚与氯仿抽提去蛋白质和其它细用有机溶剂酚与氯仿抽提去蛋白质和其它细胞组份胞组份用乙醇或异丙醇沉淀核酸用乙醇或异丙醇沉淀核酸*MgMg2+2+浓度浓度要素之五要素之五lMg Mg 2+2+对对PCRPCR扩增的特异性和产量有显著的影扩增的特异性和产量有显著的影响响l在一般的在一般的PCRPCR反应中，各种反应中，各种dNTPdNTP浓度为浓度为200 200 umol/Lumol/L时，时，MgMg2+2+浓度为浓度为1.51.52.0 mmol/L2.0 mmol/L为宜为宜lMg Mg 2+2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低异扩增，浓度过低会降低Taq DNATaq DNA聚合酶的活聚合酶的活性，使反应产物减少性，使反应产物减少引物设计引物设计PrimerPremier5.0 每个生物医学工作者都应做到每个生物医学工作者都应做到 1)1)掌握掌握PCRPCR概念与内涵概念与内涵 2)2)掌握特异性扩增的原理掌握特异性扩增的原理 3)3)掌握掌握PCRPCR百万倍扩增目的百万倍扩增目的DNADNA片段原理片段原理 4)4)学会学会PCRPCR引物的设计，学会引物的设计，学会PCRPCR操作技术操作技术 5)5)了解了解PCRPCR的优缺点？应用前景？的优缺点？应用前景？PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链反应Thanks for your attention!谢谢大家谢谢大家