耐药结核病诊断新技术课件

耐药结核病诊断新技术耐药结核病诊断新技术1全球范围内结核病疫情严重 患病率高:新发患者1040万/年,其中有120万(11%)HIV患者;死亡率高:每年死亡人数达140万(13、46%),HIV/TB:死亡人数40万(33、33%);耐药率高:48万新发的MDR-TB病例和10万耐利福平结核病(RR-TB)病例;接受MDR检测、报告和治疗的MDR-TB不足1/3,接受治疗的MDR-TB治愈成功率只有50%全球结核病报告全球范围内结核病疫情严重全球结核病报告2耐药结核病诊断新技术课件32015年全球估计MDR-TB患者数2015年全球估计MDR-TB患者数4结核病快速及时诊断是结核病防控重要因素结核病快速及时诊断是结核病防控重要因素5灵敏准确操作简便检测时间短闭管检测检测位点全面对新型耐药检测技术的要求灵敏准确操作简便检测时间短闭管检测检测位点全面对新型耐药检测6耐药结核病诊断新技术课件7基因芯片技术基因芯片技术8结核病耐药与基因64-68%rpsL基因突变70%embB基因突变70%65%耐药基因93%95%95%rpoB基因突变利福平异烟肼50-70%katG基因突变5-10%inhA基因突变6-13%ahpC基因启动子区域突变链霉素乙胺丁醇 多数研究报告提示:耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸突变(表现增加、缺失、替代),造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列,影响药物与靶位酶结合产生耐药结核病耐药与基因64-68%rps L 基因突变70%e9基因芯片(原理)激光共焦扫描仪软件判读样品制备仪杂交仪 基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药性相关的rpoB/katG/inhArpoB/katG/inhA的基因位点发生突变,通过PCRPCR扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描,检测荧光信号的有无,判断特定位点的突变情况和结核菌耐药性。基因芯片仪和试剂获国家SFDA和欧盟CE认证10基因芯片(原理)激光共焦扫描仪软件判读样品制备仪杂交仪 10基因芯片法基因芯片法11耐药结核病诊断新技术课件12利福平的耐药位点利福平的耐药位点13MSM耻垢分枝杆菌MTC结核分枝杆菌复合群MTR次要分枝杆菌MIN胞内分枝杆菌MAV鸟分枝杆菌MGA胃分枝杆菌MKA堪萨斯分枝杆菌MSC瘰疠分枝杆菌MUA母牛分枝杆菌MCH龟分枝杆菌龟亚种MAB龟分枝杆菌脓肿亚种MSZ苏尔加分枝杆菌MMA海/溃疡分枝杆菌MXE蟾蜍分枝杆菌MDI迪氏分枝杆菌MFO偶发/猪分枝杆菌MGI浅黄分枝杆菌MSI猿猴分枝杆菌MTE土分枝杆菌MPH草分枝杆菌CC质控点MNO不产色分枝杆菌MGO戈登分枝杆菌同时鉴定MTC与21种NTMMSM耻垢分枝杆菌 MTC结核分枝杆菌复合群MTR次要分枝杆14非结核分枝杆菌非结核分枝杆菌15在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。16结核病和非结核的诊断结核病和非结核的诊断17特 点标本:菌株、涂阳痰标本 时间:约8 8小时优点:高通量灵敏度、特异度高特 点标本:菌株、涂阳痰标本 18国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片能够用于:可疑耐药结核病患者筛查,它有望代替利福平和异烟肼的传统药敏试验推荐理由:在我国获得注册证书;国内研究显示其敏感性和特异性较好;民族品牌数据显示在我国具有可行性,符合成本效果;估计使用层级:地市和省级(医疗机构和疾病预防机构)国家结核病参比实验室推荐建议基因芯片能够用于:推荐理由:估19探针熔解曲线技术探针熔解曲线技术20工作原理 在一定环境下,DNA双链在其长度和序列一定时,Tm值也一定,当发生错配时,Tm值下降,下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。Tm工作原理 在一定环境下,DNA双链在其长度和序列一定时,T21v96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区域内利福平耐药突变检测体系示意图依照靶序列熔点的变化,检测rpoB基因 是否含有突变,获得利福平耐药信息96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区22依照不同的Tm值能够判断出ropB估计不同的碱基发生突变依照不同的Tm值能够判断出ropB估计不同的碱基发生突变23耐药结核病诊断新技术课件24依照不同的Tm值能够判断出ropB估计不同的碱基发生突变依照不同的Tm值能够判断出ropB估计不同的碱基发生突变25异烟肼耐药突变检测体系示意图通过检测 katG315、inhA 启动子和、ahpC 启动子区、inhA94、密码子的突变与否确定样品对异烟肼的耐药性。异烟肼耐药突变检测体系示意图通过检测 katG315、inh26依照不同的Tm值能够判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变依照不同的Tm值能够判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变27依照不同的Tm值能够判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变依照不同的Tm值能够判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变28乙胺丁醇链霉素氟喹诺酮每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的熔点,软件能够自动地给出突变类型,即使发生不均一突变的情况,也能够分辨出来、乙胺丁醇链霉素氟喹诺酮每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的29步骤二加入1-96个提取样本到检测管中步骤三集成多重PCR和结果自动报告步骤一自动提取1-24份样本操作流程总耗时约3小时,手工操作时间约15分钟步骤二步骤三步骤一操作流程总耗时约3小时,手工操作时间约1530(一)DNA提取40 min高质量的样本DNA 样本类型:痰液、灌洗液、培养菌株快速高效,1小时内完成24份样本提取;灵活可控,单次运行可处理124 份样本;高度均一,整个提取过程均由仪器自动完成,保证了提取样本的均一性。(一)DNA提取40 min高质量的样本DNA 31(二)加入PCR反应管(二)加入PCR反应管32(三)PCR过程和自动判读菌种Tm/FAMHEXROXCy5耻垢分枝杆菌83、0/73、0,80、0/牛分枝杆菌62、5,75、5/73、0,80、0/瘰疬分枝杆菌69、5/73、0,80、0/结核分枝杆菌62、5/73、0,80、0/龟分枝杆菌55、5/73、0,80、0/猿猴分枝杆菌/81、073、0,80、0/嗜血分枝杆菌/76、073、0,80、0/戈登分枝杆菌/71、073、0,80、0/堪萨斯分枝杆菌/66、573、0,80、0/脓肿分枝杆菌/58、073、0,80、0/偶然分枝杆菌/65、5,73、0,80、0/海/溃疡分枝杆菌/59、5,73、0,80、0/土地分枝杆菌/55、5,73、0,80、0/不产色分枝杆菌/50、5,73、0,80、0/苏加分枝杆菌/73、0,80、082、0马儿摩分枝杆菌/73、0,80、076、5蟾蜍分枝杆菌/73、0,80、071、5胞内分枝杆菌/73、0,80、065、5鸟分枝杆菌/73、0,80、060、0分枝杆菌属/73、0/内控/80、0/(三)PCR过程和自动判读菌种Tm/FAMHEXROX33感感谢您的聆听！您的聆听！感谢您的聆听！34