酶工程酶制剂制备课件

资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（细胞破碎）（细胞破碎）发酵液预处理发酵液预处理 酶液脱色酶液脱色 酶蛋白的初步纯化与浓缩酶蛋白的初步纯化与浓缩 （酶蛋白的提纯与精制）（酶蛋白的提纯与精制）酶制剂的成形。酶制剂的成形。CH 4.1 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法酶制剂的工业提取方法（细胞破碎）CH4.1酶制剂的工业提取方法1资料仅供参考,不当之处，请联系改正。注意事项注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解基本原则：防止生物分子变性、降解 1控制适当的控制适当的pH 2控制低温控制低温 3注意提取过程中的溶液环境注意提取过程中的溶液环境 4防防止止提提纯纯过过程程中中丟丟失失一一些些辅辅助助因因子子或亚基或亚基注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH 4.1 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法酶制剂的工业提取方法1 细胞破碎方法细胞破碎方法对于胞内酶的提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内对于胞内酶的提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内的酶蛋白游离出来，常用的破碎方法有以下几种：的酶蛋白游离出来，常用的破碎方法有以下几种：1.1 机械破碎法：机械破碎法：1.2 物理破碎法：物理破碎法：1.3 化学方法：化学方法：机械捣碎法：机械捣碎法：10000转转/分。分。研磨法：只适合于实验室的小规模操作。研磨法：只适合于实验室的小规模操作。匀浆法：细胞的破碎程度较高，规模小匀浆法：细胞的破碎程度较高，规模小。温差破碎法：温差破碎法：超声波（超声波（20kHz）裂解法：裂解法：15-25kHz，100-150W，0-10，3-10min；目前有效的化学方法主要是加入表面活性剂法常目前有效的化学方法主要是加入表面活性剂法常用的有：特里顿用的有：特里顿X-100和吐温（和吐温（Tween），），其主要是其主要是破坏细胞膜的结构，增加膜通透性。此法在实验室破坏细胞膜的结构，增加膜通透性。此法在实验室和生产上已成功应用和生产上已成功应用 CH4.1酶制剂的工业提取方法1细胞破碎方法对于3资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH 4.1 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法酶制剂的工业提取方法2 2 发酵液的预处理发酵液的预处理2.1 发酵液絮凝发酵液絮凝发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌体自溶产生的细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，体自溶产生的细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，使得发酵液很难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。使得发酵液很难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。发酵液的预处理的常用方法主要是在发酵液中加入发酵液的预处理的常用方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，常用的絮凝剂有：絮凝剂，常用的絮凝剂有：聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）磺化聚苯乙烯（磺化聚苯乙烯（Polystyrene Sulfonate）；絮凝剂加入，主要有以下三方面的作用：絮凝剂加入，主要有以下三方面的作用：改变发酵液中悬浮粒子的物理特性，如加大粒子的大改变发酵液中悬浮粒子的物理特性，如加大粒子的大小，提高粒子的硬度等；小，提高粒子的硬度等；使一些可溶性的胶体物质变成不溶性的沉淀粒子；使一些可溶性的胶体物质变成不溶性的沉淀粒子；降低发酵液的黏度。降低发酵液的黏度。2.2酶液的脱色酶液的脱色 这一步骤可根据酶制剂的要求而定，一般工业酶制剂允这一步骤可根据酶制剂的要求而定，一般工业酶制剂允许含有来源中的色素，所以就不脱色；对于医用酶制剂、许含有来源中的色素，所以就不脱色；对于医用酶制剂、分析用酶等必须进行脱色处理；目前大部分工业酶制剂都分析用酶等必须进行脱色处理；目前大部分工业酶制剂都要进行脱色处理过程。要进行脱色处理过程。常用的脱色剂有活性炭和离子交换树脂。常用的脱色剂有活性炭和离子交换树脂。活性炭吸附法，操作效率较高，脱色较彻底，但在脱活性炭吸附法，操作效率较高，脱色较彻底，但在脱色的同时，也有部分酶蛋白被吸附掉了；色的同时，也有部分酶蛋白被吸附掉了；离子交换树脂基本上在脱色的同时，不吸附酶蛋白。离子交换树脂基本上在脱色的同时，不吸附酶蛋白。我国生产了一种脱色专用树脂：我国生产了一种脱色专用树脂：通用号脱色树脂。通用号脱色树脂。在弱酸性条件下，其吸附色素，而在碱性条件下便释放在弱酸性条件下，其吸附色素，而在碱性条件下便释放色素。色素。树脂的再生方便，再生的条件是：树脂的再生方便，再生的条件是：先用的先用的NaOH洗脱色素，待色素洗脱干净后，用蒸馏洗脱色素，待色素洗脱干净后，用蒸馏水洗到中性，再用水洗到中性，再用5%的的HCl（二倍树脂床体积）中和树二倍树脂床体积）中和树脂，再用蒸馏水洗到脂，再用蒸馏水洗到pH5.0-5.5为止。为止。CH4.1酶制剂的工业提取方法2发酵液的预处理2.14资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH 4.1 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法酶制剂的工业提取方法3 3 酶蛋白的初步纯化与浓缩酶蛋白的初步纯化与浓缩 3.1 盐析法盐析法1 盐析的基本原理：盐析的基本原理：蛋白质在水中的溶解度与其所带净电荷的多少蛋白质在水中的溶解度与其所带净电荷的多少呈正相关，即蛋白质的极性越强，其溶解度越大，溶呈正相关，即蛋白质的极性越强，其溶解度越大，溶液中的离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质液中的离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质的水合程度，降低其溶解度；的水合程度，降低其溶解度；另一方面，液相中离子的电荷部分地中和蛋白另一方面，液相中离子的电荷部分地中和蛋白质分子上的电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促质分子上的电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出；使蛋白质析出；此外，溶液中的盐离子引起水分子的极化和定此外，溶液中的盐离子引起水分子的极化和定向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性向排列降低水分活度；以上三方面的作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。蛋白在水溶液中析出。在盐溶液里，蛋白质的溶解度的对数值与溶液里的在盐溶液里，蛋白质的溶解度的对数值与溶液里的离子强度成线性关系，人们总结了以下经验公式：离子强度成线性关系，人们总结了以下经验公式：logS=-Ks.S:Protein的溶解度的溶解度g/l；为溶液离子强度为零时的为溶液离子强度为零时的logS，值受蛋白质性质、盐离子的种类、溶液的温度和值受蛋白质性质、盐离子的种类、溶液的温度和pH值的影响；值的影响；Ks为盐析常数，因蛋白质而性质和盐离子的种类不同而不同；为盐析常数，因蛋白质而性质和盐离子的种类不同而不同；为溶液的离子强度。为溶液的离子强度。2 盐析的基本方法：盐析的基本方法：蛋白质的盐析方法主要有以下两种：蛋白质的盐析方法主要有以下两种：Ks盐析法：即蛋白质溶液的盐析法：即蛋白质溶液的pH值和温度固定不变，值和温度固定不变，改变溶液的盐浓度（离子强度），以达到沉淀蛋白的作改变溶液的盐浓度（离子强度），以达到沉淀蛋白的作用；此法常用的盐是硫酸铵。用；此法常用的盐是硫酸铵。盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的pH值和温度，以达到蛋白沉淀的目的。值和温度，以达到蛋白沉淀的目的。在实际工作中，常用的是在实际工作中，常用的是Ks盐析法，利用不同饱和度盐析法，利用不同饱和度的的(NH4)2SO4浓度，这样不同的蛋白质析出沉淀的浓度，这样不同的蛋白质析出沉淀的(NH4)2SO4 浓度不同；通过这种方法可将部分杂蛋白分浓度不同；通过这种方法可将部分杂蛋白分离出去，达到浓缩酶蛋白的目的。离出去，达到浓缩酶蛋白的目的。3 盐析曲线：盐析曲线：按盐析经验公式，以中性盐浓度对酶蛋白溶解度作图，按盐析经验公式，以中性盐浓度对酶蛋白溶解度作图，得一条如下曲线：得一条如下曲线：盐浓度（饱和度）盐浓度（饱和度）酶蛋白溶解度酶蛋白溶解度盐溶效应：盐溶效应：4具体操作方法：具体操作方法：饱和溶液法饱和溶液法:干粉加入法干粉加入法:5影响盐析的因素：影响盐析的因素：温度：温度：pH：6盐析后的脱盐处理盐析后的脱盐处理 透析法：透析法：凝胶过滤法：凝胶过滤法：CH4.1酶制剂的工业提取方法3酶蛋白的初步纯化与5资料仅供参考,不当之处，请联系改正。调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表调整硫酸铵溶液饱和度计算表6资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH 4.1 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法酶制剂的工业提取方法3 3 酶蛋白的初步纯化与浓缩酶蛋白的初步纯化与浓缩3.2 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 除用盐析法沉淀酶蛋白外，还可以用有机溶剂沉淀酶蛋白，除用盐析法沉淀酶蛋白外，还可以用有机溶剂沉淀酶蛋白，目前选用的有机溶剂主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果目前选用的有机溶剂主要有丙酮和乙醇，并且丙酮的沉淀效果比乙醇好，但丙酮的价格高，蒸馏回收困难，所以目前多采用比乙醇好，但丙酮的价格高，蒸馏回收困难，所以目前多采用乙醇作沉淀剂。乙醇作沉淀剂。沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多因素影响，溶液的离子强沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多因素影响，溶液的离子强度、温度、度、温度、pH值等都影响蛋白质的析出，低浓度的盐离子有促值等都影响蛋白质的析出，低浓度的盐离子有促进蛋白质溶解的作用，即所谓的盐溶效应；所以当溶液中有低进蛋白质溶解的作用，即所谓的盐溶效应；所以当溶液中有低浓度盐离子时，乙醇的浓度要增加；温度升高蛋白质的溶解度浓度盐离子时，乙醇的浓度要增加；温度升高蛋白质的溶解度增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇浓度增加；增加，沉淀酶蛋白需要的乙醇浓度增加；pH值的影响因不同的值的影响因不同的蛋白质而不同，一般情况下，当溶液的蛋白质而不同，一般情况下，当溶液的pH值与酶蛋白的等电点值与酶蛋白的等电点一致时，需要的乙醇浓度最低，偏离酶蛋白的等电点越远，酶一致时，需要的乙醇浓度最低，偏离酶蛋白的等电点越远，酶蛋白所带电荷越多，蛋白质的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇蛋白所带电荷越多，蛋白质的溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇浓度越高。浓度越高。一般作为沉淀剂的乙醇浓度是一般作为沉淀剂的乙醇浓度是95%，沉淀不同的酶蛋白需要乙醇，沉淀不同的酶蛋白需要乙醇量稍有差异。量稍有差异。如沉淀枯草杆菌的淀粉酶发酵液时，要求乙醇浓度为：每体积的如沉淀枯草杆菌的淀粉酶发酵液时，要求乙醇浓度为：每体积的发酵液加发酵液加0.20.8体积的乙醇；体积的乙醇；当沉淀蛋白酶时，加当沉淀蛋白酶时，加0.81.1体积的乙醇沉淀出的主要是中性蛋体积的乙醇沉淀出的主要是中性蛋白酶，加白酶，加1.11.4体积的乙醇时，沉淀出的主要是碱性蛋白酶。体积的乙醇时，沉淀出的主要是碱性蛋白酶。对于每一种酶蛋白的沉淀要求乙醇的适宜浓度需要实验确定对于每一种酶蛋白的沉淀要求乙醇的适宜浓度需要实验确定。CH4.1酶制剂的工业提取方法3酶蛋白的初步纯化与7资料仅供参考,不当之处，请联系改正。几种主要沉淀方法比较几种主要沉淀方法比较几种主要沉淀方法比较8资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH 4.1 CH 4.1 酶制剂的工业提取方法酶制剂的工业提取方法3 3 酶蛋白的初步纯化与浓缩酶蛋白的初步纯化与浓缩3.3 喷雾干燥法喷雾干燥法 此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶浓缩成固体酶制剂，此法的生产效率较高，浓缩成固体酶制剂，此法的生产效率较高，工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定的局限性，在喷雾干燥时，需要一定的温度，的局限性，在喷雾干燥时，需要一定的温度，在喷雾塔里面进如一定温度的热空气，对于在喷雾塔里面进如一定温度的热空气，对于那些对热不稳定的酶蛋白不宜使用，现用在那些对热不稳定的酶蛋白不宜使用，现用在生产的主要是生产生产的主要是生产-淀粉酶。淀粉酶。3.4膜分离技术除上述经典的浓缩方法外，目前膜技术的发展已应用到酶蛋白的浓缩和分离上来了，膜分离技术是以一定孔径的高分子膜作为过滤介质，将不同大小、不同性状、物质颗粒或大分子进行分离的技术。膜分离技术所使用的膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢、尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。在膜分离过程中，膜的作用是有选择性地小于其孔径的颗粒通过，将大的颗粒截留，根据欲分离的物质颗粒的大小，选择不同孔径的膜。根据物质颗粒通过膜的原理及和推动力的不同，膜分离技术可分为以下三种：加压膜分离加压膜分离是以膜两侧的流体静压差为动力，推动小于膜孔径的颗粒通过膜孔，大于孔径的颗粒被截留。根据膜孔径大小范围又分为超滤、微滤和反渗透三种。超滤：超滤：即超过滤，本技术过滤截留的颗粒直径在202000A（0.2m)相当于分子量10005105Da,并且有多种规格供选用。此法主要用于酶蛋白的浓缩和部分纯化分离，此外，在生化药业也常被采用。此技术采用的滤膜是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜，膜由两层构成，分表层和基层，表层是滤膜的有效层，其厚度为0.15mm，孔径大小有多种规格，现有202000A的系列产品销售；基层为支持层，主要负责膜的强度，其厚度为200250m具有坚韧的强度。影响超滤的因素：膜的过滤效果用膜的流率来表示，即每平方厘米膜每分钟滤过的流体量，以ml./cm2.min表示，影响流率的主要因素有膜孔径的大小、颗粒性状、溶液的黏度、流体静压。根据上述影响因素，可在一定范围内增加流体静压（一般控制在50700kPa)、适当提高溶液温度、增加溶液的搅拌述度都可在一定程度上提高膜的流率。超滤技术在目前无论是实验室研究还是酶制剂的工业化生产应用都非常广泛，其操作简单，工作效率高，但对于那些有小分子辅酶的酶制剂不宜采用此技术。微滤：微滤：又称微孔过滤，其孔径较超滤膜的孔径大，一般在0.22.0m范围，主要用于过滤去除细菌及其它显微镜下可见的颗粒物质，此法在酶蛋白的浓缩和分离方面不用，主要勇于矿泉水、无菌水、软饮料生产方面除菌和除去不溶性颗粒物质。反渗透：反渗透：反渗透膜的孔径最小，一般在20A，截留分子量为1000D主要用于分离各种离子和小分子物质，此技术主要用于生产纯水，海水的淡化等。电场膜分离：将膜分离装置置于电场下，被分离的物质在电场的作用下，借助电场力作为推动力，以达到分离的目的。利用电场膜分离的物质，必须具备一个基本条件，那就是其必须是带电粒子，如果其不带电荷，或其静电荷为零，这样的粒子就不适宜用此法分离。常用的有以下两种方法：电渗析：电渗析：在一个电渗槽内，用两块半通透膜隔成三个室，中间室装待分离液，两侧室装水或缓冲液，并装有电极，接通电源后，带正电荷的粒子向负极渗透，而带负电荷的粒子向正极渗透，从而达到分离的目的。此法多用于酶液的脱盐，去除杂质等。离子交换膜电渗析：离子交换膜电渗析：其装置与电荷风析一致，只是所用的膜较为特殊，两块膜上带有带电基团，且电性相反，使得带相同电荷的粒子不能靠近膜，不致于影响膜的通透性。其应用范围与电渗析一致，当溶液的浓度较高时，此法工作效率更高。扩散膜分离：扩散膜分离主要是指透析方法，将酶溶液装在由扩散膜制成的透析袋中，再将透析袋置于扩散介质（缓冲液）中，溶液中的小分子就通过膜扩散出来，大分子被截留在袋内。此法主要用于没蛋白的脱盐；另外此法还可用于酶蛋白的浓缩，当浓缩酶蛋白时，是用高浓度的吸水性较强的扩散介质，常用的有甘油、聚乙二醇（粉剂）等。CH4.1酶制剂的工业提取方法3酶蛋白的初步纯化与9资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-2CH4-2酶蛋白的提纯与精制酶蛋白的提纯与精制一般情况下，工业上用的大多是经过初步提纯和浓一般情况下，工业上用的大多是经过初步提纯和浓缩即可制备成酶制剂；对于多数医用酶制剂或分析用缩即可制备成酶制剂；对于多数医用酶制剂或分析用酶制剂或生化试剂等，则需要进行高度提纯和精制；酶制剂或生化试剂等，则需要进行高度提纯和精制；另外对于开发出的新的酶制剂，在投入规模化生产前，另外对于开发出的新的酶制剂，在投入规模化生产前，为研究其各种酶蛋白特性和酶学特性，也需要将酶进为研究其各种酶蛋白特性和酶学特性，也需要将酶进一步提纯和精制。一步提纯和精制。酶蛋白提纯的经典程序包括：酶蛋白提纯的经典程序包括：离子交换层析离子交换层析分子筛过滤层析分子筛过滤层析电泳检测纯度电泳检测纯度（必要时可进行制备电泳分离）（必要时可进行制备电泳分离）CH4-2酶蛋白的提纯与精制一般情况下，工业上用的大多是经10资料仅供参考,不当之处，请联系改正。各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）各类层析的原理和载体类别分离11资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-2CH4-2酶蛋白的提纯与精制酶蛋白的提纯与精制1 1 离子交换层析法离子交换层析法 （1）离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧）离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的静电吸附作用，对极性大分子进行分离。静电吸附作用，对极性大分子进行分离。按离子交换剂上的活性基团的性质不同，按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。阴离子交换剂：阴离子交换剂：当离子交换剂携带阳性基团，用来吸附阴离子时，当离子交换剂携带阳性基团，用来吸附阴离子时，交换剂称为阴离子交换剂。交换剂称为阴离子交换剂。目前常用的阴离子交换剂有：目前常用的阴离子交换剂有：DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）DEAE纤维素适宜用来分离分子量在纤维素适宜用来分离分子量在10,000-100,000或以或以上的蛋白质，其稳定性好，装柱后，在洗脱过程中，柱床体积基本上的蛋白质，其稳定性好，装柱后，在洗脱过程中，柱床体积基本保持不变，交换容量大，每克交换剂可吸附保持不变，交换容量大，每克交换剂可吸附0.11.1毫克酶蛋白。毫克酶蛋白。DEAESephadexA50DEAESephadexA50的交换容量更大，（的交换容量更大，（5.0毫克毫克/克交换克交换剂），但其有一最大的局限性，就是在洗脱过程中，随着离子强度剂），但其有一最大的局限性，就是在洗脱过程中，随着离子强度的增加柱床体积变小，影响分离效果。的增加柱床体积变小，影响分离效果。AE纤维素（氨基乙基纤维素）纤维素（氨基乙基纤维素）阳离子交换剂：阳离子交换剂：阳离子交换剂有：阳离子交换剂有：CM纤维素（纤维素（CMC，羧甲基纤维素）。羧甲基纤维素）。弱酸性阳离子交换剂。弱酸性阳离子交换剂。磷酸纤维素（磷酸纤维素（PC）中酸性离子交换剂。中酸性离子交换剂。CH4-2酶蛋白的提纯与精制1离子交换层析法（1）离12资料仅供参考,不当之处，请联系改正。常用的阳离子交换剂常用的阳离子交换剂离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型）羧甲基羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型）磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型）磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型）磺丙基磺丙基常用的阳离子交换剂离子交换剂13资料仅供参考,不当之处，请联系改正。常用的阴离子交换剂常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱碱型）纤维素（弱碱型）氨基乙基氨基乙基离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱碱型）纤维素（弱碱型）对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-纤维素（强碱型）纤维素（强碱型）三乙基氨基乙基三乙基氨基乙基QAE-纤维素（强碱型）纤维素（强碱型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟丙基）基）-氨基乙基氨基乙基（中弱碱型）（中弱碱型）（中弱碱型）（中弱碱型）常用的阴离子交换剂AE-纤维素（弱碱型）14资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-2CH4-2酶蛋白的提纯与精制酶蛋白的提纯与精制1 1 离子交换层析法离子交换层析法（2）离子交换分离酶蛋白的基本原理：）离子交换分离酶蛋白的基本原理：一般情况下，酶蛋白的等电点在一般情况下，酶蛋白的等电点在pH7以下，所以下，所以在偏碱性溶液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离以在偏碱性溶液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离子交换剂；（有些酶蛋白等子交换剂；（有些酶蛋白等 电点较高，可以将其置电点较高，可以将其置于偏酸性溶液中，这样酶蛋白就带正电荷，分离纯化于偏酸性溶液中，这样酶蛋白就带正电荷，分离纯化时应选用阳离子交换剂）。时应选用阳离子交换剂）。在同一在同一pH条件下，由于不同的蛋白质所带电荷条件下，由于不同的蛋白质所带电荷不同，其与交换剂的亲和力不同，通过梯度增加洗脱不同，其与交换剂的亲和力不同，通过梯度增加洗脱剂的离子强度，按蛋白质与交换剂亲和力的由小到大，剂的离子强度，按蛋白质与交换剂亲和力的由小到大，依次被洗脱下来，达到分离的目的。依次被洗脱下来，达到分离的目的。CH4-2酶蛋白的提纯与精制1离子交换层析法（2）离子交15资料仅供参考,不当之处，请联系改正。离离子子交交换换层层析析原原理理示示意意图图蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管收集样品的管收集样品的管带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质蛋白质混合物蛋白质混合物玻璃柱玻璃柱带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质收集样品的管收集样品的管NaClNaCl梯度梯度离子交换层析原理示意图蛋白质浓度洗脱体积带正电荷的蛋白质带16资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-2CH4-2酶蛋白的提纯与精制酶蛋白的提纯与精制1 1 离子交换层析法离子交换层析法离子交换拄层析基本程序及要点：离子交换拄层析基本程序及要点：（以（以DEAE纤维素为例）纤维素为例）离子交换剂的处理：首先将离子交换剂的处理：首先将DEAE纤纤维素用蒸馏水浸泡溶涨，然后按：维素用蒸馏水浸泡溶涨，然后按：0.5N盐酸盐酸处理处理30分钟以上（不断搅拌）分钟以上（不断搅拌）蒸馏水反复蒸馏水反复洗涤致中性洗涤致中性0.5N氢氧化钠处理氢氧化钠处理30分钟（不分钟（不断搅拌）断搅拌）蒸馏水洗涤致中性。蒸馏水洗涤致中性。洗脱液洗脱液pH的确定：采用的确定：采用pH梯度测定。梯度测定。按按10交换当量加入离子交换剂和酶蛋白交换当量加入离子交换剂和酶蛋白振荡保温振荡保温2030min静止后，测定上清夜的酶活力静止后，测定上清夜的酶活力到没有酶活力测出的试管到没有酶活力测出的试管pH1，即为离子交换洗脱液即为离子交换洗脱液的最适的最适pHpH1pH2pH3pH6pH5pH4pH7平衡：装柱后，用洗脱液进行平衡过夜，流述稍大于平衡：装柱后，用洗脱液进行平衡过夜，流述稍大于洗脱流述，使流出缓冲液的洗脱流述，使流出缓冲液的pH与流入的相同。与流入的相同。上样和平衡上样和平衡：为达到良好的分离效果，上样量一般为为达到良好的分离效果，上样量一般为其交换容量的其交换容量的1020%，样品的，样品的pH值和离子强度应与值和离子强度应与洗脱液一致。洗脱液一致。上样后用洗脱上样后用洗脱Buffer平衡。平衡。洗脱曲线：洗脱曲线：分部收集：利用自动分部收集器收集。分部收集：利用自动分部收集器收集。洗脱：上样后，首先用平衡洗脱液洗脱，主要是洗洗脱：上样后，首先用平衡洗脱液洗脱，主要是洗脱下那些与交换剂结合力很小或不结合的杂蛋白；然后，脱下那些与交换剂结合力很小或不结合的杂蛋白；然后，通过改变洗脱液的离子强度进行梯度洗脱梯度洗脱公式通过改变洗脱液的离子强度进行梯度洗脱梯度洗脱公式为：为：=C2(C2C1)(1v/V)A2/A1C2：洗脱液的极限离子浓度；洗脱液的极限离子浓度；C1：初始离子浓度；初始离子浓度；v：洗脱液流出体积；洗脱液流出体积；V：贮液室和混合室的总体积；贮液室和混合室的总体积；A2：贮液室的截面积；贮液室的截面积；A1：混合室的截面积；混合室的截面积；当当A2/A1等于等于1时，上述公式代表一个直线梯度变化；当小于时，上述公式代表一个直线梯度变化；当小于1时，时，为凹形梯度变化；当大于为凹形梯度变化；当大于1时，为凸形梯度变化。时，为凸形梯度变化。装柱：将交换剂搅拌悬浮起来，抽气处理，然后用装柱：将交换剂搅拌悬浮起来，抽气处理，然后用倾倒法装柱。倾倒法装柱。(8)收集与浓缩收集与浓缩凝胶颗粒凝胶颗粒蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子小分子小分子储液瓶储液瓶混合瓶混合瓶层层析析柱柱磁力搅拌器磁力搅拌器洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度简单型梯度混合器简单型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度储液瓶储液瓶混混合合瓶瓶复合型梯度混合器复合型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线凸形凸形线形线形凹形凹形CH4-2酶蛋白的提纯与精制1离子交换层析法离子交换拄17资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-2CH4-2酶蛋白的提纯与精制酶蛋白的提纯与精制2 2 分子筛层析法分子筛层析法（1）分子筛层析法分子筛层析法基本原理基本原理 凝胶过滤法是以不同蛋白质的分子量大凝胶过滤法是以不同蛋白质的分子量大小差异来将不同蛋白质分开的方法。最常用小差异来将不同蛋白质分开的方法。最常用的凝胶是葡聚糖凝胶（的凝胶是葡聚糖凝胶（Sephadex),是由葡聚是由葡聚糖和糖和3-1,2环氧化丙烷（交联剂）相互交联而环氧化丙烷（交联剂）相互交联而成的中央带有微孔的球状凝胶颗粒，根据凝成的中央带有微孔的球状凝胶颗粒，根据凝胶分子的交联程度的不同，共有胶分子的交联程度的不同，共有SephadexG10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200等等8种型号，种型号，G50以下以下的为硬胶，的为硬胶，G75以上的为软胶。以上的为软胶。G10的交联的交联度最高，分子内的网孔最小；度最高，分子内的网孔最小；G200的交联度的交联度最低，分子内网孔最大。最低，分子内网孔最大。根据蛋白质分子大小不同，在通过层析柱根据蛋白质分子大小不同，在通过层析柱时，走的路程不同，从而分开。时，走的路程不同，从而分开。（2）凝胶的选择：凝胶的选择：G25以下主要用于脱盐和氨基酸，或用于分离分子量以下主要用于脱盐和氨基酸，或用于分离分子量在在5000以下的小肽。以下的小肽。G50 主要用于分离分子量主要用于分离分子量150030000的小分子蛋白。的小分子蛋白。G75 300080000 G100 4000150000 G150 5000300000 G200 5000600000（3）凝胶的溶胀：）凝胶的溶胀：凝胶规格凝胶规格 融胀体积（融胀体积（ml/g)时间时间/h.20C 时间时间/h.90-100C G10 23 3 1 G15 2.5-3.5 3 1 G25 4-6 3 1 G50 9-11 3 1 G75 12-15 24 3 G100 15-20 72 3 G150 20-30 72 5 G200 30-40 72 5(4)装柱：装柱：装柱前必须进行凝胶脱气处理，装柱前必须进行凝胶脱气处理，装柱要求同离子交换层析装柱要求同离子交换层析（5 5）装柱效果检测：）装柱效果检测：用带有颜色的大分子上样，然后洗脱，检测样品走柱的介面效用带有颜色的大分子上样，然后洗脱，检测样品走柱的介面效果，常用蓝色葡聚糖果，常用蓝色葡聚糖20002000。（6）上样：上样：和离子交换层析有根本不同。和离子交换层析有根本不同。主要考虑上样体积，一般控制在主要考虑上样体积，一般控制在1 11010。视具体情况而定。视具体情况而定。（7）洗脱）洗脱 洗脱剂可以用低浓度洗脱剂可以用低浓度 Buffer，也可用蒸馏水；也可用蒸馏水；在洗脱过程中，主要控制两个参数：在洗脱过程中，主要控制两个参数：流速和有效操作压流速和有效操作压 凝胶规格凝胶规格 流速（流速（ml/h.cm2)有效操作压有效操作压(cm/H2O)G10 G15 G25 G50 G75 77 160 G100 50 96 G150 23 36 G200 12 16（8）分部收集：分部收集：基本同离子交换层析基本同离子交换层析(9)凝胶的再生与保存：凝胶的再生与保存：再生再生：用：用0.1mol 盐酸和盐酸和0.1mol 氢氧化钠交替浸泡后，蒸氢氧化钠交替浸泡后，蒸馏水洗到中性，重新装柱，可反复使用；馏水洗到中性，重新装柱，可反复使用；保存：保存：用用0.1mol 盐酸和盐酸和0.1mol 氢氧化钠交替浸泡后，蒸氢氧化钠交替浸泡后，蒸馏水洗到中性；馏水洗到中性；50乙醇乙醇75乙醇乙醇95乙醇乙醇冰箱保存。冰箱保存。CH4-2酶蛋白的提纯与精制2分子筛层析法（1）分子筛层18资料仅供参考,不当之处，请联系改正。蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMr洗脱体积与相对分子质量的关系洗脱体积与相对分子质量的关系Andrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白MrMrMrMr“选择性曲线选择性曲线选择性曲线选择性曲线”G-200G-100logMrKav蛋白质Mr=49,000洗出液中的蛋白质浓度洗脱体积（mL）19资料仅供参考,不当之处，请联系改正。吸附层析吸附层析（absorption chromatographyabsorption chromatography）原理：原理：载体载体：硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 羟基磷石灰羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质等生化物质以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。同速度随流动相向前移动。吸附层析（absorptionchromat20资料仅供参考,不当之处，请联系改正。分分 配配 层层 析析（distribuption chromatographydistribuption chromatography）原理：原理：载体载体：纤维素纤维素 硅藻土硅藻土 硅胶硅胶应用：应用：各种生化物质的分离鉴定各种生化物质的分离鉴定 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。分配层析（distribupt21资料仅供参考,不当之处，请联系改正。逆逆流流分分溶溶原原理理示示意意图图物质物质Y(Kd=1)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 A物质物质Z(Kd=3)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 B总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量平衡后平衡后转移转移 1转移转移 2转移转移 3分溶管号分溶管号转移转移 4上相转移上相转移下相转移下相转移上相转移上相转移管管中中蛋蛋白白质质总总量量物质物质Y物质物质Z分溶曲线分溶曲线管号管号有效分配系数（有效分配系数（Keff）某一物质在某一物质在A相中的总量相中的总量某一物质在某一物质在B相中的总量相中的总量逆流分溶原理示意图物质Y(Kd=1)的分配情况溶剂A物质22资料仅供参考,不当之处，请联系改正。亲和层析亲和层析（affiuity chromatography）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a.理论依据理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex亲和层析（affiuitychromatography）23资料仅供参考,不当之处，请联系改正。亲亲和和层层析析原原理理示示意意图图蛋白质混合物蛋白质混合物配体配体与配体结合的与配体结合的蛋白质蛋白质加入的可溶性加入的可溶性配基配基专一性结专一性结合蛋白质合蛋白质没有结合的没有结合的蛋白质蛋白质非专一性结非专一性结合蛋白质合蛋白质蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积与配体专一性与配体专一性结合蛋白质结合蛋白质加入配基加入配基基质基质亲和层析原理示意图蛋白质混合物配体与配体结合的蛋白质加入的24资料仅供参考,不当之处，请联系改正。聚焦层析（聚焦层析（ChromatofocusingChromatofocusing）该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时梯度的层析柱上时,由于洗脱由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。时被洗出。在聚焦层析过程中在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且有一定并且有一定的时间进行聚焦的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图梯度溶液的形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率层析时的聚焦效应示意图层析时的聚焦效应示意图聚焦层析（Chromatofocusing）25资料仅供参考,不当之处，请联系改正。几种主要层析方法比较几种主要层析方法比较几种主要层析方法比较26资料仅供参考,不当之处，请联系改正。酶蛋白经分离纯化后的纯度如何，必须用适当的实酶蛋白经分离纯化后的纯度如何，必须用适当的实验方法进行鉴定，最常用的方法是验方法进行鉴定，最常用的方法是聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE）,现已发展成很多方法，如：现已发展成很多方法，如：PAGE圆盘电泳（柱状电圆盘电泳（柱状电泳）、泳）、PAGE垂直板状电泳等。垂直板状电泳等。酶蛋白经分离纯化后的纯度如何，必须用适当的实验方法进行鉴定27资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-2CH4-2酶蛋白的提纯与精制酶蛋白的提纯与精制3 3 酶蛋白纯度检测酶蛋白纯度检测 电泳的基本原理电泳的基本原理聚丙烯酰胺凝是由丙烯酰胺单体（聚丙烯酰胺凝是由丙烯酰胺单体（Acr)和和N，N-亚甲亚甲基基-双丙烯酰胺双丙烯酰胺(Bis)在催化剂的作用下，经聚合反应在催化剂的作用下，经聚合反应而形成的，根据欲分离的蛋白分子的大小，通过控制而形成的，根据欲分离的蛋白分子的大小，通过控制Acr和和Bis的比例以及总浓度来控制凝胶的孔径大小，的比例以及总浓度来控制凝胶的孔径大小，制成各种孔径的凝胶，这样蛋白质颗粒在电泳时，两制成各种孔径的凝胶，这样蛋白质颗粒在电泳时，两种作用力，即电场力和蛋白质颗粒在电场中运动所受种作用力，即电场力和蛋白质颗粒在电场中运动所受的阻力，的阻力，F=H.Q.（1）F/=6.（2）F:电场力；电场力；H：电场强度；电场强度；Q：质点所带电荷；质点所带电荷；F/：质点所受阻力；质点所受阻力；：质点半径；质点半径；：电解质电解质黏度；黏度；电泳述度；电泳述度；CH4-2酶蛋白的提纯与精制3酶蛋白纯度检测电泳的基28资料仅供参考,不当之处，请联系改正。在一定的电场中，蛋白质分子的理论电泳迁移述率（即在一定的电场中，蛋白质分子的理论电泳迁移述率（即迁移述度）迁移述度）V=Q/6.（3）从这个公式中可以看出，从这个公式中可以看出，V与蛋白质所带电荷的多与蛋白质所带电荷的多少成正比，而与蛋白质分子的大小成反比。少成正比，而与蛋白质分子的大小成反比。不同的蛋白质，其分子量和所带电荷的多少都表现出不同的蛋白质，其分子量和所带电荷的多少都表现出不同程度的差异，从而在电泳时有不同的迁移输率，不同程度的差异，从而在电泳时有不同的迁移输率，经电泳后，不同的蛋白分子迁移到电泳介质的不同部经电泳后，不同的蛋白分子迁移到电泳介质的不同部位，经过蛋白质染色处理，在凝胶的不同区域表现出位，经过蛋白质染色处理，在凝胶的不同区域表现出相应的电泳带。相应的电泳带。从这个原理来讲，电泳技术不仅能对蛋白质进行纯度从这个原理来讲，电泳技术不仅能对蛋白质进行纯度鉴定，并且还是分离提纯的有效方法。鉴定，并且还是分离提纯的有效方法。在一定的电场中，蛋白质分子的理论电泳迁移述率（即迁移述度）29资料仅供参考,不当之处，请联系改正。电电泳泳技技术术分分类类垂直板电泳垂直板电泳毛细管电泳毛细管电泳水平板电泳水平板电泳电电泳泳支支持持物物滤纸滤纸凝胶凝胶薄膜薄膜圆盘电泳圆盘电泳电泳技术分类垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳电泳支持物滤纸凝胶30资料仅供参考,不当之处，请联系改正。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresispolyacrylamidegel electrophoresis，PAGE）PAGEPAGE是是在在区区带带电电泳泳原原理理的的基基础础上上，以以孔孔径径大大小小不不同同的的聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶(PAG)PAG)作作为为支支持持物物，采采用用电电泳泳基基质质的的不不连连续续体体系系(即即凝凝胶胶层层的的不不连连续续性性、缓缓冲冲液液离离子子成成分分的的不不连连续续性性、pHpH的的不不连连续续性性及及电电位位梯梯度度的的不不连连续续性性)或或 连连续续体体系系（一一层层凝凝胶胶、一一种种pHpH和和一一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。PAGPAG是是用用丙丙烯烯酰酰胺胺(acrylamideacrylamide，Acr)Acr)和和交交联联剂剂亚亚甲甲基基双双丙丙烯烯酰酰胺胺(N N，N N-methylen-methylen。bisacrylamidebisacrylamide，Bis)Bis)在在催催化化剂剂的的作作用用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合化学聚合:催化剂过硫酸铵催化剂过硫酸铵(AP)AP)，加速剂加速剂TEMEDTEMED 光聚合光聚合:催化剂核黄素，加速剂催化剂核黄素，加速剂TEMEDTEMED 不连续不连续PAGEPAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应浓缩效应聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegele31资料仅供参考,不当之处，请联系改正。不连续不连续PAGEPAGE的浓缩效应的浓缩效应样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶快离子快离子慢离子慢离子蛋白质蛋白质A AB BC C+-样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶电极缓电极缓冲液冲液低电位低电位梯度梯度E E1 11高电位高电位梯度梯度E E2 21+-不连续PAGE的浓缩效应样品浓缩胶分离胶快离子慢离子蛋白质32资料仅供参考,不当之处，请联系改正。SDS-PAGE原理：原理：当当SDSSDS（Sodium Dodecyl SulfateSodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在质在SDSSDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：线关系。可用下式表示：Log Mr=a bmr应用应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数测定蛋白质亚基数Mr（相对迁移率）相对迁移率）mr（相对迁移率）相对迁移率）Log MrSDS-PAGE原理：Mr（相对迁移率）mr（相对迁移率）33资料仅供参考,不当之处，请联系改正。等电点聚焦（等电点聚焦（isoelectric focusing）原理原理:在在一一定定抗抗对对流流介介质质（如如凝凝胶胶）中中加加入入两两性性电电解解质质载载体体(Ampholyte,是是一一种种多多氨氨基基多多羧羧基基的的混混合合物物，由由异异构构物物和和同同系系物物组组成成，其其pK和和pI值值各各自自相相异异却却又又相相近近），当当直直流流电电通通过过时时，便便形形成成一一个个由由阳阳极极到到阴阴极极pH值值逐逐步步上上升升的的梯梯度度。两两性性化化合合物物在在此此电电泳泳过过程程中中，就就被被浓浓集集在在与与其其pI相相等等的的pH区区域域，从从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：应用：高效率分离纯化蛋白质高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线线性性梯梯度度等电点聚焦（isoelectricfocusing）原34资料仅供参考,不当之处，请联系改正。琼脂糖电泳琼脂糖电泳 琼琼脂脂糖糖是是由由D-D-半半乳乳糖糖和和3 3、6 6脱脱水水的的L-L-半半乳乳糖糖连连接接构构成成的的多多糖糖链链，这这种种多多糖糖链链在在1001000 0C C左左右右时时呈呈液液态态，当当温温度度下下降降到到45450 0C C以以下下时时，它它们们之之间间以以氢氢键键方方式式相相互互连连接接就就成成了了线线性性双双链链单单环环的的琼琼脂脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶用用作作电电泳泳的的固固相相支支持持物物具具有有分分子子筛筛效效应应，其其对对生生物物分分子子的的分分离离作作用用不不仅仅与与其其分分子子的的构构象象及及其其相相对对分分子子质质量量大大小小有有关关，而而且且与与凝凝胶胶的的浓浓度度也也有有密密切切关关系系，故故可可根根据据分分离离对对象象分分子量大小选择适当浓度的凝胶。子量大小选择适当浓度的凝胶。琼琼脂脂糖糖电电泳泳常常用用于于核核酸酸分分离离，用用各各种种浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶可可以以分离长度为分离长度为2 2OObPOObP至至5 5OkbOkb的的DNADNA，琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。琼脂糖电泳琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖35资料仅供参考,不当之处，请联系改正。不同浓度琼脂糖凝胶分离不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围的范围琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度(%)(%)可分辨的线性可分辨的线性DNADNA大小范围大小范围(kb)kb)0.3 60-50.3 60-5 0.6 20-1 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1 2.0 3-0.1DNA相对分子质量相对分子质量标准物标准物水平型平板电泳槽水平型平板电泳槽不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围琼脂糖凝胶浓度(%)36资料仅供参考,不当之处，请联系改正。毛细管电泳毛细管电泳(Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresis，CE)CE)毛毛细细管管电电泳泳又又称称毛毛细细管管区区带带电电泳泳，它它是是在在毛毛细细管管（2-752-75mm）中中装装入入缓缓冲冲液液，从从其其一一端端注注入入样样品品，在在毛毛细细管管两两端端加加高高压压直直流流电电实实现现对对样样品品的的分分离离，分分离离后后的的样样品品依依次次通通过过设设在在毛毛细细管管一一端端的的检检测测器器检检出出。该该法法克克服服了了传传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是9090年代最有影响年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、研究、分离合成的寡核苷酸、DNADNA序列测定序列测定及及PCRPCR产物的分析鉴定等。产物的分析鉴定等。毛细管电泳原理示意图毛细管电泳原理示意图 毛细管电泳(CapillaryElectrophores37资料仅供参考,不当之处，请联系改正。毛细管电泳装置示意图毛细管电泳装置示意图30KV高压电源高压电源光光源源光电倍光电倍增管增管数据采集数据采集石英玻璃石英玻璃毛细管毛细管缓冲液缓冲液-样品样品缓冲液缓冲液正极正极负极负极毛细管电泳装置示意图30KV光源光电倍增管数据采集石英玻璃毛38资料仅供参考,不当之处，请联系改正。CH4-