生物《奥赛生化实验》课件

生物奥赛实验孙孙 静静实验内容1、pET3a-RecA质粒电泳2、牛奶中的蛋白3、酵母糖酵解实验4、滤纸崩溃法测定纤维素酶活力5、PCR实验性别鉴定6、微生物的分离技术 pET3a-RecA质粒电泳质粒电泳实验目的比较质粒载体、重组质粒电泳时的迁移速度。实验用具锥形瓶，电泳仪，电泳槽，微波炉，微量可调移液器，DNA电泳图谱观察仪实验用具实验步骤1取出0.4g琼脂糖，倒入100ml的锥形瓶中，加入50ml 1x TAE缓冲液，摇匀，用封口膜将瓶口封住，放在微波炉内，至琼脂糖完全溶解。室温冷却至60左右；问题：1、能否用蒸馏水，不用缓冲液溶 解琼脂糖？2、琼脂糖和琼脂有何区别？这里能否用琼脂代替琼脂糖？为什么？2.在水平操作台上，将胶槽放好，插入样品槽梳子，倒入60的凝胶。待凝胶冷却后，拔出样品槽梳子，将凝胶连同胶槽一起放入电泳槽。加入1x TAE缓冲液，缓冲液漫过胶块即可；问题：1、为什么手指不能触摸凝胶？2、电泳时，电泳缓冲液为什么要漫过琼脂胶面？不漫过是否可行？为什么？3.将重组质粒、质粒载体中分别各加入2ul染色液和2l加样缓冲液，将离心管放在振荡器上混均，再用20l的微量移液器分别取重组质粒20l、质粒载体20l，缓慢加入凝胶上样孔；4.加样完毕，盖上电泳槽，接好电源，调节电压至100V，开始电泳，当样品中溴酚蓝条带移动到凝胶前沿即可停止电泳；问题：DNA电泳时，DNA是向正极还是向负极泳动？为什么？5.观察电泳结果：电泳结束后，将电泳槽移至DNA图谱观察仪中，打开光源，在观察窗上观看电泳结果；6记录：将观察结果依比例划在图1中。实验结果与分析 图1.质粒电泳图谱，1为质粒载体，2为重组质粒根据质粒的电泳图谱，可以看出重组质粒在凝胶中的迁移速度 质粒载体，这是由于重组质粒中除了质粒载体，还整合有 ，所以分子量大于质粒载体，在电场中的迁移速度较 。图谱上的质粒共有3条带，分别代表质粒的3种状态，迁移最快的是状态的质粒，较 慢 的 是 的 质 粒，最 慢 的 是 质 粒 。图1.质粒电泳图谱，1为质粒载体，2为重组质粒图1是质粒的电泳图谱，可以看出重组质粒在凝胶中的迁移速度慢于质粒载体，这是由于重组质粒中除了质粒载体，还整合有外源片段，所以分子量大于质粒载体，在电场中的迁移速度较慢。图谱上的质粒共有3条带，分别代表质粒的3种状态，迁移最快的是超螺旋状态的质粒，较慢的是线性的质粒，最慢的是质粒开环。1DNA电泳时，DNA是向正极还是向负极泳动？为什么？答：正极。因为DNA是由脱氧核糖核苷酸通过磷酸酯键连接而成.DNA所带的电荷是由磷酸根带负电引起的,所以应该向正极移动.2为什么手指不能触摸凝胶？答：因为手指上的汗液含有蛋白、脂类等成份。这些成份会影响各样品槽中样品DNA的移动速度，从而严重影响凝胶条带的观察效果。3能否用蒸馏水，不用缓冲液溶解琼脂糖？答：蒸馏水溶解形成的凝胶,无法通过电流,不能使泳带分开和移动。4琼脂糖和琼脂有何区别？这里能否用琼脂代替琼脂糖？为什么？答：琼脂由琼脂糖（Agarose）和琼脂果胶（Agaropectin）两部分组成，琼脂糖是不含硫酸酯的非离子型多糖，是形成凝胶的组分，而琼脂果胶是非凝胶部分，是带有硫酸酯、葡萄糖醛酸和丙酮酸醛的复杂多糖。不能用琼脂代替琼脂糖，琼脂中含有的复杂多糖成分会干扰电泳结果，还会造成较亮的背景。5电泳时，电泳缓冲液为什么要漫过琼脂胶面？不漫过是否可行？为什么？答：电泳缓冲液漫过凝胶胶面可以使胶孔中的样品受到相同的电场力，不漫过琼脂胶面不可行，这样会干扰电泳结果。牛奶中的蛋白牛奶中的蛋白实验目的了解三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的特点，以及牛奶蛋白质等电点的测定实验步骤实验 1取两支试管（1）和（2），各加入2ml奶粉溶液，在（1）号试管中再加入5滴三氯乙酸溶液，混匀后再加入0.5ml蛋白酶液，这一试管作为对照。在（2）号试管中，加入0.5ml蛋白酶液，震荡均匀后两试管静置30分钟。问题：1、胰蛋白酶水解蛋白的产物是氨基酸，还是多肽？是内切酶还是外切酶？在胰脏中是否有胰蛋白酶活性？2、三氯乙酸在这里起什么作用？2.30分钟后，再向（2）号管中加入5滴三氯乙酸溶液，混匀，再静置10分钟。3.分别吸取（1）和（2）号管中的上清液1ml 4000r/min离心5min，取上清0.5ml分别加入两个试管中。4.各加入3滴双缩脲试剂，观察并记录颜色变化，将实验结果填入表1。问题：双缩脲试剂与上述清液反应后变色，双缩脲试剂测定的是什么？生成的产物是什么物质？实验步骤实验1.在一个50ml三角瓶中加入5ml奶粉溶液，向奶粉溶液中加入4ml盐酸溶液，混合均匀后静置30秒观察记录现象，测定pH。2.在上述溶液中再加入4ml盐酸溶液，振荡均匀，静置30秒观察并记录现象，测定pH。3.在上述溶液中再加入2ml氢氧化钠溶液，振荡均匀，静置30秒观察并记录现象，测定pH。4.在上述溶液中再加入2ml氢氧化钠溶液，振荡均匀，静置30秒观察并记录现象，测定pH，将实验结果填入表2。实验结果与分析 表1 加入双缩脲试剂前后颜色变化 2 1实验结果与分析 管号管号加入前加入前加入后加入后对照对照（1 1）号）号样品样品（2 2）号）号实验 表1 加入双缩脲试剂前后颜色变化无色透明无色透明淡蓝色 紫色 实验结果与分析 实验实验：如图：如图1 1所示，牛奶中的蛋白经过三氯所示，牛奶中的蛋白经过三氯乙酸沉淀后乙酸沉淀后,加入胰蛋白酶所得到的上清液中加入胰蛋白酶所得到的上清液中蛋白蛋白(包括胰蛋白酶包括胰蛋白酶),上清液中多肽或上清液中多肽或蛋白含量蛋白含量 ,从而有弱的颜色反应变化；从而有弱的颜色反应变化；牛奶中蛋白先与胰蛋白酶反应，得到牛奶中蛋白先与胰蛋白酶反应，得到 ，再加入三氯乙酸沉淀蛋白后，取其上清液，再加入三氯乙酸沉淀蛋白后，取其上清液与双缩脲试剂反应，呈显与双缩脲试剂反应，呈显 ，颜色变化，颜色变化明显，说明上清液中含有明显，说明上清液中含有 ，三氯乙酸，三氯乙酸能够沉淀能够沉淀 但不沉淀但不沉淀 。变性沉淀变性沉淀很少很少多肽多肽紫色紫色多肽多肽蛋白蛋白多肽多肽处处 理理现现 象象pHpH值值第一次加酸第一次加酸无明显变化无明显变化第二次加酸第二次加酸明显有沉淀明显有沉淀第一次加碱第一次加碱沉淀完全溶解沉淀完全溶解第二次加碱第二次加碱无明显变化无明显变化实验实验 表表2 蛋白溶液酸碱变化的现象观察蛋白溶液酸碱变化的现象观察6.05.06.07.0可以看出牛奶在可以看出牛奶在pH5.0时发生时发生 ，改变溶，改变溶液的液的 ，沉淀能够重新溶解，说明牛奶中，沉淀能够重新溶解，说明牛奶中主要的蛋白的等电点在主要的蛋白的等电点在pH5.0左右。左右。沉淀沉淀pH值值问题：问题：1 1、牛奶中主要蛋白是什么蛋白、牛奶中主要蛋白是什么蛋白？2 2、什么方法可测定蛋白质的等电点？什么方法可测定蛋白质的等电点？酵母糖酵解实验酵母糖酵解实验实验目的了解酵母糖酵解的反应原理以及还原糖的特性。实验步骤1将两份0.25g Ba（OH）2分别转移至两100ml三角瓶中，各加入10ml蒸馏水，配制Ba（OH）2溶液，再用一次性手套将瓶口封住，分别标记为实验和对照。2.再将0.285g的草酸转移至另外的100ml三角瓶中，加入100ml蒸馏水，配制草酸溶液。3.将0.28g葡萄糖倒入50mL烧杯中，加入10ml蒸馏水溶解，制成葡萄糖溶液。4.取5mL葡萄糖溶液倒入酵母反应管中。再将0.25g的干酵母粉倒入酵母反应管中与葡萄糖溶液混匀，将酵母反应管放入装有Ba（OH）2的三角瓶中，封好三角瓶，在恒温培养箱中32静置反应。另一三角瓶不加酵母反应瓶，作为空白对照。问题：你知道食用酵母是用什么培养出来的吗？反应1小时后，从三角瓶中取出酵母反应管，再将三角瓶口封好。问题：1、释放的CO2来自什么物质？2、有氧存在时能进行糖酵解吗？取两支试管，各加入糖试剂2ml，将酵母反应管中的悬液取出1.5ml，加入离心管中4000转/分离心4分钟，将上清液0.5ml加到一支装有糖试剂的试管中，同时取葡萄糖溶液0.5ml加到另一含有糖试剂的试管中为对照，在试管上标记清楚。80水浴中加热3分钟，观察颜色变化。问题：1、本实验能否用蔗糖代替葡萄糖？2、我们食用的蔗糖都来自什么植物的什么部分？将草酸溶液加到酸性滴定管中，两个三角瓶在滴定前各加入1滴酚酞指示剂，在摇动中不停地滴入草酸溶液，直到三角瓶中溶液的红色褪去，计算酵母糖酵解瓶滴入的草酸溶液的毫升数(V1)。问题：指示剂除指示酸碱变化外，还有什么样的指示剂？以未进行糖酵解反应的、内含10ml饱和Ba(OH)2溶液的三角瓶为对照，计算没有吸收CO2时滴入的草酸溶液的毫升数(V0)，V0-V1即为糖酵解时释放出的CO2毫克数(1毫升草酸溶液相当于1毫克CO2)。实验结果与分析 样品样品滴定用草酸量滴定用草酸量生成生成CO2量量实验（V1）20mL对照（V0）30mL滴定结果：滴定结果：V0-V1=10mg实验结果与分析 1糖试剂对照；2对照组；3实验组 1 2 3滴定结果：滴定结果：滤纸崩溃法测定纤维素酶活力滤纸崩溃法测定纤维素酶活力 实验原理滤纸是由纤维素构成的，纤维素是由-葡萄糖分子以1，4糖苷键连接而成。纤维素酶广泛存在于微生物中，特别是真菌微生物。纤维素酶可水解-1，4糖苷键，从而使纤维素组成的纤维断裂，但一定酶浓度下的作用速度与温度和pH有关。滤纸片在加入纤维素酶溶液后自滤纸边缘逐渐破坏，最后全部崩解。酶活力可用每毫升酶液使1平方厘米纸完全消失所用时间（分钟）的倒数来表示。实验步骤1.取50毫升三角瓶四支，标上记号，号瓶中加入1毫升缓冲液（pH4.6）和1毫升水，再加入0.5毫升水；号瓶中加入1毫升缓冲液（pH8.0）和1毫升水，再加入0.5毫升水；号瓶中加入1毫升缓冲液（pH4.6）和1毫升水，再加入0.5毫升酶 液；号 瓶 中 加 入 1毫 升 缓 冲 液（pH8.0）和1毫升水，再加入0.5毫升酶液。在室温下，向三角瓶中各加入1平方厘米滤纸1片浸到溶液中，并开始计时，手动振荡，观察并记录滤纸完全崩溃所用的时间，计算酶活力。实验结果（60分钟）号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶80分钟 号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶号瓶 1.在pH4.6时，还是pH8.0时纤维素酶的活性最高？2.估计在30时，还是45时酶的活力高？答：在45时此酶的活力高于30。温度对酶的反应速度有很大影响，动物组织中的酶最适温度在35到40之间，而植物中的酶在40至50之间。3.酶存放在4，还是45下能保持较长时间不失活？4.木材造纸时，用碱（NaOH）水解并去除木质素和半纤维素，为什么不用酸水解呢？5.好的纸张长久保存仍为白色，而报纸为什么时间长了变黄色呢？答：因此报纸在制造过程中，没有完全除去木质素，木质素是酚类聚合物，可被氧化成醌，而变黄。PCR性别鉴定性别鉴定实验目的通过PCR技术鉴定人类性别，DYZ1基因是Y染色体长臂异染色区的特异重复序列，是男性特有的基因。实验步骤1、分别拔取甲、乙、丙、丁4个人的3根带有毛囊的头发，然后剪下毛囊，放进0.5mL离心管中，做好标记2、在加有毛囊的0.5mL离心管中分别加入下列 成 份 ：ddH2O13L、10Xbuffer2L、MgCl22L、dNTP mixture0.8L、引物1L、引物1L、Taq DNA聚合酶（5u/L）0.2L总体积20L3 3、设定反应程序：、设定反应程序：预变性：94200s变性：9430s退火：5220s延伸：7230s保温：72200s循环次数25次4、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳实验结果与分析 图1 M：D2000 marker；1：甲扩增结果；2：乙扩增结果；3：丙扩增结果；4：丁扩增结果；微生物的分离技术微生物的分离技术实验目的从一群微生物中分离出一种或一类微生物实验步骤稀释涂布实验步骤划线分离连续划线法 交叉划线法p经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量pStudyConstantly,AndYouWillKnowEverything.TheMoreYouKnow,TheMorePowerfulYouWillBe写在最后感谢聆听不足之处请大家批评指导Please Criticize And Guide The Shortcomings结束语讲师：XXXXXX XX年XX月XX日