核磁共振技术NMR及其操作系统应用-课件

NMR核磁共振技术及其操作系统应用液体NMR实验操作培训(一)NMR的基本概念:宏观磁化矢量的产生及其在脉冲作用下的 运动核磁共振仪器的介绍:磁体、谱仪、探头和频率通道Xwinnmr程序介绍:nmr数据目录和文件结构及程序的界面采样参数的介绍和设置:eda、ased、edasp1H谱的测试:RG的确定,D1、AQ的选择13C谱的测定:频率通道、脉冲序列和NMR实验NMR数据处理:窗函数及FT变化,相位和基线的校正,化学 位移定标原子核的磁性原子核(带电荷的粒子)的自旋会产生一个矢量一磁矩质子数和中子数都为偶数的原子核,12C、16O1H、13C、15N、31P、19F2H、11B、14N、17O、33S、35Cl静磁场B B0 0下原子核的磁性质=B B0 0没有静磁场有静磁场B0存在时原子核的核磁共振频率-Larmor Larmor 频率核磁矩沿外磁场方向进动的频率称为Larmor 频率w或共振频率、此频率的大小取决于原子核的种类及外磁场的大小、g 是磁旋比、它是原子核本身的属性并只能通过实验获取、在案BRUKER 仪器上,原子核的频率是通过参数BFn(MHz)设置、如BF1 代表第一通道、更精细的频率调节可用参数On来完成、On叫频率偏差频率或偏置频,因此总频率为SFOn:SFO1=BF1+O1 spins tend to align parallel or anti-parallel to B0 net magnetization(M)along B0 spins precess with random phase no net magnetization in transverse plane only 0、0003%of protons/T align with fieldMM=0transverseplane样品体系的宏观磁化矢量的产生无外加磁场有外加静磁场在磁场中,原来简并的能级分裂成不同的能级状态、假如用适当频率的电磁辐射照射就可观察到核自旋能级的跃迁、原子核能级的变化不仅取决于外部磁场强度的大小及不同种类的原子核,而且取决于原子核外部电子环境、如此我们就可获得原子核外电子环境的信息、宏观上讲,当用适当频率的电磁辐射(RF)照射样品,宏观磁化强度矢量从Z-轴转到X或Y轴上、通过接受器,傅立叶转换就得到核磁共振谱图、磁化矢量、射频脉冲和FIDFID信号B0MB0MRF 脉冲接收器ReceiverFTS(t)S(w w)FID信号旋转坐标系及FIDFID信号Mx=M0 sin cos(0t)My=M0 sin sin(0t)、脉冲作用前脉冲作用时脉冲作用后M0脉冲作用后在XY平面上的投影旋转坐标系意义(1):差频检测=s-r当sr时,信号将是如何？FID信号的差频检测混合检测的信号(10-800 MHz)参照频率(10-800 MHz)自由衰减信号(FID)(audio:0-100 kHz)接受器(RX22)数字化器(HADC)计算机储存 当磁化矢量被转到XY平面后,它仍以Larmor 频率绕Z-轴旋转、因此,核磁信号也是以相当的频率变化。、然而如此高频的信号(数百兆赫),即使使用高分辨的ADC也是不估计被数字化的。实际应用上,就将检测到的信号与一参照频率相混合而得到其差频,此差频落在100KHz的范围内(声频)并特别容易被数字化。通常参照频率即为旋转坐标系的旋转频率FID信号检测Nyquist采纳理论:数学上为能正确确定一经过坐标原点的周期涵数的频率,在某一周期内必须有两个已知点、因此对FID信号数字化采样时,也必须在某一周期内采集到至少两个点(Nyquist Theorem)、假如不如此就会产生峰折返、不产生峰折返所能达到的最大频率叫Nyquist Frequency、实际采样中,检测参照频率旋转坐标系频率发射中心频率,因此采样频率至少应大于离发射中心最远的峰的相对频率的两倍FID信号的正交检测VtVtxFT0-ww由于NMR检测器不能区分检测出顺时针(快)或反时针(慢)方向的核磁信号,傅立叶转换后,将给出+w w 和 w w两个峰、(与旋转坐标系的旋转频率相比)FID信号的正交检测Channel BChannel AChannel A+B假如用两个相位差90的检测器同时检测,就能区分快、慢信号FID信号的正交检测NMR SignalReference(SFO1)90o0oADCABRealImaginary数学处理实际应用中,并非使用两个检测器,而是使用一个检测器、将检测到的信号分成两部分并分别送到具有900相位差的两个通道中、FID信号的正交检测NMR 谱仪FMAudio反馈600谱仪磁体探头计算机与操作者NMR 谱仪600 MHz磁体探头机柜RF 产生RF 放大信号检测数据采集控制 数据信息交流运行控制磁体控制前置放大器计算机数据储存;数据处理;总体控制、NMR 谱仪:机柜AQX(Digital)CCUTCUFCURCUVT unitBSMSshimlockCCUAQRASURouterACBADCRX22AmplifierAmplifierPTS核磁共振静磁场超导磁体核磁共振:探头与前置放大器NMR:前置放大器(preamplifier)前置放大器有两种用途:1、放大检测的NMR信号(从微伏到毫伏)2、分离高能RF脉冲与低能 NMR信号、前置放大器含有一接收发射开关(T/R)、其作用就是阻止高压RF脉冲进入敏感的低压的信号接收器、从功放来的RF 脉冲去接收器的信号NMR 谱仪:探头RF 接口RF 线圈+调谐元件(电容器)HelmholtzSolenoid核磁共振:探头、量规和样品管液体NMRNMR实验操作培训(二)样品的制备标准参数与脉冲序列脉冲的定义和描述(形状、脉宽、功率、频率、相位)9090脉冲的种类和测试1313C CDEPT135DEPT135、DEPT90DEPT90谱的测定其它核(1717O O)的测试射频脉冲的产生及脉宽的测定频率合成器Sythesizer频率控制单元FCU时间控制单元TCU频辐设置单元ASU功放Amplifier(BLAH,BLAX)到探头电脑指令射频脉冲的产生及脉宽的测定脉冲翻转角(pulse flip angle)的大小不仅与脉冲的作用时间tp有关,还与射频场强B1有关。分别改变二者都能够改变角的大小。B1tp用频率表示射频场强度:(假设180脉冲为15、5us)NMR:90脉冲的测定采样通道(直截了当)其它通道(间接)NMR:常用的90脉冲采样通道:1H 9、7us/-4dB(硬脉冲)35us/7、15dB (TOCSY实验)110us/17、9dB (ROESY实验)13C 7、1us/-2dB(硬脉冲)其它通道:1H 9、8us/-4dB(硬脉冲)80us/14dB (CPD宽带去偶)13C 7、0us/-2dB (硬脉冲)70us/18dB (CPD宽带去偶)上述数值是在华师大的宽带正相(BBO)探头上测得的NMR:90脉冲的功率(射频场强)90脉冲的数值(脉宽)总是在一定的脉冲功率或脉冲强度下测定的,即脉宽和脉冲功率是一一对应的。仪器上脉冲功率是用功率的衰减dB数表示的,实际输出功率与最大输出功率相比,Attenuation(dB)=-20 log(V/Vmax),(衰减6dB,功率减小一半,脉宽增加一倍),为了在不同仪器之间进行比较的方便,通常将脉冲功率转换成脉冲射频场强度,以Hz表示:B1tp当共振时,磁化矢量在脉冲射频场下围绕B1旋转角90脉冲与射频场强度直截了当关联(一一对应)脉冲射频场功率的运用受到探头的限制NMR:90脉冲的功率(射频场强)脉冲 的功率太强或在强功率下作用时间太长将损坏探头:NMR:探头的调谐和阻抗匹配调谐tune:调节探头电路使得该电路对某一频率最灵敏 谐振阻抗匹配matching:调节探头电路使得探头线圈电路的 阻抗与发射脉冲功率的阻抗(50欧 姆)相同以接受全部功率保证用标准样品测得的90脉冲数值具有通用性NMR:探头的调谐和阻抗匹配NMR:脉冲的相位上述两个脉冲都是在X轴方向作用,180脉冲在X方向如何？在Y轴方向？脉冲在不同的方向(相位)上发射,对磁化矢量的作用不同NMR:锁场与匀场NMR的高分辨率要求静磁场有特别高的稳定性:500兆仪器:假设谱峰的峰宽:假如有10%的误差(即0、1Hz),多大的静磁场变化能引起这种变化？NMR:锁场与匀场锁场是解决磁场强度随时间变化的问题静磁场的强度会由于硬件的老化和周围环境的变化而变化,仪器上通过不间断地测量一参照信号(氘代溶剂的共振信号)并与标准频率进行比较、假如出现偏差,则此差值被反馈到磁体并通过增加或减少辅助线圈(Z0)的电流来进行矫正、2DLockTXLockRXLockfreq.Z0-coilNMR:锁场与匀场由超导线圈产生的静磁场在样品圆柱体体积内的分布是不均匀的,整个样品体积内的磁化率不同也会造成磁场的不均匀。仪器上通过在样品周围安装多个不同位置的线圈,通过改变线圈中电流的大小与方向,用这些线圈产生的附加磁场的大小来补偿超导线圈磁场的不均匀。匀场是解决静磁场随空间位置变化的问题 Z+Z2-Z2+Z4-Z4 Z3 Z5 NMR:锁场与匀场x,y,zz,z2x,y,xy,xz,yz,x2y2z,z2,z3x,y,xy,xz,yz,x2y2,xz2,yz2,x2y2z,xyzz,z2,z3,z4x,y,xy,xz,yz,x2y2,xz2,yz2,x2y2z,xyz,x3y3,x2y2z2z,z2,z3,z4,z5,z6SpinningNon-spinningNMR:锁场与匀场0.11%0.55%50%0.11%0.55%旋转边带样品旋转只是将X、Y方向上的不均匀平均而已,并非真正消除,因此会有旋转边带产生,旋转边带与主峰的频率差与样品旋转的速率(Hz)相同。旋转边带峰越高说明X、Y方向上越不均匀。磁场均匀的指标:线型样品不旋转样品旋转NMR:测试温度的控制与校正温度范围受到探头的限制温度范围受到溶剂冰、沸点的限制样品实际温度和仪表显示温度之间需要校正NMR实验的基本步骤样品制备:在量规中确定高度仪器检察:空压机、仪器、磁体内是否有样品？按eject或lift钮,用空气将样品管送人磁体用edte命令设置实验温度用lock命令,依照氘代溶剂进行锁场Z、X、Y方向上匀场edasp命令设置仪器射频通道参数用eda命令设置与样品有关的参数用ased命令设置与脉冲序列有关的参数对探头进行tuning和matching的调节打zg命令开始采样:注意接收机增益RG的设置是否合适？NMR实验的采样参数与样品有关的主要采样参数 采样谱宽:SW 发射中心频率:O1、O1P 累加次数 NS 空采次数:DS 采样数据点:TD 接收增益:RG与脉冲序列有关的参数 脉冲的作用时间:P0-P31 脉冲的功率:PL0-PL31 脉冲间的时间间隔:D0-D31 CNST0-CNST31 其它形状的脉冲:SP0-SP31 梯度场脉冲:GP0-GP31 组合脉冲去偶的方式和脉宽:CPDPRG1-8 PCPD0-9 变量参数:VCLIST、VDLIST、VPLISTNMR实验的数据处理谱图的数据点:充零(zero filling)和线性预测(liner prediction)窗函数处理:FID信号的自然衰减,信噪比或分辨率的加强傅立叶变换(Fourier Transformation)谱图上谱峰的相位校正:零级和一级相位校正参数谱图的基线校正:全谱或分段的校正化学位移(ppm)的定标:标准谱峰面积的积分:核磁共振的定量信息作图参数的选择作图或将谱图作为图形文件保存NMR:样品的制备氘代溶剂的选择:溶解度(13C)、费用、质量样品的测试温度:溶剂的冰、沸点,粘度样品的均匀性:是否悬浮液、乳浊液？样品的体积:样品溶液在5mm样品管的高度与匀场难易 有关核磁管的质量:匀场难易,旋转边带化学位移定标物:TMS,溶剂峰数据处理-充零、线性预测由于正交检测的关系,通常SI=TD/2,TD:FID数据点 SI:图谱的数据点FT变换需要的数据点是2n,程序会自动依照TD的数值充零至最近的2n点充零的目的是为了更准确地描述谱峰,并不能使谱峰变窄。只能提高数字分辨率。充零的点数:SI-TD/2数据处理-充零、线性预测充零只是增加数值为零的数据点,而线性预测增加的数据点是有数值的,是依照前后点的数据变化计算出的,模拟出后面FID变化的数据点。与线性预测有关的参数:MEmod,LPBIN,NCOEFSITD/2LPBINFID数据点MEmod:预测的方式(实数、复数、向前、向后)NCOEF:模拟计算时所用的系数个数。数据处理-窗函数处理消除截尾效应(truncation)提高谱图的信噪比(灵敏度)或分辨率数据处理-窗函数处理指数函数:exp(-LBt)LB:衰减常数,一般选择 谱峰的半高宽值Gaussian函数:LB:通常取谱峰的半高宽(负值)GB:函数的最大值所在位置(0-1)sine、sine平方函数:液体NMRNMR实验操作培训(三)二维NMR的基本概念同核(1H-1H)二维谱的基本特征及表示方法一维1H谱与二维谱的关系1H-1H COSY实验的参数设置及提供的结构信息1H-1H TOCSY实验的参数设置及提供的结构信息1H-1H NOESY实验的参数设置及提供的结构信息同核(1H-1H)二维谱的数据处理相敏二维谱及其谱峰的相位校正同核(homonuclear)二维谱1H-1H COSY,NOESY,TOCSY二维核磁共振-2D NMRt1t2增加t1在逐渐增加T1值测得的一系列FID中,每个数据点的相位和幅度都在变化,(与T2时间内测得的一条FID中类似),即在一个FID数据信号的方阵中,受到了两个时间变量的调制t1,t2。二维谱的采样方式Preparation和mixing是由一个或几个脉冲组成,evolution和detection是一段时间在一系列不同的t t1 1值,0,1,0,1,2,2,3 3,测得一系列FIDFID,傅立叶转换后得到的一系列谱图,其幅度或相位随t1t1变化(受t t1 1调制)。一系列谱的数据点在t t1 1方向上也形成了类似FIDFID的干涉图(interferogramsinterferograms),也可进行FTFT变化,得到谱图,但不是直截了当采样得到的,而是数据处理形成的。因此t t2 2对应的是直截了当采样维,t t1 1则是间接采样维,同样能够进行充零和窗函数处理。同核二维谱的外观一维谱:强度随单个频率的变化 I(F)二维谱:强度随两个频率的变化 I(F1,F2),每个峰的位置有两个频率座标确定,峰的高度则有等高线图的圈数表示。同核二维谱上有两种峰:对角线峰(diagonal peak)相关(交叉)峰(cross peak)是否能表现出偶合裂分取决于实验的类型和数字分辨率对角线峰相当于一维谱,相关峰则表示两个相互交叉峰的核之间有着某种关系,在对角线峰两边对称出现。具体相关内容取决于实验的种类二维谱是反映原子核间某种关系的谱,画二维谱时,通常将对应的一维谱画在上面或边上,以便于谱峰的指认。1020304050601020304050601020304050602040600.511.52二维谱的谱峰解释a:信号T1内以20Hz频率演化,混合期内以某种方式转移至另一信号,在T2内以80Hz演化。b:信号T1时间内以20Hz演化,混合期内没有影响,T2时间内接着以20Hz的频率演化C:信号T1时间内以20Hz演化,混合期内部份信号转移至另一信号,在T2中以80Hz演化,其余部份则不受影响,T2期间接着以80Hz演化混合期是二维谱的关键:信号从一种核自旋转移至另一核自旋同核二维谱的采样参数设置edc:建立新的数据目录edasp:设立与仪器频率通道有关的参数ased:设置与脉冲序列有关的参数 Px Dxeda:设置与样品有关的采样参数 F2:SW,O1,TD,NS,DS,RG F1:SW?O1?TD?NS,DS,RG?FnMODE别忘了调节探头的tuning和matching,二维谱实验都要求是准确的90或180脉冲zg:开始采样COSY1H 1H COSY1H-1H COSY谱中的相关峰表示与该峰相交的两个峰之间有自旋自旋偶合(JCoupling)存在。通常在化学结构上,两个峰之间有自旋自旋偶合表示产生该两个峰的原子之间相隔的化学键数在三键以下。(当它们之间有双键或三键存在时,四键或五键之间的原子也会有J偶合存在)相关峰的强弱(高低)与偶合常数J值的大小有关,J值越大相关峰越强 有没有相关峰,只取决于有没有J偶合,并不在乎相隔的化学键多少。当偶合常数(J值)特别小时,一维谱上估计表现不出峰的偶合裂分,但二维谱上仍估计表现出相关峰1H1H COSY的种类绝对值与相敏(phase sensitive)的COSY 绝对值COSY的峰都为正峰,相敏COSY的峰有正负(可调相位)。相敏COSY中的峰比绝对值COSY的峰更尖锐(可减小谱峰的重叠程度,但需要增加累加的数据点)。多量子滤波(MQF)COSY 双量子滤波DQFCOSY:滤掉(减小)单量子峰(对角线峰和没有 偶合的溶剂峰)。叁量子滤波TQFCOSY:滤掉(减小)单量子和双量子峰 二者是能够互相结合的,如:DQFCOSY能够是绝对值的也能够是相敏的相敏 DQF-COSY3J=8、00HzTOCSY1H1H TOCSY两个(组)氢原子只要是在一个自旋体系中,不管是有直截了当偶合或是间接偶合,它们之间都会有相关峰出现。自旋体系是由多个原子核组成的体系,体系中任一原子核至少与本体系中另一原子核有J偶合,而体系中所有原子核都不与体系外的原子核有J偶合 一个自旋体系中,原子核之间有J偶合存在,称为直截了当偶合,没有J偶合的,称为间接偶合1 1HH1 1H COSYH COSY1 12 23 34 41 12 2 3 34 41-22-33-42D 1H-1H TOCSY,混合时间5050ms1 12 23 34 41 12 2 3 34 41-22-33-41-32-41-4TOCSYABX abyAaB,bX?y?COSYAaB,byXTOCSYNOESY1H 1H NOESY NOESY谱中的相关峰表示产生该两个峰的氢原子间空间距离近(5A？！)小分子的NOE相关峰与对角线峰的相位相反,大分子的NOE相关峰与对角线峰相位相同,分子量在10001500左右时不出峰(与仪器磁场强度有关)有化学交换的峰之间也会产生NOE相关峰,其相位与对角线峰相同相关峰的强弱与氢原子间距离的106呈正比,距离越近,相关峰越强相关峰的强弱与脉冲序列中的混合时间(mixing time)有关,通常混合时间等于T1时,NOE峰最强液体NMRNMR实验操作培训(四)异核1H-13C二维谱的基本特征异核1H-13C二维谱的采样参数设置异核1H-13C HSQC(HMQC)实验异核1H-13C HMBC实验其它核的测试梯度场脉冲及其溶剂峰压制实验异核(heteronuclear)二维谱1H-13C HSQC(HMQC),HMBC异核(1H-13C)二维谱与同核(1H-1H)二维谱的差别:1.一维是1H的共振频率,另一维是13C的共振频率。没有对角线峰。2.由于该实验涉及两种核,需要两个频率通道,两个发射中心频率,两个谱宽。采样参数的设置:先分别测试一维的1H和13C谱,用界面上的SW-SFO1按钮确定它们出峰的范围(谱宽)和对应的中心频率(O1)为什么不用一维谱的谱宽？用edc命令建立新的数据目录名(读出标准参数或从已有的数据目录上建立)用edasp命令设置通道参数(1H为采样核)用eda命令分别设置F2和F1维的采样参数:PULPROG,TD,SW,O1,O2,NS,DS,RG,FnMODE用ased命令设置与脉冲序列有关的参数Tuning,matching(先13C,后1H),用zg命令采样1H 13C HSQC 碳氢直截了当相关实验 1H-13C HSQC 实验是异核二维谱,没有对角线峰。每个相关峰表示相交的氢、碳峰所对应的氢、碳原子是直截了当(一键)相连的。HSQC实验能够使氢谱和碳谱中的谱峰指认信息相互利用、相互印证。当CH2上两个氢的化学位移不等时,HSQC谱上,一个碳峰就会与两个氢峰有相关峰。HSQC1H-13C HMBC氢碳远程相关实验 HMBC是异核二维谱,没有对角线峰。每个相关峰表示相交的氢、碳峰所对应的氢碳原子是以两键、叁键或四键相连的。HMBC 谱上是否出峰与氢、碳原子相隔几键没有直截了当关系,只与实验参数设置中所设的J值有直截了当关系。氢碳两键、三键或四键的J值范围有特别大部份是重叠的。由于脉冲序列的关系,HMBC谱中有时也会出现一键偶合的峰,是以一对相隔一百多Hz的小峰出现在对应氢峰的化学位移两边。HMBC常规液体二维谱的种类1.1H-1H COSY 非相敏,相关峰表示产生这两个峰的1H核之间有J偶合 2.1H-1H NOESY 相敏,相关峰表示产生这两个峰的1H核之间的空间距离近(5)3.1H-1H TOCSY 相敏,相关峰表示产生这两个峰的1H核之间处于同一自旋体系4.1H-13C HSQC(HMQC)相敏,相关峰表示产生这两个峰的1H和13C是直截了当相连的(一键偶合)5.1H-13C HMBC 非相敏,相关峰表示产生这两个峰的1H和13C是远程相连的(二,三,四甚至五键偶合)其它核(非1H,13C)的测试该核在仪器上的共振频率,探头的接收频率范围。该核的测试灵敏度:共振频率的高低(值)天然丰度的大小 核自旋量子数I标准化合物(化学位移定标、仪器测试)化学位移值的范围及样品的化学位移值该核值的正负 正:与1H的NOE为正 负:与1H的NOE为负测试前的准备1H1HNO 1H Decoupling,No NOE1H Decoupling with NOE1H Decoupling without NOE标准化合物的测试用rpar命令读出该核的测试参数(或在edsp中将该核设置为观察核)选择脉冲参数pulprog:zg zgdc zgig设置采样参数:sw(AQ-mod:DQD 或qsim)NS p1、pl1(可参考13C或其它频率相近核 的值)pcpd2、pl12、cpdprg2 o2(1H的CPD去偶参数)探头的tuning和matching:自动(atmm)手动(参考共振 频率最接近的核)zg采样,观察信号,优化o1、rg、sw、aq、td等参数样品的测试 标准样品的测试成功,说明仪器和测试条件的选择是正确的。因此,能够依照样品信号估计出现的化学位移与标准样品的差别选择谱宽sw和发射中心o1,依照样品的浓度选择累加次数ns,然后测试样品。NMR梯度场脉冲zB0uvzxyzB0uv+zGzzxy(z)=B0+z Gz=B0静止的外磁场静止的外磁场+Z方向的梯度脉冲强度为gz的梯度脉冲作用了t时间后,Z方向上不同位置的相同磁化矢量之间转过的角度(相位):NMR梯度场脉冲的回波作用5RF梯度场FID1234p/2XY14325再加上一个强度相同,方向相反的梯度脉冲,原来第一个梯度脉冲形成的角度(相位)差就会抵消而重新聚焦在一起。聚焦的条件:原子核必须在原来的位置(Z方向)。感谢您的聆听！感谢您的聆听！